免疫细胞的分离和功能检测
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免疫学研究中的免疫细胞分离和纯化技术
免疫学研究中的免疫细胞分离和纯化技术免疫学研究是现代生物医学领域的一个重要分支，它研究的是人类和动物身体对各种病原微生物、异物和肿瘤细胞的防御反应。
在免疫系统中，免疫细胞是起关键作用的细胞类型。
它们能够识别和灭杀感染体和变异细胞，调节和模拟免疫反应，从而维持机体的免疫平衡。
因此，为了更好地研究免疫学的各个方面，对免疫细胞进行有效的分离和纯化是非常重要的。
免疫细胞的分离和纯化技术主要有以下几种：一、梯度离心分离法梯度离心分离法是采用密度梯度离心分离免疫细胞的方法。
具体步骤是将单个样品分离成不同的浓度梯度，并将样品均匀地添加在内层管子上，然后进行离心分离。
通过分析分离后的离心上清液中各种细胞类型的分布情况，可得到高纯度的特定免疫细胞。
该方法具有简单、快速、操作简单等优点。
二、单克隆抗体柱纯化法单克隆抗体柱纯化法是使用和特定抗体相结合的高亲和性蛋白质固相柱进行免疫细胞分离和纯化的方法。
该方法是将单个样品进行混合，将混合物通过配对的特定抗体柱，将目标细胞捕获和结合。
然后用缓冲液除去不结合的细胞，然后逐步提高pH、浓度等条件进行脱附和纯化。
该方法可以获得高纯度特定细胞的纯度，但需要对抗体进行结合实验，需要一些特殊的仪器和设备。
三、磁珠分离法磁珠分离法是将磁性珠子通过表面结合蛋白并与目标细胞结合的方法实现免疫细胞的分离和纯化的方法。
目前，该方法是免疫学研究分离和纯化细胞的主要方法之一。
该方法具有结合力强、纯度高、高通量、实时观察和可重复等特点。
然而，现有产品价格较高，因此利用磁珠结合留存的免疫抗体分子，促进自主磁珠制备已成为热门技术研究领域。
四、流式细胞术流式细胞术是一种使用单胞悬液通过免疫表型分析和单细胞相关性分析的方法。
该技术是通过将免疫细胞进行标记，然后将其通过流式细胞术仪器进行检测和分析，以实现细胞分离和分析的方法。
流式细胞术是高分析刻度，可以分析更多的样品、更少的细胞、更少的步骤，同时也能够研究细胞的表面和内部组成，测定分析数据的精确性高，检测的速度快等多种优点。
临床免疫学检验-第十三章细胞免疫学技术
➢人的红细胞密度为1.093 ➢粒细胞密度为1.092 ➢单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 1.075-1.090 ➢Ficoll分离液的密度为1.077±0.001
Ficoll分离法
聚蔗糖-泛影葡胺分层液的制备
6%聚蔗糖溶液 (Ficoll溶液)密度1.020
34%泛影葡胺溶液 (Hypaque溶液)密度1.2
酸性磷酸酶测定 非特异性酶的测定
巨噬细胞功能检测
炭粒廓清试验
正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90% 炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据 此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)， 间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒 的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判 断巨噬细胞的功能。
吞噬功能检测
鸡RBC
l液 密度1.135
细胞混悬液
高速离心 密
度
6小时
梯 度
低速离心 密 度 梯 度
死细胞残片和血小板 富含单核细胞的组分
富含淋巴细胞的组分 红细胞与粒细胞组分
淋巴细胞亚群的分离
T细胞和B细胞的分离
E花环分离法 尼龙棉分离法
E花环分离法
E受体
T
SRBC
B
E花环 T
离心
B
E花环
聚蔗糖-泛影
形成溶血空斑
可以检测致敏红细胞的各种抗原所对应的抗体,临 床应用比较广泛
反向空斑形成试验
反应物: 琼脂凝胶
SPA致敏的SRBC B细胞 补体 抗Ig抗体
形成溶血空斑
体外检测人类Ig分泌细胞的方法,与抗体的特异性 无关
酶联免疫斑点法
反应物:
包被在固相载体上的抗原 B细胞 酶标二抗
加底物显色
计数斑点形成细胞
Ficoll分离法
聚蔗糖-泛影葡胺分层液的制备
6%聚蔗糖溶液 (Ficoll溶液)密度1.020
34%泛影葡胺溶液 (Hypaque溶液)密度1.2
酸性磷酸酶测定 非特异性酶的测定
巨噬细胞功能检测
炭粒廓清试验
正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90% 炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据 此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)， 间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒 的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判 断巨噬细胞的功能。
吞噬功能检测
鸡RBC
l液 密度1.135
细胞混悬液
高速离心 密
度
6小时
梯 度
低速离心 密 度 梯 度
死细胞残片和血小板 富含单核细胞的组分
富含淋巴细胞的组分 红细胞与粒细胞组分
淋巴细胞亚群的分离
T细胞和B细胞的分离
E花环分离法 尼龙棉分离法
E花环分离法
E受体
T
SRBC
B
E花环 T
离心
B
E花环
聚蔗糖-泛影
形成溶血空斑
可以检测致敏红细胞的各种抗原所对应的抗体,临 床应用比较广泛
反向空斑形成试验
反应物: 琼脂凝胶
SPA致敏的SRBC B细胞 补体 抗Ig抗体
形成溶血空斑
体外检测人类Ig分泌细胞的方法,与抗体的特异性 无关
酶联免疫斑点法
反应物:
包被在固相载体上的抗原 B细胞 酶标二抗
加底物显色
计数斑点形成细胞
免疫细胞分离及NK活性测定
处死小鼠，消毒取脾，去除结缔组织和脂肪组织，放入平皿（ 处死小鼠，消毒取脾，去除结缔组织和脂肪组织，放入平皿（3ml Hanks 液）; 轻轻拉碎脾组织，制成脾细胞悬液，过200目滤网制成单细胞悬液; 目滤网制成单细胞悬液; 轻轻拉碎脾组织，制成脾细胞悬液， 200目滤网制成单细胞悬液 离心（1500转/分 5min），弃去上清; 5min），弃去上清; ），弃去上清 离心（1500转 用Hanks液洗涤2次(加入3ml Hanks液，混匀， 1500转/分 5min，去上 Hanks液洗涤 液洗涤2 加入3ml Hanks液 混匀， 1500转 5min， 最后一次吸尽上清，加入1ml 1640培养液 混匀； 培养液， 清)，最后一次吸尽上清，加入1ml 1640培养液，混匀； 细胞计数：取细胞悬液20微升，加到含有380微升白细胞稀释液的 微升， 细胞计数：取细胞悬液20微升 加到含有380微升白细胞稀释液的 Eppendorf管中 混匀，取适量细胞悬液，加入计数板中。 Eppendorf管中，混匀，取适量细胞悬液，加入计数板中。在显微镜下计 管中， 根据p53公示计算细胞数量 公示计算细胞数量。 数，根据p53公示计算细胞数量。 根据细胞数量，用1640完全培养基配成2×106/ml浓度的细胞悬液。 完全培养基配成2 /ml浓度的细胞悬液 浓度的细胞悬液。 根据细）： 靶细胞的制备（实验员准备）：
取对数生长期YAC- 细胞， Hanks液洗涤 取对数生长期YAC-1细胞， Hanks液洗涤2次，计数， 液洗涤2 计数， 调整至2 调整至2×105/ml。 /ml。
3、细胞毒试验： 细胞毒试验：
实验组 靶细胞 效应细胞 1640培养基 1640培养基 100µ 100µl 100µ 100µl － 靶细胞对照 效应细胞对 组 照组 100µ 100µl － 100µ 100µl － 100µ 100µl 100µ 100µl 空白组 － － 200µ 200µl
取对数生长期YAC- 细胞， Hanks液洗涤 取对数生长期YAC-1细胞， Hanks液洗涤2次，计数， 液洗涤2 计数， 调整至2 调整至2×105/ml。 /ml。
3、细胞毒试验： 细胞毒试验：
实验组 靶细胞 效应细胞 1640培养基 1640培养基 100µ 100µl 100µ 100µl － 靶细胞对照 效应细胞对 组 照组 100µ 100µl － 100µ 100µl － 100µ 100µl 100µ 100µl 空白组 － － 200µ 200µl
免疫细胞的分离和保存技术
免疫细胞的分离和保存技术用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。
为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。
参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。
由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。
有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。
分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。
现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。
一、白细胞的分离（一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。
本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。
肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。
操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min 后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。
（二）聚合物加速沉淀法本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。
本法的细胞获得率比自然沉降法高。
二、外周血单个核细胞的分离外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。
免疫细胞分离技术
流程长, 步骤繁, 成本高
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人外周血淋巴细胞(亚群)的分纯(purificcation) 人外周血单个核细胞（PBMC）主含淋巴细胞, 但混有 单核细胞、粒细胞、红细胞和血小板等。淋巴细胞的分纯： （一）红细胞的去除（0.83%氯化铵、蒸馏水） （二）血小板的去除（离心、洗涤） （三）单核、粒细胞的去除（黏附去除，羰基铁粉吞噬） （四）淋巴细胞亚群的分离★
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正选（positive selection）法： 磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞
负选（negtive selection）法： 磁珠结合不需要的细胞，游离于上清液的细胞为所需细胞
一般而言，负选法比正选法的磁珠用量大
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评价(evalution)：
Lymphocytes + sRBC , centrifugation----T lympho-cytes(底) / B lympho-cytes（界面）
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2、黏着性（理化）： B淋巴细胞易黏附聚酰胺纤维（尼龙纤维）表面，而T淋巴细胞则不易附 着～
（例）尼龙棉柱分离 — 直接流出的是T淋巴细胞。 3、免疫学：用特异性抗体并使其固相化，捕获具特定膜抗原的细胞～ （例）1、亲和板结合分离
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Precipitation of E rosette
Erythrocyte Rosette forming cell; ERFC The sueface of T lymphocyte contains the receptor (CD2) of sheep erythrocyte ,which is called E receptor for short . T lympho-cytes can form E rosette with sheep erythro-cytes by its E receptor.
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人外周血淋巴细胞(亚群)的分纯(purificcation) 人外周血单个核细胞（PBMC）主含淋巴细胞, 但混有 单核细胞、粒细胞、红细胞和血小板等。淋巴细胞的分纯： （一）红细胞的去除（0.83%氯化铵、蒸馏水） （二）血小板的去除（离心、洗涤） （三）单核、粒细胞的去除（黏附去除，羰基铁粉吞噬） （四）淋巴细胞亚群的分离★
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正选（positive selection）法： 磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞
负选（negtive selection）法： 磁珠结合不需要的细胞，游离于上清液的细胞为所需细胞
一般而言，负选法比正选法的磁珠用量大
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评价(evalution)：
Lymphocytes + sRBC , centrifugation----T lympho-cytes(底) / B lympho-cytes（界面）
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2、黏着性（理化）： B淋巴细胞易黏附聚酰胺纤维（尼龙纤维）表面，而T淋巴细胞则不易附 着～
（例）尼龙棉柱分离 — 直接流出的是T淋巴细胞。 3、免疫学：用特异性抗体并使其固相化，捕获具特定膜抗原的细胞～ （例）1、亲和板结合分离
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Precipitation of E rosette
Erythrocyte Rosette forming cell; ERFC The sueface of T lymphocyte contains the receptor (CD2) of sheep erythrocyte ,which is called E receptor for short . T lympho-cytes can form E rosette with sheep erythro-cytes by its E receptor.
免疫细胞的分离和检测
第一节 中性粒细胞功能的检测 Assays for Polymorphonuclear Function
一、细胞运动功能的检测
（一）体内实验法 （二）体外试验法 二、吞噬和杀菌功能的检测 （一）细胞内杀菌功能的检测
吞噬率 =
吞噬细菌的白细胞数
计数的白细胞数
吞噬细菌总数 计数的白细胞数
X 100%
4. 吞噬细胞的功能检测
第一节 免疫细胞的分离与纯化 Separation and Purification of Immunocyte
• 实验的目的；
• 所需细胞的种类、纯度和数量； • 方法简便可行，尽量保持活性、 纯度和收获率。
一、白细胞的分离
（一）自然沉降法 （二）聚合物加速沉降法
某些高分子聚合物（如明胶、 右旋糖酐、甲基纤维素和聚乙烯吡 咯烷酮等）可使红细胞凝聚成串， 加速红细胞沉降，使之更易与白细 胞分离。
第三节
淋巴细胞功能检测技术
Assays for Lymphocyte
Function
一、T细胞功能检测
（一）T细胞增殖试验
T细胞在体外受有丝分裂原或抗原刺激后，
细胞代谢和形态发生变化，主要表现为胞内蛋白
质和核酸合成增加，发生一系列增殖反应。如细
胞变大、胞质增多、出现空泡、核质疏松、核仁
明显并转化为淋巴母细胞，又称淋巴细胞转化试
密度梯度分离单个核细胞 （Ficoll分层液）
密度梯度分离单个核细胞 （Ficoll分层液）
Percoll (商品名） 经过聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrolidone,PVP)处理的硅胶颗粒大小 不一的混悬液。 高速离心后，形成连续密度梯度， 可将密度不同的细胞分离纯化。分离淋 巴细胞纯度达98% ，单个核细胞纯度达 78% 。流程长、烦琐、费用高。
15-免疫细胞的分离和保存技术
淋 T细胞：CD2、CD3、CD4、CD8、
巴
CD25等。
细 胞
B细胞：CD19、CD20、CD21、CD22、 CD29等。
1、E花环沉淀法 方法：淋巴细胞+ SRBC悬液→加入 分层液→T细胞形成E花环而沉于管→ 悬液中为B细胞。
2、尼龙毛分离法
方法：淋巴细胞→通过聚酰胺纤维管 →洗脱下来的是T细胞。
（二）斑螯敷法
•此法可从人体组织液中获取较纯的吞噬细胞。 •方法：
用滤纸蘸取10%中药斑螯酒精浸出液 → 贴敷在臂内侧皮肤表面 → 4~5小时后皮肤局部充血 → 48小时后局部形成水泡 → 吸取水泡中的组织液，内 含大量巨噬细胞。 •但此法对病人皮肤有一定损伤，有时可引起局部感 染。
• 中性粒细胞的分离
→与磁珠结合的细胞运动将受限， 未与磁珠结合的细胞将先被洗脱
→再将该柱移出磁场
→与磁珠结合的细胞将被洗脱。
5、磁性激活细胞 分离器分离法
6、淘选法 (利用 表面标志分离淋 巴细胞亚群）
五、单核巨噬细胞的分离
（一）Percoll分离法 •此法从外周血中分离出单核-巨噬细 胞，但由于此类细胞在外周血中的含 量较低，分离时所需的血量较多。
人：静脉采血，抗凝剂抗凝。 动物：颈静脉采血法、尾部采血法、
眼眶采血法、心脏采血法等。
二、外周血中白细胞的分离
血液中红细胞与白细胞比例约为600:1~1000:1， ➢ 两者的比重不同，其沉降速度也不同，通常
用两种方法加以分离。 1、自然沉降法 2、聚合物加速沉淀法 ➢ 或采用0.83%氯化铵分离法使红细胞破裂后， 洗涤得到白细胞。
2、吸附柱过滤法 •将单核 细胞吸附于玻璃柱中，洗脱下 来的主要是淋巴细胞。
第十三章 免疫细胞分离及检测技术 一、选择题 A1 型题(标 …
二、填空题 1. 淋巴细胞 单核细胞 2. SmIg 3. 一个 Ig 分泌细胞 4. 形态法 放射性核素法 5. 台盼蓝染色法
三、名词解释 1．PBMC：即外周血单个核细胞,包括淋巴细胞和单核细胞。 2．SmIg：是 B 细胞表面的膜免疫球蛋白，是 B 细胞特有的表面标志，是鉴定 B 细胞可靠的 指标。
15.下列哪种是 NK 细胞特有的表面抗原？ A.CD2 B.CD16 C.CD56 D.CD39 E.无特异表面抗原 16.仅作用于 T 细胞的非特异性刺激物是： A.PWM B.PHA C.LPS D.ConA E.EBV 17．既作用于 T 细胞又作用 B 细胞的非特异性刺激物是： A.PWM B.PHA C.LPS D.可溶性 SPA E.EBV 18．T 细胞亚群功能的判定主要根据： A.CD4/CD8 B.T 细胞亚群计数 C.T 细胞表面标志数目的多少 D.T 细胞浆内酸性磷酸酶的水平 E.T 细胞分泌的有关细胞因子水平 19．溶血空斑试验主要是用来检测何种细胞的的功能？ A.T 细胞 B.B 细胞 C.中性粒细胞 D.吞噬细胞 E.NK 细胞 20．淋巴细胞功能体内试验的方法主要是： A.转化试验 B.对异物排斥反应的能力 C.迟发型超敏反应 D.淋巴细胞计数 E.血清中 Ig 浓度的检测 21．正常情况下，健康人外周血经 PHA 刺激后，淋巴细胞转化率为： A.<40% B.40%-50% C.60%-80% D.80%± E.>90% 22．采用放射性核素法检测 T 淋巴细胞转化功能时，3H-TdR 加入至培养基的时间是： A.G0 期
细胞大小直径m1220细胞核大小染色质核仁有丝分裂细胞浆胞质着色空泡伪足转化的淋巴细胞原淋巴细胞过渡型1216增大疏松有或无无增多嗜碱有或无有或无未转化淋巴细胞68不增大密集无无极少天青色无无增大疏松清晰14个有或无增多嗜碱有或无有或无五论述题五论述题1
三、名词解释 1．PBMC：即外周血单个核细胞,包括淋巴细胞和单核细胞。 2．SmIg：是 B 细胞表面的膜免疫球蛋白，是 B 细胞特有的表面标志，是鉴定 B 细胞可靠的 指标。
15.下列哪种是 NK 细胞特有的表面抗原？ A.CD2 B.CD16 C.CD56 D.CD39 E.无特异表面抗原 16.仅作用于 T 细胞的非特异性刺激物是： A.PWM B.PHA C.LPS D.ConA E.EBV 17．既作用于 T 细胞又作用 B 细胞的非特异性刺激物是： A.PWM B.PHA C.LPS D.可溶性 SPA E.EBV 18．T 细胞亚群功能的判定主要根据： A.CD4/CD8 B.T 细胞亚群计数 C.T 细胞表面标志数目的多少 D.T 细胞浆内酸性磷酸酶的水平 E.T 细胞分泌的有关细胞因子水平 19．溶血空斑试验主要是用来检测何种细胞的的功能？ A.T 细胞 B.B 细胞 C.中性粒细胞 D.吞噬细胞 E.NK 细胞 20．淋巴细胞功能体内试验的方法主要是： A.转化试验 B.对异物排斥反应的能力 C.迟发型超敏反应 D.淋巴细胞计数 E.血清中 Ig 浓度的检测 21．正常情况下，健康人外周血经 PHA 刺激后，淋巴细胞转化率为： A.<40% B.40%-50% C.60%-80% D.80%± E.>90% 22．采用放射性核素法检测 T 淋巴细胞转化功能时，3H-TdR 加入至培养基的时间是： A.G0 期
细胞大小直径m1220细胞核大小染色质核仁有丝分裂细胞浆胞质着色空泡伪足转化的淋巴细胞原淋巴细胞过渡型1216增大疏松有或无无增多嗜碱有或无有或无未转化淋巴细胞68不增大密集无无极少天青色无无增大疏松清晰14个有或无增多嗜碱有或无有或无五论述题五论述题1
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人民卫生出版社
第十章 免疫细胞的分离和功能检测
免疫细胞种类
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
分离免疫细胞的样本来源
• 外周血 • 脾脏 • 淋巴结 • 胸腺 • 骨髓
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
分离免疫细胞的目的
• 检测免疫细胞的数量和功能，观察机体 免疫状态
• 免疫细胞的细胞生物学研究 • 免疫细胞的培养和建株
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
（一）中性粒细胞功能检测
• 细胞趋化功能的检测 • 吞噬功能的检测 • 杀菌功能的检测
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
趋化功能检测——检测细胞运动功能
• 体内试验法：皮肤窗法 • 体外试验法：滤膜渗透法
琼脂糖平板法
皮肤窗法 在受检者前臂屈侧中央3㎜范围内，搔刮 皮肤后，用盖玻片压紧固定，在第2，5，8，12， 24，36小时各取样一次，染色观察中性粒细胞聚集 开始时间、聚集程度等。健康正常人一般2～3h后
人民卫生出版社
第十章 免疫细胞的分离和功能检测
第十章 免疫细胞的分离和功能检测
免疫细胞的分离和功能检测
人民卫生出版社
第十章 免疫细胞的分离和功能检测
免疫细胞的分离及检测
免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的 细胞从血液或组织中分离出来
※检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定 ※方法：体外法为主 ※目的：判断机体免疫状态 ※意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效
• Ficoll分离法 可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞
血浆
RBC
RBC
(抗凝血)
人民卫生出版社
第十章 免疫细胞的分离和功能检测
外周血中性粒细胞分离(Ficoll-Hypaque)
人民卫生出版社
第十章 免疫细胞的分离和功能检测
二、相关功能检测
吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀 灭作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。 （一）中性粒细胞功能检测技术 （二）巨噬细胞功能检测技术
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
腹腔渗出法分离腹腔巨噬细胞
腹腔注射诱导剂 3－4 days
腹腔内注射肝素PBS
处死动物，吸取腹腔液（含大量巨噬细胞）
洗涤细胞、计数
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
（三）中性粒细胞的分离
• 聚合物加速沉降法 可从外周血中分离出白细胞
WBC
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
NBT还原试验
方法： 1.抗凝血 + 硝基蓝四氮唑（NBT），37℃孵育 25min。 2.推片染色、镜检。 正常值：
NBT阳性细胞率应≥95%
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
（二）巨噬细胞功能检测
炭粒廓清试验 正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90％炭粒，脾 巨噬细胞约吞噬清除10％炭粒。据此给小鼠静脉 注射定量印度墨汁（炭粒悬液），间隔一定时间 反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流 中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
分离免疫细胞的一般原理
• 物理学和生物学特征 • 密度大小 • 表面标志 • 其它活性：吞噬、黏附等
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
目录
1 吞噬细胞的分离和收集 2 外周血单个核细胞的分离和纯化 3 淋巴细胞及其亚群的分离
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趋化因子，右孔加对照液，温育4～8小时后，用显 微镜测微器测定中性粒细胞向左孔的移动距离A和 向右孔的移动距离B，计算趋化指数。
趋化指数= A/B 趋化指数越大，表明中性粒细胞运动功能越强
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
（一）中性粒细胞吞噬功能检测
• 显微镜检查法
吞噬率(%)
吞噬细菌的白细胞数 计数的白细胞数
第十章 免疫细胞的分离和功能检测
第一节 吞噬细胞的分离和收集
吞噬细胞的种类 ﹡大吞噬细胞:即单核-吞噬细胞系统 ﹡小吞噬细胞:即中性粒细胞
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
一、吞噬细胞的分离
（一）单核细胞的分离
特征性标志 CD14 分离技术 • Pecoll密度梯度分离法：获取细胞数较少 • 流式细胞仪分离技术 设备要求高，操作复杂 • 免疫磁珠分离法：为目前较常用的方法 • 黏附法:影响细胞功能
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
免疫磁珠分离法
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
（二）巨噬细胞的分离 ☆斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞 ☆动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
斑蟊敷贴法分离人巨噬细胞
20世纪70年代由我国免疫学家创立 斑蝥的酒精浸出液可趋化巨噬细胞 分离方法
100
吞噬指数菌功能检测
NBT还原试验
原理：
N-N-
C
+ H+
N=N-R-
四氮唑基（淡黄色）
N-NH2 C N=NH
甲chan（紫黑色）
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
硝基四唑氮蓝试验 （NBT试验）
本法用于检测中性粒细胞胞内杀菌能力，由于中性粒细 胞在杀菌过程中能量消耗剧增，耗氧量亦随之相应增加， 磷酸己糖旁路代谢活力增强，葡萄糖6-磷酸氢化脱氢，此 时加入NBT可接受所脱的氢，使原先呈淡黄色的NBT还原成 点状或块状甲簪颗粒并沉积在胞浆内.
开始聚集，达50～100个，6小时可达1000个以上。
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
滤膜渗透法
原理及技术要点 在一特制的分上下两层的小盒，将趋化因子加
入下室，待检细胞加入上室，两室用微孔滤膜分 隔，37℃温育数小时后，上室的中性粒细胞受下 室趋化因子的吸引，由滤膜微孔进入滤膜内，取 滤膜清洗、固定、干燥、染色和透明，在高倍镜 下观察细胞穿越滤膜的移动距离，从而判断其趋 化功能。
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
中性粒细胞趋化功能检测
－－Boden 小室法
Boyden Chamber Shi et al. J Immunol Methods, 1993, 164: 149
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
琼脂糖平板法
原理及技术要点 在琼脂糖凝胶平板的中孔加白细胞悬液，左孔加
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
免疫细胞种类
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
分离免疫细胞的样本来源
• 外周血 • 脾脏 • 淋巴结 • 胸腺 • 骨髓
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
分离免疫细胞的目的
• 检测免疫细胞的数量和功能，观察机体 免疫状态
• 免疫细胞的细胞生物学研究 • 免疫细胞的培养和建株
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
（一）中性粒细胞功能检测
• 细胞趋化功能的检测 • 吞噬功能的检测 • 杀菌功能的检测
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
趋化功能检测——检测细胞运动功能
• 体内试验法：皮肤窗法 • 体外试验法：滤膜渗透法
琼脂糖平板法
皮肤窗法 在受检者前臂屈侧中央3㎜范围内，搔刮 皮肤后，用盖玻片压紧固定，在第2，5，8，12， 24，36小时各取样一次，染色观察中性粒细胞聚集 开始时间、聚集程度等。健康正常人一般2～3h后
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
第十章 免疫细胞的分离和功能检测
免疫细胞的分离和功能检测
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
免疫细胞的分离及检测
免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的 细胞从血液或组织中分离出来
※检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定 ※方法：体外法为主 ※目的：判断机体免疫状态 ※意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效
• Ficoll分离法 可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞
血浆
RBC
RBC
(抗凝血)
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
外周血中性粒细胞分离(Ficoll-Hypaque)
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
二、相关功能检测
吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀 灭作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。 （一）中性粒细胞功能检测技术 （二）巨噬细胞功能检测技术
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
腹腔渗出法分离腹腔巨噬细胞
腹腔注射诱导剂 3－4 days
腹腔内注射肝素PBS
处死动物，吸取腹腔液（含大量巨噬细胞）
洗涤细胞、计数
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
（三）中性粒细胞的分离
• 聚合物加速沉降法 可从外周血中分离出白细胞
WBC
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
NBT还原试验
方法： 1.抗凝血 + 硝基蓝四氮唑（NBT），37℃孵育 25min。 2.推片染色、镜检。 正常值：
NBT阳性细胞率应≥95%
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
（二）巨噬细胞功能检测
炭粒廓清试验 正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90％炭粒，脾 巨噬细胞约吞噬清除10％炭粒。据此给小鼠静脉 注射定量印度墨汁（炭粒悬液），间隔一定时间 反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流 中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
分离免疫细胞的一般原理
• 物理学和生物学特征 • 密度大小 • 表面标志 • 其它活性：吞噬、黏附等
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
目录
1 吞噬细胞的分离和收集 2 外周血单个核细胞的分离和纯化 3 淋巴细胞及其亚群的分离
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趋化因子，右孔加对照液，温育4～8小时后，用显 微镜测微器测定中性粒细胞向左孔的移动距离A和 向右孔的移动距离B，计算趋化指数。
趋化指数= A/B 趋化指数越大，表明中性粒细胞运动功能越强
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
（一）中性粒细胞吞噬功能检测
• 显微镜检查法
吞噬率(%)
吞噬细菌的白细胞数 计数的白细胞数
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第一节 吞噬细胞的分离和收集
吞噬细胞的种类 ﹡大吞噬细胞:即单核-吞噬细胞系统 ﹡小吞噬细胞:即中性粒细胞
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
一、吞噬细胞的分离
（一）单核细胞的分离
特征性标志 CD14 分离技术 • Pecoll密度梯度分离法：获取细胞数较少 • 流式细胞仪分离技术 设备要求高，操作复杂 • 免疫磁珠分离法：为目前较常用的方法 • 黏附法:影响细胞功能
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
免疫磁珠分离法
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
（二）巨噬细胞的分离 ☆斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞 ☆动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取
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斑蟊敷贴法分离人巨噬细胞
20世纪70年代由我国免疫学家创立 斑蝥的酒精浸出液可趋化巨噬细胞 分离方法
100
吞噬指数菌功能检测
NBT还原试验
原理：
N-N-
C
+ H+
N=N-R-
四氮唑基（淡黄色）
N-NH2 C N=NH
甲chan（紫黑色）
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硝基四唑氮蓝试验 （NBT试验）
本法用于检测中性粒细胞胞内杀菌能力，由于中性粒细 胞在杀菌过程中能量消耗剧增，耗氧量亦随之相应增加， 磷酸己糖旁路代谢活力增强，葡萄糖6-磷酸氢化脱氢，此 时加入NBT可接受所脱的氢，使原先呈淡黄色的NBT还原成 点状或块状甲簪颗粒并沉积在胞浆内.
开始聚集，达50～100个，6小时可达1000个以上。
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
滤膜渗透法
原理及技术要点 在一特制的分上下两层的小盒，将趋化因子加
入下室，待检细胞加入上室，两室用微孔滤膜分 隔，37℃温育数小时后，上室的中性粒细胞受下 室趋化因子的吸引，由滤膜微孔进入滤膜内，取 滤膜清洗、固定、干燥、染色和透明，在高倍镜 下观察细胞穿越滤膜的移动距离，从而判断其趋 化功能。
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中性粒细胞趋化功能检测
－－Boden 小室法
Boyden Chamber Shi et al. J Immunol Methods, 1993, 164: 149
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第十章 免疫细胞的分离和功能检测
琼脂糖平板法
原理及技术要点 在琼脂糖凝胶平板的中孔加白细胞悬液，左孔加