免疫细胞分离及NK活性测定
免疫细胞功能的测定(精)
B细胞产生抗体能力的测定
丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定
应用实践
1. 用于确定B细胞活化和分化的信号转导机制，以 及细胞因子和其它银子对B细胞分化的影响。 2. 因为B2细胞产生抗原需要T细胞辅助，所以又可 以用于检测T细胞的辅助功能。 3. 临床上用于研究免疫缺陷病和自身免疫病患者B 细胞分化异常的机制。
B细胞产生抗体能力的测定
丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定
基础理论
人B细胞具有PWM受体，在体外受到PWM刺激 时，发生多克隆激活，产生多克隆抗体。B细胞 产生抗体的能力可以用ELISA测定培养上清中抗 体的量估计，也可以用ELISPOT方法测定产生抗 体的B细胞数量估计。
B细胞产生抗体能力的测定
B细胞产生抗体能力的测定
基础理论
B细胞受到多克隆激活剂或特异性抗原刺激后， 活化、增殖，最后分化成为浆细胞，产生抗体。 抗体可以在血浆和其他体液中检出，检测抗体是 测定B细胞功能的最重要的方法。 B细胞分类：B1细胞和B2细胞。两者发生学不同、 接受刺激的抗原不同，对T细胞的依赖性不同。 由于B2细胞对抗原的应答依赖T细胞，所以， B细胞产生抗体能力的低下，其缺陷也可能起源 于T细胞缺陷。
B细胞产生抗体能力的测定
ELISA测定各类免疫球蛋白
基础理论
B细胞受抗原刺激后，最初产生IgM抗体，然 后在Th细胞产生的各种细胞因子的作用下，可转 类成为IgG、IgA、IgE类抗体。应用不同的单抗， 结合ELISA方法，可以测定B细胞产生的抗体的类 别。
B细胞产生抗体能力的测定
ELISA测定各类免疫球蛋白
T细胞增殖功能测定
抗原诱导的特异性增殖反应
应用实践
1. 丝裂原诱导的增殖反应 临床上用于评估T细胞对多克隆刺激剂的增殖 能力，反映T细胞基本免疫功能，即T细胞群总体 的信息，不能反映个别T细胞克隆的情况 PHA常用于测试人T细胞增殖能力，Con A常 用于测试小鼠T细胞增殖能力。
nk细胞检验标准
nk细胞检验标准NK细胞检验标准NK细胞是一种重要的免疫细胞，它能够识别并杀死病毒感染的细胞和癌细胞。
因此，检测NK细胞的数量和功能状态对于诊断和治疗某些疾病具有重要意义。
下面将介绍NK细胞检验的标准。
1. NK细胞数量检测NK细胞数量检测是通过流式细胞术或细胞计数器进行的。
正常人的NK细胞占外周血淋巴细胞的10%至15%。
如果NK细胞数量低于正常范围，可能表明免疫功能受损，需要进一步检查。
2. NK细胞功能检测NK细胞功能检测是通过测量NK细胞的杀伤活性来进行的。
常用的方法是使用靶细胞，如K562细胞，来评估NK细胞的杀伤能力。
正常人的NK细胞杀伤活性应该在10%至50%之间。
如果NK细胞杀伤活性低于正常范围，可能表明免疫功能受损，需要进一步检查。
3. NK细胞表面标志物检测NK细胞表面标志物检测是通过检测NK细胞表面的分子来评估NK 细胞的功能状态。
常用的标志物包括CD56、CD16、NKG2D等。
正常人的NK细胞应该表达这些标志物。
如果NK细胞表面标志物异常，可能表明免疫功能受损，需要进一步检查。
4. NK细胞基因检测NK细胞基因检测是通过检测与NK细胞功能相关的基因来评估NK 细胞的功能状态。
常用的基因包括KIR、NKG2A等。
正常人的NK 细胞应该表达这些基因。
如果NK细胞基因异常，可能表明免疫功能受损，需要进一步检查。
NK细胞检验是评估免疫功能的重要方法之一。
通过检测NK细胞数量、功能、表面标志物和基因等指标，可以帮助医生诊断和治疗某些疾病，如感染、肿瘤等。
因此，对于需要进行免疫功能检查的患者，建议进行NK细胞检验。
免疫学检测技术及应用
划痕法
细胞因子的检测技术
一、 生物学检测技术 二、 免疫学检测技术 三、分子生物学检测技术
依赖细胞株测定法 ELISA法
分子杂交、PCR 等检测mRNA
细胞因子检测的特点
• 样品含量低 •样品具有时效性 •生物效应特异性差
Figure 14-12
细胞因子的功能
Cell activation
／immunogold staining)
（一）免疫荧光技术(又称荧光抗体技术) 原理：用荧光素(如异硫氰酸荧光素、罗
丹明B200等) 标记抗体(荧光抗体)，用荧光 抗体浸染细胞或组织切片，抗原与荧光抗体 结合，于荧光显微镜下观察荧光，确定被检 抗原的存在。
免疫荧光技术包括：
直接法
间接法
间接补体增强法
ELISA法： 直接法 间接法 双抗体夹心法(双位点法) 竞争法
ELISA
(三) 同位素标记技术(isotope-labelling technique) 放射免疫分析(radioimmunoassay,
RIA) 是一种用放射性同位素分析抗原抗体反应 相结合方法。 优点：灵敏度高, 可检测0.001pg／mL
Direct and indirect immunofluorescence staining of membrane antigen (mAg).
（二）免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)
是将抗原抗体反应与酶催化底物的作用 相结合的一种方法。
主要有两种类型： 1.免疫酶染色 2.酶免疫测定（enzyme immunoassay, EIA）
•3H-胸腺嘧啶核苷参入法（3H-TdR）: 间接观察DNA 合成含量。灵敏度高，具有放射性。 •四甲基偶氮唑盐法（MTT）: MTT商品名为噻唑蓝。 原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将外源性 MTT还原成蓝紫色结晶-甲瓒（formazan）, DMSO使 其溶解，酶标分析仪检测。简便，灵敏度高，稳定性 差。
临床免疫学检验-第十三章细胞免疫学技术
Ficoll分离法
聚蔗糖-泛影葡胺分层液的制备
6%聚蔗糖溶液 (Ficoll溶液)密度1.020
34%泛影葡胺溶液 (Hypaque溶液)密度1.2
酸性磷酸酶测定 非特异性酶的测定
巨噬细胞功能检测
炭粒廓清试验
正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90% 炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据 此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)， 间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒 的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判 断巨噬细胞的功能。
吞噬功能检测
鸡RBC
l液 密度1.135
细胞混悬液
高速离心 密
度
6小时
梯 度
低速离心 密 度 梯 度
死细胞残片和血小板 富含单核细胞的组分
富含淋巴细胞的组分 红细胞与粒细胞组分
淋巴细胞亚群的分离
T细胞和B细胞的分离
E花环分离法 尼龙棉分离法
E花环分离法
E受体
T
SRBC
B
E花环 T
离心
B
E花环
聚蔗糖-泛影
形成溶血空斑
可以检测致敏红细胞的各种抗原所对应的抗体,临 床应用比较广泛
反向空斑形成试验
反应物: 琼脂凝胶
SPA致敏的SRBC B细胞 补体 抗Ig抗体
形成溶血空斑
体外检测人类Ig分泌细胞的方法,与抗体的特异性 无关
酶联免疫斑点法
反应物:
包被在固相载体上的抗原 B细胞 酶标二抗
加底物显色
计数斑点形成细胞
乳腺癌患者T淋巴细胞免疫功能及NK活性检测分析
乳腺癌患者T淋巴细胞免疫功能及NK活性检测分析
齐红;单征;于宏波
【期刊名称】《中国实验诊断学》
【年(卷),期】2007(011)001
【摘要】目的本实验旨在比较乳腺癌患者细胞免疫功能与正常人群的差异,以了解细胞免疫功能对肿瘤患者治疗及预后的影响.方法对35例乳腺癌患者外周血T淋巴细胞及NK活性进行检测,并测定了部分患者T淋巴细胞亚群变化,比较其与正常人群对照组的差别.结果肿瘤患者二项指标均低于正常对照组,CD3、CD4阳性细胞数减少,CD8+数增加,Th/Ts比例下降或倒置.结论肿瘤患者均存在不同程度的免疫抑制或功能缺陷.
【总页数】2页(P51-52)
【作者】齐红;单征;于宏波
【作者单位】吉林省肿瘤防治研究所,吉林,长春,130012;吉林省肿瘤防治研究所,吉林,长春,130012;吉林省中医院
【正文语种】中文
【中图分类】R73
【相关文献】
1.新辅助化疗对局部进展期乳腺癌患者T淋巴细胞亚群及NK细胞免疫功能的影响[J], 白海亚;马秀芬
2.31例乳腺癌患者外周血T淋巴细胞及NK活性检测分析 [J], 齐红;单征;刘玉侠;
王英丽;张耿月
3.新辅助化疗对局部进展期乳腺癌患者近期疗效及T淋巴细胞免疫功能的影响 [J], 卢曼曼;叶松;冯其柱;杨怀成;王琦;李怀玉
4.54例老年COPD患者红细胞免疫功能与T淋巴细胞亚群检测分析 [J], 赵湘;张锦铭
5.老年人红细胞免疫功能及T淋巴细胞亚群检测分析 [J], 王中东;黄麦华;李忠培因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
免疫系统检查项目
免疫系统检查项目第一篇：免疫系统检查项目免疫系统是人体防御外来病原体的重要系统，它的健康与否关系到人体的免疫力，免疫力高，则对疾病的抵御能力增强；反之，免疫力低，则容易受到各种疾病的侵袭。
因此，免疫系统的检查十分重要，可以帮助我们及早发现免疫不良，及早预防、治疗疾病。
1. T细胞子集检查T细胞是免疫系统的一种重要细胞，可以帮助人体识别外来的病原体，并进行攻击。
在T细胞中，CD4+和CD8+细胞是两个重要的子集，它们的相对比例可以反映人体免疫状态。
T细胞子集检查通常采用流式细胞术，可以对血液样本中的T细胞进行分离、筛选和鉴定，从而了解CD4+和CD8+细胞的相对比例、功能以及活力等方面的信息。
2. NK细胞活性检查自然杀伤（NK）细胞是一种特殊的淋巴细胞，具有强烈的杀菌、抗病毒和抗肿瘤作用，是人体免疫系统的重要组成部分。
NK细胞活性检查可以测量NK细胞的活力，判断人体免疫系统的抗病能力。
NK细胞活性检查通常采用靶细胞溶解实验或细胞流式术等方法，通过测量NK细胞对靶细胞的溶解作用来评估NK细胞活性。
3. 免疫球蛋白检查免疫球蛋白是人体免疫系统的重要成分，具有抗体形成和免疫应答等功能。
在临床上，可以通过检测血液中的不同种类免疫球蛋白的水平来评估免疫系统的功能状态。
免疫球蛋白检查可以通过血清免疫电泳、放射免疫测定和酶联免疫吸附试验等方法来进行。
4. 淋巴细胞亚群检查淋巴细胞是免疫系统的重要成分，包括B细胞、T细胞和NK细胞等，它们在免疫应答中起着不同的作用。
淋巴细胞亚群检查可以评估血液中的淋巴细胞比例和功能，反映免疫系统的整体状态。
淋巴细胞亚群检查通常采用流式细胞术和细胞荧光染色等方法，可以对不同亚群淋巴细胞进行鉴定和分离，从而评估免疫系统的功能状态。
5. 细胞因子检测细胞因子是免疫系统中的重要信号分子，可以调节细胞增殖、分化和功能，发挥抗炎、抗肿瘤等重要生物学活性。
细胞因子检测可以评估免疫系统中不同细胞因子的水平变化，反映细胞因子的稳态和免疫系统的功能状态。
nk细胞标准
nk细胞标准【NK细胞标准】一、定义自然杀伤(NK)细胞是一种具备杀伤能力的淋巴细胞，无需特异性抗原识别即可杀伤多种肿瘤细胞和感染细胞。
二、特点1. 膜表型：CD56+CD3-，无T细胞受体(TCR)。
2. 杀伤方式：NK细胞通过分泌细胞毒素(granzyme、perforin)和靶细胞表面受体的结合来实现杀伤作用。
3. 不依赖免疫记忆：NK细胞杀伤作用不需预先暴露于特定抗原，无需免疫记忆，故对新出现的肿瘤细胞和感染细胞也具有杀伤能力。
三、活化机制NK细胞的活化取决于抑制性和激活性受体的动态平衡。
当激活性受体的信号占优势时，NK细胞活化；当抑制性受体的信号占优势时，NK细胞被抑制。
这一平衡有赖于激活性受体和抑制性受体与靶细胞上的配体结合，从而决定NK细胞的活性。
四、标准化由于NK细胞具有杀伤特性，临床上可应用于免疫治疗。
为确保治疗效果的稳定性和可比性，对NK细胞的标准化十分重要。
1. NK细胞来源a. 供体：供体来源包括外周血、骨髓、胎盘和胎儿脐血等。
b. 细胞分离：采集后需通过梯度离心法或免疫磁珠法分离出单个NK细胞。
2. NK细胞培养a. 培养基：含有足够的营养物质和生长因子的培养基。
b. 杂交细胞株的辅助：杂交细胞株可作为辅助细胞提供必要的细胞因子。
3. 活化a. 细胞因子：外源性细胞因子（如白细胞介素2、白细胞介素12）可用于活化和扩增NK细胞。
b. 共刺激信号：尽可能提供足够的共刺激信号（如来源于杂交细胞的共刺激分子）。
4. 扩增a. 细胞密度：培养基中的细胞密度需适中，过低或过高都会影响细胞增殖。
b. 培养时间：培养时间应掌握在能够获得足够数量NK细胞的情况下，避免过度扩增导致细胞老化。
5. 质量控制a. 活性检测：NK细胞的活性需通过诸如CD107a脱颗粒实验、IFN-γ释放试验等进行测定。
b. 纯度检测：明确NK细胞的比例以及其他杂质细胞的数量，如CD3+ T细胞。
c. 活存检测：检测细胞的活存状态，确保细胞存活率和功能稳定。
nk细胞提取及培养方法
nk细胞提取及培养方法以nk细胞提取及培养方法为标题，本文将介绍NK细胞的提取和培养方法。
NK细胞（Natural Killer cell）是一种重要的免疫细胞，具有杀伤肿瘤细胞和感染病原体的能力。
NK细胞的提取和培养是进行相关研究和应用的前提，下面将详细介绍相关步骤。
一、NK细胞的提取方法1. 从外周血中提取：外周血中富含NK细胞，因此是提取NK细胞的常用来源。
首先，收集供体的外周血样本，并进行离心，分离出白细胞。
然后，使用比重梯度离心法，将白细胞层分离出来。
最后，使用磁珠或流式细胞术等方法，选择性地富集NK细胞。
2. 从脐带血中提取：脐带血中的NK细胞数量相对较多，因此也是提取NK细胞的常用来源。
提取方法与外周血类似，首先收集脐带血样本，并进行离心，分离出白细胞。
然后，使用比重梯度离心法，将白细胞层分离出来。
最后，使用磁珠或流式细胞术等方法，选择性地富集NK细胞。
二、NK细胞的培养方法1. 培养基的准备：选择适合NK细胞生长的培养基，如RPMI 1640培养基。
将培养基加热至37摄氏度，并加入适量的胎牛血清、抗生素和生长因子等。
2. 细胞的接种和培养：将提取到的NK细胞接种在含有培养基的培养皿中。
细胞密度一般为1-2×10^6个/ml。
将培养皿放入培养箱中，保持37摄氏度和5%二氧化碳的恒定环境。
每2-3天更换新的培养基，以保持细胞的正常生长。
3. 细胞的扩增：为了获得足够数量的NK细胞，可以进行细胞的扩增培养。
在细胞密度达到80%左右时，将细胞进行传代，即将细胞从原来的培养皿中移至新的培养皿中，继续进行培养。
每次传代时，可根据需要调整细胞的密度和培养时间。
4. 细胞的活化：为了增强NK细胞的杀伤能力，可以进行细胞的活化处理。
常用的活化方法包括使用细胞因子（如IL-2、IL-15等）刺激细胞，或使用特定的抗体与细胞表面的激活受体结合。
活化后的NK细胞可以更好地发挥其免疫功能。
三、NK细胞的质量控制1. 细胞形态观察：在培养过程中，定期观察NK细胞的形态变化，如细胞的形状、大小、颜色等。
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取对数生长期YAC- 细胞， Hanks液洗涤 取对数生长期YAC-1细胞， Hanks液洗涤2次，计数， 液洗涤2 计数， 调整至2 调整至2×105/ml。 /ml。
3、细胞毒试验： 细胞毒试验：
实验组 靶细胞 效应细胞 1640培养基 1640培养基 100µ 100µl 100µ 100µl － 靶细胞对照 效应细胞对 组 照组 100µ 100µl － 100µ 100µl － 100µ 100µl 100µ 100µl 空白组 － － 200µ 200µl
实验组OD值 - 效应细胞对照组 值 效应细胞对照组OD值 实验组 值 （1靶细胞对照组OD值 值 靶细胞对照组 ）×100%
4、孵育
二氧化碳培养箱孵育2小时； 二氧化碳培养箱孵育2小时； 加10µl MTT，继续孵育2－3小时。 10µ MTT，继续孵育2 小时。
5、测OD值 OD值
弃上清，加150µl 二甲亚砜，振荡10min，测OD值。 弃上清， 150µ 二甲亚砜，振荡10min， OD值
6、结果分析
NK细胞活性（%）= 细胞活性（ ） 细胞活性
原理： 原理：
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶使外源性黄色的MTT还原 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶使外源性黄色的MTT还原 成蓝紫色的Formazan结晶，并沉积在细胞里。 成蓝紫色的Formazan结晶，并沉积在细胞里。而死细胞 结晶 无此功能。
1、小鼠脾细胞悬液的制备： 小鼠脾细胞悬液的制备：
实验四
NK细胞活性测定（MTT比色法） NK细胞活性测定（MTT比色法 比色法） 细胞活性测定
脾脏是重要的免疫器官，内含T细胞、B细胞、NK细胞及 脾脏是重要的免疫器官，内含T细胞、 细胞、NK细胞及 巨噬细胞等多种免疫细胞。 巨噬细胞等多种免疫细胞。 NK细胞在杀伤靶细胞时既不需要特异性抗体参与， NK细胞在杀伤靶细胞时既不需要特异性抗体参与，也不 细胞在杀伤靶细胞时既不需要特异性抗体参与 需要抗原预先致敏的淋巴细胞。在抗肿瘤和抗感染免疫中 需要抗原预先致敏的淋巴细胞。 发挥重要作用。 发挥重要作用。