中华补血草金属硫蛋白基因的克隆及高盐处理下的表达模式分析
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中华补血草LsRab7基因的克隆及盐、干旱胁迫下表达分析
第 ３１卷第 ３期 ２０１８年 ７月
烟台大学学报（自然科学与工程版）
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＹａｎｔａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＥｄｉｔｉｏｎ）
Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．３ Ｊｕｌ１８）０３０２１３０６
ｄｏｉ：１０．１３９５１／ｊ．ｃｎｋｉ．３７１２１３／ｎ．２０１８．０３．００５
教授，博士，研究方向：植物发育与分子生物学．
２１４
烟台大学学报（自然科学与工程版）
第 ３１卷
泌盐、抗旱相关基因在参与盐胁迫和离子胁迫中的 作用研究相对较少．笔者成功从中华补血草中克隆 出了 ＬｓＲａｂ７的 ｃＤＮＡ序列，并对该基因在不同时间 内的盐处理（２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ）和模拟干旱 （２０％ ＰＥＧ－６０００）处理下的相对表达量进行了分析．为研 究该基因在中华补血草中的功能及中华补血草的耐 逆分子机制奠定了基础．
１ 材料与方法
１１ 试剂 ＲＮＡｐｒｅｐｐｕｒｅ植物总 ＲＮＡ提取试剂盒购自天
根生 化 科 技 （北 京 ）有 限 公 司；ＦｒｕｉｔｍａｔｅｆｏｒＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、克隆载体 ｐＭＤ１９－Ｔ、ＳＹＢＲ ＰｒｅｍｉｘＥｘ Ｔａｑ（ＴｌｉＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）购 自 宝 生 物 工 程 （大 连 ）有 限 公司；ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ试剂盒购自普洛麦格（北 京）生 物 技 术 有 限 公 司；ＴａｑＤＮＡ聚 合 酶、ｄＮＴＰｓ、 Ｍｇ２＋购自上海生工生物工程公司；大肠杆菌 ＤＨ５α 为本实验室保存；氯化钠、聚乙二醇 －６０００（ＰＥＧ－ ６０００）等均为国产分析纯． １２ 材料
中华补血草 ＬｓＲａｂ７基因的克隆及盐、 干旱胁迫下表达分析
艾丽花，姜夕雷，贾冰晨，王 宇，陈世华，尹海波，郭善利
烟台大学学报（自然科学与工程版）
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＹａｎｔａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＥｄｉｔｉｏｎ）
Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．３ Ｊｕｌ１８）０３０２１３０６
ｄｏｉ：１０．１３９５１／ｊ．ｃｎｋｉ．３７１２１３／ｎ．２０１８．０３．００５
教授，博士，研究方向：植物发育与分子生物学．
２１４
烟台大学学报（自然科学与工程版）
第 ３１卷
泌盐、抗旱相关基因在参与盐胁迫和离子胁迫中的 作用研究相对较少．笔者成功从中华补血草中克隆 出了 ＬｓＲａｂ７的 ｃＤＮＡ序列，并对该基因在不同时间 内的盐处理（２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ）和模拟干旱 （２０％ ＰＥＧ－６０００）处理下的相对表达量进行了分析．为研 究该基因在中华补血草中的功能及中华补血草的耐 逆分子机制奠定了基础．
１ 材料与方法
１１ 试剂 ＲＮＡｐｒｅｐｐｕｒｅ植物总 ＲＮＡ提取试剂盒购自天
根生 化 科 技 （北 京 ）有 限 公 司；ＦｒｕｉｔｍａｔｅｆｏｒＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、克隆载体 ｐＭＤ１９－Ｔ、ＳＹＢＲ ＰｒｅｍｉｘＥｘ Ｔａｑ（ＴｌｉＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）购 自 宝 生 物 工 程 （大 连 ）有 限 公司；ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ试剂盒购自普洛麦格（北 京）生 物 技 术 有 限 公 司；ＴａｑＤＮＡ聚 合 酶、ｄＮＴＰｓ、 Ｍｇ２＋购自上海生工生物工程公司；大肠杆菌 ＤＨ５α 为本实验室保存；氯化钠、聚乙二醇 －６０００（ＰＥＧ－ ６０００）等均为国产分析纯． １２ 材料
中华补血草 ＬｓＲａｂ７基因的克隆及盐、 干旱胁迫下表达分析
艾丽花，姜夕雷，贾冰晨，王 宇，陈世华，尹海波，郭善利
中华补血草盐腺细胞发育的扫描电镜观察
中华补血草盐腺细胞发育的扫描电镜观察摘要利用扫描电镜技术观察盐腺细胞在中华补血草不同发育时期叶芽中的生长发育情况,结果表明:中华补血草盐腺细胞的发育时期远远早于气孔的发育时期。
关键词中华补血草;盐腺细胞;扫描电镜中华补血草(Limonium sinense Kuntze)是蓝雪科补血草属植物,它之所以能在含盐量较高的环境中生长发育,是因为它的叶片上长有独特的植物微形态结构——盐腺。
该文利用扫描电镜技术观察了盐腺细胞在中华补血草不同发育时期叶芽中的生长发育情况。
1材料与方法1.1试验材料培育了6个月的中华补血草幼嫩的叶组织。
1.2试验方法1.2.1盐处理。
将单株盆栽中华补血草植株第1次用100 mmol/L的NaCl溶液进行处理,第2次用200mmol/L的NaCl溶液进行处理,第3次以及以后均用300mmol/L的NaCl溶液进行处理。
1.2.2清洗。
分别取经过NaCl处理的和未经NaCl处理的植株各8株,把植株清洗干净,并将外部的大叶片去除,留下内部的6层幼叶幼芽,用刀片将其根部的外表皮切除。
1.2.3戊二醛固定。
用生理盐水将幼芽表面污物清洗干净,然后将幼芽按照幼叶的生长顺序剥离,并放入装有 2.5%戊二醛溶液(用0.1mol/L的磷酸缓冲液配制,pH值7.2～7.4)的EP管中,把EP管放入4℃冰箱中固定材料24h(中间换1次新液)。
1.2.4锇酸固定。
把EP管从冰箱中取出,将其中的戊二醛溶液倒出,然后用0.1mol/L的磷酸缓冲液清洗浸泡材料3h(中间每隔1h换1次新液);然后将磷酸缓冲液倒出,用1%锇酸固定材料1.5h;最后将锇酸倒出,用双蒸水清洗材料至无锇酸气味(约2h以上)。
1.2.5脱水。
用30%、50%、70%、85%、95%的梯度乙醇溶液对材料进行脱水处理,每个浓度处理15min,最后用无水乙醇处理2次,每次20min;脱水处理后的材料,用醋酸异戊酯置换处理30min,然后进行常规临界点干燥。
中华补血草Syntaxin基因的克隆(英文)
ｔｃ ａ ｌ ｔａ ｔ ｉ ｍｅｄａｅｄ ｂｙ ｅｐ ｉｏ ｇｕａｎ ｃ ｉ ｔ ｖｙ ｉｔ ｈ －
ａ ｔｈｏ ｉ Ｊ Ｔ ｒｍｂ ｓ ｅ ｅ ｒｈ ｎｉ ｒｍｂ ［ ． ｈｏ ｏ ｉ Ｒ ｓ ａｃ 。 ｔ ｎ ］ ｓ
２ ０ ， １ 《１１ １ １ ８ ０ ３ １ ２３： ５ — ５ ．
中华补血草 ｎａ ｉ 因的克隆 ｔ ｎ基 ｘ
张莹， 世华 ， 会玲， 伟红， 陈 韩 窦 尹海波， 赵吉强， 郭善利 （ 大学生命科学学院， 烟台 山东烟台２４ ５ ６ ０） ０
摘 要 【 目的］对中华补血草 Ｓｎ ￣ 基因进行克隆 。【 ｙｔ ｉ ａｎ 方法】以中华补血草叶片为材料 ， 提取总 Ｒ Ａ并进行反转录反应。依 据已知 Ｓ ｎ ｘ 基 Ｎ ｙｔ ｉ ａｎ 因 ５端 ＥＴ 列信 息设计巢式 引物 ， ’ Ｓ序 以反转录得到 的 ｃ Ｎ Ｄ Ａ为模板 ， 用 ２轮 Ｐ Ｒ扩增 ｃ Ｎ ’ 利 Ｃ Ｄ Ａ ３末端（’Ｒ Ｃ ）获得 Ｓｎ ｘ 基因 ３端序列 。 ３ Ａ Ｅ， ｙｔ ｉ ａｎ ’ 【 结果］ 获得 １０ ０ ｂ ９ ｐ的 Ｄ Ａ片段 。分析 表明 ， Ｎ 该片段编码 ＬＳ ｎ ｘ 全长基 因， 中开放 阅读框长 ８ ６ ｂ ， ｓｙｔ ｉ ａｎ 其 １ ｐ 编码 ２ １ 氨基酸 。该基 因编码 的 ７个 Ｓｎａｉ 蛋 白相对分 子量 为 ３ ５ － Ｄ ， 等电点 为 ５ ５ 结论】为研究 Ｓ ｎ ｘ 基因在补血草中的功能及 其在补血 草泌盐过程 的作用奠定 ｙｔ ｎ ｘ ０ ２ ４ ａ 理论 ３ ． 。［ ５ ｙｔ ｉ ａｎ
『３ ２ 】ＭＡＣＦ ＡＲＬ ＮＥ ＲＧ．Ａｎ ｅ ｚ ｍｅ ｃ ｓ Ａ ｎｙ ａ－
ｃａ ｅ ｉ ｈ ｏｏ ｌｔｉ ｄ ｎ ｔ ｅ ｂｌ ｄ ｃｏｔ ｎｇ ｍｅｃ ａｎｓ ｈ ｉｍ
ａ ｔｈｏ ｉ Ｊ Ｔ ｒｍｂ ｓ ｅ ｅ ｒｈ ｎｉ ｒｍｂ ［ ． ｈｏ ｏ ｉ Ｒ ｓ ａｃ 。 ｔ ｎ ］ ｓ
２ ０ ， １ 《１１ １ １ ８ ０ ３ １ ２３： ５ — ５ ．
中华补血草 ｎａ ｉ 因的克隆 ｔ ｎ基 ｘ
张莹， 世华 ， 会玲， 伟红， 陈 韩 窦 尹海波， 赵吉强， 郭善利 （ 大学生命科学学院， 烟台 山东烟台２４ ５ ６ ０） ０
摘 要 【 目的］对中华补血草 Ｓｎ ￣ 基因进行克隆 。【 ｙｔ ｉ ａｎ 方法】以中华补血草叶片为材料 ， 提取总 Ｒ Ａ并进行反转录反应。依 据已知 Ｓ ｎ ｘ 基 Ｎ ｙｔ ｉ ａｎ 因 ５端 ＥＴ 列信 息设计巢式 引物 ， ’ Ｓ序 以反转录得到 的 ｃ Ｎ Ｄ Ａ为模板 ， 用 ２轮 Ｐ Ｒ扩增 ｃ Ｎ ’ 利 Ｃ Ｄ Ａ ３末端（’Ｒ Ｃ ）获得 Ｓｎ ｘ 基因 ３端序列 。 ３ Ａ Ｅ， ｙｔ ｉ ａｎ ’ 【 结果］ 获得 １０ ０ ｂ ９ ｐ的 Ｄ Ａ片段 。分析 表明 ， Ｎ 该片段编码 ＬＳ ｎ ｘ 全长基 因， 中开放 阅读框长 ８ ６ ｂ ， ｓｙｔ ｉ ａｎ 其 １ ｐ 编码 ２ １ 氨基酸 。该基 因编码 的 ７个 Ｓｎａｉ 蛋 白相对分 子量 为 ３ ５ － Ｄ ， 等电点 为 ５ ５ 结论】为研究 Ｓ ｎ ｘ 基因在补血草中的功能及 其在补血 草泌盐过程 的作用奠定 ｙｔ ｎ ｘ ０ ２ ４ ａ 理论 ３ ． 。［ ５ ｙｔ ｉ ａｎ
『３ ２ 】ＭＡＣＦ ＡＲＬ ＮＥ ＲＧ．Ａｎ ｅ ｚ ｍｅ ｃ ｓ Ａ ｎｙ ａ－
ｃａ ｅ ｉ ｈ ｏｏ ｌｔｉ ｄ ｎ ｔ ｅ ｂｌ ｄ ｃｏｔ ｎｇ ｍｅｃ ａｎｓ ｈ ｉｍ
盐胁迫对中华补血草生长及体内Na +、K +、Cl -含量的影响
分别 磨碎后 取适 量 于马伏 炉 中 ５０℃灰 化 ， 分用 ５ 灰
浓 硝酸溶 解 、 容 后 用 原 子 吸收 光 谱 仪 （日立 Ｚ一 定
０ １ Ｈ Ｃ 消毒 １ ｎ 用 自来 水充 分 冲洗 后 ， ．％ ｇ１ ０ｍｉ， 挑
８０ ００型 ） 定 Ｎ 、 、 ａ 量 ， 定 法 测 定 ｃ ～ 测 ａ Ｋ ｃ 含 滴 ｌ
８ ％ 。２ ０ ０ｄ后 ， 苗长 至 ４～５片真 叶 时 ， 待 移栽 人 装 有 干净 细 沙 的 盆 中 ， 每盆 ４株 ， Ｈ ａｌ ｄ营 养 液 用 ｏｇａ ｎ
有较 高的经济 价值 ， 因此 ， 中华补 血草 的开发利 用及 研究具 有极其 重要 的生物学 和经 济意义 。 盐 生植 物 根据 其 耐盐 机 理 的不 同 ， 以分 为稀 可
—
ｅｃ ｓ ｎｈ ｌ ｈｔｓ ¨ 。 中华补 血 草 是 一种 具 ｘｌ ｉ ａ ｐ ｙ ） Ｊ ｕｏ ｏ ｅ
有特殊 泌盐结 构—— 盐 腺 的泌 盐 盐 生植 物 ， 耐受 可
高达 ６０ｍｍ ｌＬＮ Ｃ 的浓 度并 完 成其 生 活史 。该 ０ ｏ ａ１ ／
植 物可通 过地 上部分 的多细 胞盐腺 结构 排 出体 内过 多的盐分 Ｊ ａ Ｋ Ｃ 一 几类 离 子 是 引 发植 。Ｎ 、 、 ｌ 这 物胁迫 的主要 离子 ， 究 中华 补 血 草在 盐 胁 迫 条件 研 下的生 长及无 机渗 透 调节 物 质 的变 化 ， 于研 究 植 对 物耐盐 生理机 制和提 高植物 耐盐性 的遗传 改 良具有
恒 重 ， 得干重 。 称
重 要 的现实意 义和参 考价值 。
１ 材料 与方 法
植 物含水 量 ＝（ 鲜重 一干重 ） 鲜重 Ｘ１０ ／ ％ ０
论文答辩
13
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
细菌扩增后在含有重金属盐离子的 平板上点菌结果图
AMP是抗性筛选压，IPTG是促进细菌基因表达的诱导素，使细菌大量合 成金属硫蛋白，与重金属离子结合，导致菌落生长速度减慢。
14
在含Cu的平板上菌液浓度梯度显示不明显，后两种梯度基本不生长。
15
含Zn的平板上菌液浓度梯度显示明显，各浓度均有生长。
10
连接T载体质粒酶切电泳检测图
• 经酶切后电泳检测切出的目的片段，MT16，MT82在250bp左右有较 亮片段，MT42在200bp左右有较亮片段，证明目的片段成功导入了 质粒，然后进行测序检验。将验证好的酶切产物与与PGEX4T-1载体 使用同种酶切形成粘性末端然后连接。
11
导入BL21大肠杆菌中提取质粒电泳 图
17
致谢
敬请各位老师对我 的论文进行批评指正， 感谢各位老师的教导。
18
7
补血草总RNA提取结果
图片显示的为补血草总RNA提取后的电泳结果。从上到下的条带依次为： 5S rRNA、18S rRNA和28S rRNA。由于mRNA约占RNA总量的5%， rRNA 约占RNA总量的 80%，tRNA约占RNA总量的15%，所以检测时只 能观察到rRNA，rRNA是细胞中含量最多的一类RNA，且分子量比较大， 代谢都不活跃，种类仅有几种，真核生物中主要有5S rRNA、5.8S rRNA、 18S rRNA和28S rRNA，由于5S rRNA,5.8S rRNA 相差很小，所以在电 泳检测中无法分辨。结果出现3条条带，证明RNA未被降解。
5
实验目的
本实验通过将补血草处于盐胁迫条件下，使其相 关的抗逆基因大量表达，进而将全RNA进行反转 录得到cDNA, 通过基因特异性引物，PCR扩增金 属硫蛋白基因MT16、MT42、MT82，导入到T载 体中，转入DH5α大肠杆菌进行扩增，提取质粒后， 测序验证目的基因，然后再连入PGEX4T-1载体 中，构建金属硫蛋白的原核表达载体，重组载体 转入BL21大肠杆菌中，在含有重金属的平板上点 菌，通过观察菌株的生长状况来研究MT基因表达 与重金属耐受性间的联系。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
细菌扩增后在含有重金属盐离子的 平板上点菌结果图
AMP是抗性筛选压，IPTG是促进细菌基因表达的诱导素，使细菌大量合 成金属硫蛋白，与重金属离子结合，导致菌落生长速度减慢。
14
在含Cu的平板上菌液浓度梯度显示不明显，后两种梯度基本不生长。
15
含Zn的平板上菌液浓度梯度显示明显，各浓度均有生长。
10
连接T载体质粒酶切电泳检测图
• 经酶切后电泳检测切出的目的片段，MT16，MT82在250bp左右有较 亮片段，MT42在200bp左右有较亮片段，证明目的片段成功导入了 质粒，然后进行测序检验。将验证好的酶切产物与与PGEX4T-1载体 使用同种酶切形成粘性末端然后连接。
11
导入BL21大肠杆菌中提取质粒电泳 图
17
致谢
敬请各位老师对我 的论文进行批评指正， 感谢各位老师的教导。
18
7
补血草总RNA提取结果
图片显示的为补血草总RNA提取后的电泳结果。从上到下的条带依次为： 5S rRNA、18S rRNA和28S rRNA。由于mRNA约占RNA总量的5%， rRNA 约占RNA总量的 80%，tRNA约占RNA总量的15%，所以检测时只 能观察到rRNA，rRNA是细胞中含量最多的一类RNA，且分子量比较大， 代谢都不活跃，种类仅有几种，真核生物中主要有5S rRNA、5.8S rRNA、 18S rRNA和28S rRNA，由于5S rRNA,5.8S rRNA 相差很小，所以在电 泳检测中无法分辨。结果出现3条条带，证明RNA未被降解。
5
实验目的
本实验通过将补血草处于盐胁迫条件下，使其相 关的抗逆基因大量表达，进而将全RNA进行反转 录得到cDNA, 通过基因特异性引物，PCR扩增金 属硫蛋白基因MT16、MT42、MT82，导入到T载 体中，转入DH5α大肠杆菌进行扩增，提取质粒后， 测序验证目的基因，然后再连入PGEX4T-1载体 中，构建金属硫蛋白的原核表达载体，重组载体 转入BL21大肠杆菌中，在含有重金属的平板上点 菌，通过观察菌株的生长状况来研究MT基因表达 与重金属耐受性间的联系。
中华补血草和德国补血草的耐盐性比较
中华补血草和德国补血草的耐盐性比较骆建霞;张婷;王娜;杨硕;苏婷;卢兴霞;刘峄【摘要】[目的]比较中华补血草(Limonium sinense Kuntze)和德国补血草(Limonnium tataricum)的耐盐能力.[方法]以中华补血草和德国补血草为试材,设置1.66(对照CK),4,6,8,10,12,14 mg/g NaCl胁迫处理,分析不同处理下2种补血草的生长情况及叶片中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和电解质外渗率等指标变化,并比较2种补血草叶片的盐腺分布特征.[结果]在1.66～8 mg/g NaCl胁迫下,2种补血草植株外部形态无明显变化;在10～14 mg/g NaCl胁迫下,随盐胁迫程度的加剧,2种补血草盐害症状加重,且德国补血草比中华补血草盐害程度深,出现盐害症状时间早.在1.66～10 mg/g NaCl胁迫下,2种补血草叶片中的MDA含量变化小,德国补血草在NaCl含量为12 mg/g时、中华补血草在NaCl 含量为14mg/g时,MDA含量上升;SOD活性均随NaCl含量的增加而先升后降,中华补血草增幅大,而德国补血草降幅大;2种补血草细胞电解质外渗率均随NaCl含量的增加而总体呈上升趋势,德国补血草上升幅度大.中华补血草叶表皮分布的盐腺直径极显著小于德国补血草,分布密度极显著大于德国补血草,盐腺面积所占比例较德国补血草大.[结论]中华补血草能耐NaCl含量为14mg/g的土壤,德国补血草能耐NaCl含量为12mg/g的土壤,中华补血草的耐盐性强于德国补血草.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(042)009【总页数】6页(P171-175,183)【关键词】盐胁迫;补血草;MDA;SOD;电解质外渗率;盐腺【作者】骆建霞;张婷;王娜;杨硕;苏婷;卢兴霞;刘峄【作者单位】天津农学院园艺系,天津300384;天津农学院园艺系,天津300384;天津农学院园艺系,天津300384;天津北林新苑绿化工程有限公司,天津300184;天津市北辰区种植业发展服务中心,天津300400;天津农学院园艺系,天津300384;天津农学院园艺系,天津300384【正文语种】中文【中图分类】Q948.113选择栽培耐盐碱、耐旱等适应性强的植物类型，是实现盐碱地优质绿化的重要途径之一。
二色补血草中2个金属硫蛋白基因的克隆及分析
ｐ ｇ ＷａｇＹ ｃｅｇ ＷａｇＢｎｆ ｇ Ｓ ｈｏ ｏ ｏｅｔ ，Ｎ ｒ ｅｓ Ｆ ｒｓ ｎｖｒｔ，Ｈａ ｉ １０４ ，Ｐ ． Ｃ ｉ ｉ ， ｎ ｕ ｈｎ ， ｎ ｉ ｅ （ ｃｏｌ ｆＦｒｓ ｙ ｏｔ ａｔ ｏ ｔ Ｕ ｉ ｓ ｙ ｎ ｇｎ ｒ ｈ ｅｒ ｙ ｅｉ ｒ ｎ ０ ０ ．Ｒ ｂ ５ ｈ—
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第 ３ ５卷 第 ８期 ２０
学
学
报
Ｖｏ ． Ｎｏ． １３５ ８
Ａｕ ｇ． ２ ０７ ０
Ｊ ＯＵＲＮ ＯＲＴ ＡＬ ＯＦ Ｎ ＨＥＡ Ｔ Ｆ Ｓ ＯＲＥ Ｔ Ｓ ＲＹ ＵＮＩ Ｒ Ｉ Ｙ ＶＥ Ｓ Ｔ
１ｃ ｌｒ ｗｅ【ｈ ｆｅ ｏ ｉ ｒ ｔｉ ｓ ８ ０ ｗｉｈ ｔ ｅ ｉｏ ｌｃｒｃ ｐ ｉ ｆ５． ｅ ｕ ａ ｉ ｔｏ ｎｃ ｎｇ ｐ ｅ ｎ ｉ ０ ０ ｔ ｈ ｓ ｅｃ ｔｉ ｏｎｔｏ ０． Ｂｏｈ ＬｂＭ Ｔ１ ｎ ｄ Ｌｂ ７ ａ ｅ １ Ｃｙ ｒ ｓｄ ｅｓ ｇ ｄ ｏ ｔ ａ Ｍ ２ ｈ ｖ ４ ｓｅ ｉ ｕ
Ｉ Ｔ１ ｇ ｎ ｓ５ ９ ｂ ｎ ｌｎｇｈ．ｉ ｌ ｄｉｇ ２ ｐ ｏ ｕ ｒ ｎ ｌｔｄ ｒｇ ｏ ｄ ３ ０ ｆ３ ｕ ｔａ ｌｔ ｄ ｒ ｇｏ ｅ ｅ ｉ ６ ｐ ｉ ｅ ｔ ｎｃｕ ｎ ３ ｂ ｆ５ ｎｔａ ｓａｅ ｅ ｉｎ ａ ０ ｂｐ ｏ ｎ ｒｎｓａｅ ｅ ｉｎ． Ｉ ａ ｎ ｎ ｔｈ ａ ｓ
二 色补 血 草 中 ２个 金属 硫 蛋 白基 因 的克 隆及 分 析 ’
李 红 艳 杨 传 平 王 玉 成 王 丙锋
（ 林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室 （ 东北林业大学）， 尔滨 ，５０ ０ 哈 １０ ４ ）
摘 要 从二 色补血草 中分 离出２个金属硫 蛋 白基 因的 ｃ Ｎ 全序 列， ＤＡ 分别命 名为 Ｌ ｎ 和 Ｌ ＭＴ 。Ｌ ｎ ｂ ｂ ２ ｂ 全 长 为 ５９ｂ ， 中 ５非 编码 区 ２ ｐ３非 编 码 区 ３０ｂ ， 放读 码框 （ Ｒ ） ２６ｂ ， 码 含 ８ 个 氨 基 酸 的蛋 白 ， ６ ｐ 其 ３ｂ ， ０ ｐ 开 Ｏ Ｆ 长 ４ ｐ 编 １ 相 对 分子 质 量 为 ８７ ， 电点 为 ４ ７ Ｌ Ｍ／ 全 长 为 ５ ３ ｐ 其 中 ５非 编码 区 ６ ｐ３非 编 码 区 ２６ ｐ 开放 读 码 框 长 ２ ００ 等 、 ；ｂ ２ ２ ， ｂ ｌ ， ｂ １ ， ｂ ６ ４ ｂ， ｐ 编码 ８ 个氨基 酸， １ 编码蛋 白的相对分子质量为 ８０ ， 电点为 ５ ０ ００ 等 ． 。这 ２个基 因编码的氨基 酸都含有 ｌ ４个半胱 氨 酸 Ｃ ｓ 分布 在 蛋 白质 的 Ｎ 端和 ｃ端 ， Ｃ Ｃ Ｃ和 Ｃ Ｘ ｙ， 呈 Ｃ、Ｘ Ｘ Ｃ形 式排 列 。疏 水性 分析 表 明 ： ２个蛋 白都 存在 ３ ４ 这 ５— ８ 个氨 基 酸之 间较 强 的疏 水 区。 通过 对 多种 植 物 的 ＭＴ蛋 白序 列 比 对 分析 表 明 ， 属 硫 蛋 白家 族 在 氨 基 酸 数 目上 保 守 金 性 差 ， 半胱 氨 酸 残基 （ ｙ） 但 Ｃ ｓ 的位 置 和数 目保 守性 达 到 １０ ， 示 了 Ｃ ｓ 金 属 硫 蛋 白 的功 能 十 分 重要 。 这 ２个基 ０％ 揭 ｙ对 因 已经在 Ｇ ｎ ａｋ上 注 册 ，ｂ ｅ ｂｎ Ｌ ｎ 基 因的 登 录 号 为 Ｅ １３ ７ ，ｂ ２ 基 因 的 Ｇ ｎ ａｋ登 录号 为 Ｅ １３７ 。 Ｆ０ ５４ Ｌ Ｍ／ ｅ ｂｎ Ｆ０ ５５ 关 键 词 二 色补 血 草 ； 因克 隆 ； 属 硫 蛋 白 基 金 分 类 号 Ｑ ８ ７５
二色补血草硫氧还蛋白(Trx)的克隆和表达分析
论等 电点（Ｉ为 ９６ Ｂ ａｔ ｐ） ． ８ ｌｓ Ｐ分析表 明二 色补血草
与拟 南芥 序 列 同源性为 ５ ％，与葡萄 序列 同源性为 ７ ％，从 ２ ６
ｌ 个物种 的氨基 酸多序 列比对可 以看 出Ｔ ｘ氨基 酸序 列保 守性较 高。实时定量 Ｒ ．Ｃ １ ｒ Ｔ Ｐ Ｒ方法检测低温、Ｎａ １ Ｐ Ｇ胁迫 Ｃ和 Ｅ 不同时间后的基 因在二 色补血草 中表达模式 的结果表明 ，Ｎ Ｃ 能诱导 Ｔｘ基 因在二 色补血草叶 中表 达 ，胁迫 ２ ａ１ ｒ ４ｈ后达到 高峰 ，而聚 乙二 醇和低温 处理 则抑 制 Ｔｘ ｒ 在二 色补血 草根 和叶 的表 达。 关键 词：二 色补血草 ；硫 氧还蛋 白；基 因克隆 ；实时荧光定量 Ｐ Ｒ Ｃ
ｕ ｔａ —ｌｔｄｒ ｇｏ ．ｔ ａ ｎｏ ｅ ａ ｉｇｆａ ｎ ｎ ｓａｅ ｉｎ Ｉ ｈ ｄａ ｐ ｎｒ ｄｎ ｒｍｅ（ ）ｏ ９ ｐａ ｄｅ ｃ ｄ ｄａｐ ｏｅｎｗｉ ６ ｍｉｏａ ｉ ｒ ｅ ｅ ＯＩ ｆ ８ｂ ｎ ｏ ｅ ｒｔｉ ｔ ２ ５ａ ｎ ｃｄ ７ ｎ ｈ
１ ０ ０．Ｃｈｉ ５０ ４ ｎａ
Ａｂｓ ｒ ｔ ｔ ａｃ ：Ｔｈｅｆ ｌｌｎ ｈ ｃ ｕｌ ｅ ｇｔ ＤＮＡ ｆａｎ ｅ ｈｉ ｒ ｄ ｉ ｓｃ ｏ ｅ ｒ ｍ ｍｏｎ ｕ ｂ ｃ ｌ ｒｃ ｏ ｏｖ ｌ ｏ ｅ ｏｘ ｎ ｗａ ｌ ｎ ｄ ｆｏ Ｌｉ ｔ ｉ ｍ ｉ ｏ ｏ ＤＮＡ ｉ ａ ｙ． ｅ ｌｂｒ ｒ Ｔ ｈ ｓ ｑ ｎｃ ｏ ｅ ｏｘ ｎ ｗａ ３８ ｂ ｎ ｌ ｎｇ ｈ， ｎｃ ｕ ｉ ２ ｆ５ ｕ ｒ ｎｓａ ｅ ｅ ｉ ｎｄ ２１ ’ ｅ ｕｅ ｅ ｏｆｔ ｒ ｄ ｉ ｓ １１ ｐ ｉ ｅ ｔ ｉ ｌ ｄ ｎｇ １ ８ ｂｐ Ｏ ’ ｎｔａ ｌ ｔ ｄ ｒ ｇ ｏｎ ａ ２ ｂｐ Ｏｆ３ ｈｉ
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ｈ 利 用半 定量 一Ｐ Ｒ技 术 对该基 因在 盐胁迫 下表 达模 式的 分析表 明 ， ３ Ｎ Ｃ 处理条 ， Ｃ 在 ％ ａ１ 件 下 ， 着盐 处理 处理 时 间的 延 长该基 因的表 达 量逐 渐 升 高 ， 盐处理 ４ 随 在 ８ｈ时表 达 量 最
高， 之后 其表 达 量 出现 下 降．
的质量 ． １ｇ 用 ｔ ｇ的中华补 血草 总 Ｒ Ａ用 于 ｃ Ｎ Ｎ ＤＡ
（ 台 大学 化 学 生 物 理 工 学 院 ， 烟 山东 烟 台 ２４ ０ ） ６ ０ ５
摘要 ：以中华补 血草 叶 片为材 料 ， 取 其 总 Ｒ Ａ 并反 转 录 ｃ Ｎ 并 以 ｃ Ｎ 提 Ｎ Ｄ Ａ， Ｄ Ａ为 模 板 ， 克 隆得 到 包含该 基 因完整 开 放 阅读框 的 ｃ Ｎ Ｄ Ａ序 列 ， 列 分 析表 明 ， 基 因开 放 阅读 框 长 序 该
助 项 目（ Ｙ ７ １ ） Ｈ ０ Ｂ６ ．
作者简介 ： 刘瑜 （９２ ） 女 ， １８ 一 ， 山东蓬莱人 ， 硕士研究生 ， 研究方 向： 植物发育分子生物学 ； 通信作者 ： 陈世华 （ｓ － ｎａ ｃｈｙ ｔ ａ ｉ ＠ １３ ｃｍ） 博士 ， ６ ．ｏ ， 副教授 ； 郭善利 （ｓ＠ｙｕ ｅｕ ｃ ） 博士 ， ｇｌ ｔ． ｄ ．ｎ ， 教授．
收 稿 日期 ： ０ ０ １—０ ２ １—２ １
（Ｌｍ ｎｕ ） ｉ ｏ ｉｍ 多年 生 泌 盐 草 本 植 物 ． 植 物 可 该
以使 盐土脱 盐 ， 改善 土壤 结构 ， 被誉 为盐 碱地 改造
的” 锋植 物 ” 本研 究从 中华 补 血草 中克 隆 出 了 先 ． 金 属硫 蛋 白基 因 ， 对该 基 因进 行 了序 列 分析 和功 能预测 ， 并分 析 了该基 因在 ３ Ｎ Ｃ 高盐 胁 迫 下 ％ ａＩ 的表达 模 式 ， 为研 究 中华 补 血 草 ＭＴ参 与 的盐 胁 迫 相关 生理 过程及 分 子应答 机 制打 下 良好 基础 ．
基金项 目：山东省 自然科学基金资助项 目（ ２０ Ｄ ６ ； Ｙ ０ ７ １ ） 国家 自然科学 基金资助项 目（０ ７ １９ ； 国农业大学植 ３８ ０ ９ ） 中
物 生 理 学 与 生物 化学 国 家 重 点 实 验 室 开 放 课 题 基 金 资 助 项 目 （ Ｋ Ｐ Ｂ Ｆ ９ ０ ） 烟 台大 学 博 士 基 金 资 Ｓ Ｌ Ｐ Ｋ ００ ８ ；
１ ３ 基 因克 隆与序 列分 析方 法 ．
１３ ３ 基 因 的序 列 分 析 方 法 ．．
用 ＮＢ Ｃ Ｉ的 Ｏ Ｆ Ｒ
（ ｔ ：／ ｗ ． ｃｉｎ ｎｈ ｇｖ ｇｒ ｇｒ ｈ １ 软 ｈｔ ／ ｗ ｗ ｎｂ． ｌ ｉ．ｏ／ ｏｆ ｏｆ ｔ ） ｐ ｍ． ／ ．ｍ
件 寻找这个金 属硫蛋 白基 因的开放读码 框． Ｐｏ 用 ｒ－
２ ９ｂ ， ４ ｐ 编码 ８ ２个氨 基酸 ； 该蛋 白含 有 ｌ ４个半胱 氨 酸 ， 主要 分 布在 蛋 白质 的 Ｎ端和 Ｃ端 ，
呈Ｃ Ｃ ＣＸ Ｃ， Ｘ， Ｘ Ｃ形式排 列 ． 预测 该蛋 白分 子质 量为 ８１３ １Ｄ； 电点为 ４ ７ ；５— ８位 ３ ． 等 ．２３ ４ 和５ ６ ２～ ８位氨 基 酸 间有 ２个较 强 的疏水 区． ３ Ｎ Ｃ 处理 补血 草植 株 ０ １ 、４ ４ 、２ 用 ％ ａ１ 、２ ２ 、８ ７
１ｓ Ｎ ８Ｒ Ａ作为 内标 ， 对
量 Ｐ Ｒ分析 ． Ｃ
基 因的表达 量进 行半 定
克隆
取温 室栽培 的 ６～ ７片 真 叶 的 中华 补 血 草
幼嫩 叶片 １０ ｍ ０ ｇ为 实验 材料 ， 用 Ｔｉ ｌ 剂 提 利 ｒｏ试 ｚ
取 总 Ｒ Ａ， Ｌ的琼 脂糖 凝 胶 电泳 检 测总 Ｒ Ａ Ｎ ８ Ｎ
中的金 属 硫 蛋 白最 早 于 １７ ９ ７年 由 Ｃ ｓ ｒｎ ａｔ ｌ ｅ和 ｅｉ
英 等 进 行 的 二 色 补 血 草 金 属 硫 蛋 白 基 因
Ｌ ＭＴ ｂ ２的研究 ， 获 得 二 色 补 血 草 Ｌ ＭＴ ， ｂ ２基 因 全
长 ｅＮ Ｄ Ａ序列 ， 分 析 了该 基 因分 别 在 不 同胁 迫 并 下 的表 达情况 ， 同时还 研究 了 Ｌ ＭＴ 因在 大肠 ｂ ２基
（ ｔ ：／ ｗ ｎｂ ｉ ｍ． ｉ． ｏ／ Ｌ Ｓ ／ 进 行 同 ｈ ｐ ／ ｗ ｗ． ｃ ．ｎ ｎｈ ｇｖ Ｂ Ａ Ｔ ） ｔ ｌ
源性搜索 ， 了 ５种 与其相 似性 高 的植 物的金属 选择 硫蛋 白基 因氨 基 酸序 列 ， ｃ ｓ Ｘ１８ 序 进行 用 ｌ ａ ． ３程 ｕｌ
多序 列 比对 ； 用 Ｐｏｃｌ （ ｔ ：／ ｗ ｅｐ ｓ． 应 ｒ ａ ｈｔ ／ ｗ ｗ． ｘａｙ Ｓ ｅ ｐ
Ｖｏ ． ４ Ｎｏ ２ １２ ． Ａｐ ． ２ １ ｒ ０１
文章 编 号 ：０４ ８ ２ （０ １ ０ － １ １ ５ １０ － ８０ ２ １ ）２ ０ ２ － ０
中 华 补 血 草 金 属 硫 蛋 白基 因 的 克 隆 及 高 盐处 理 下 的表 达 模 式 分 析
刘 瑜， 陈世 华 ， 尹海波 ， 李丽霞 ， 吉强 ， 赵 张 莹 ， 韩会玲 ， 郭善 利
关键 词 ：中华补 血草 ； 金属 硫蛋 白 ； 因克 隆 ； 基 表达 模式 ； 列分析 序
中图分 类号 ： ９ ５ Ｑ ４ 文献 标志码 ：Ａ
金 属 硫 蛋 白 （ ｅａ ｏ ｉｎｉｓ Ｍ 是 一 类 广 ｍ ｔ ｌ ｈｏ ｅ ， Ｔ） ｌｔ ｎ 泛存 在 于生 物界 的小分 子 质量 （ ６—８ｋ 非 酶 蛋 Ｄ） 白… ． 在动 物 中 ， 该蛋 白 由 Ｍ ｒｏｓｅ 和 Ｖ ｌ ｅ在 ａｇ ｈ ｓ ａｌ ｅ １５ ９ ７年 首次 发 现 于 蓄 积镉 （ ｄ 的 马 肾 中 ， 物 Ｃ ） 植
花 丹 科
（ｐＭ ６ ｇ ｎ ｃ０ Ｚｍ 口 ｅ ０ｅ ｅ） 补 血 草 属
有 效清 除 自由基 Ｉ ， 节生 长作 用 ， ４ 调 增强 对外 界 胁 迫 的适应 性 ， 与 微量元 素储 存 、 参 运输 和代谢 过
程 ． 研 究 和开 发 对农 业 、 其 医药 、 健 、 物 工 程 、 保 生 环 境保 护等 多个 领域 具有 重要 意义 ． 目前 已经 从 Ｎ Ｂ 数 据 库 中搜 索 到 车前 、 ＣＩ 番 茄 、 生 、 瓜 等 多种 植 物 的 花 西 基 因． 在 泌 盐 但 盐 生植物 中的相关 研究 则相 对较 少 ， 近年来 ， 巧 班
杆 菌 （ ｓｈ ｒ ｈａｅｌ Ｂ ２ Ｅ ｃ ｅｉ ｉ ｏｉ Ｌ １中的表 达． ｃ ） 中华 补血 草 （Ｌｍ ｎｕ ｉｅ ｓ Ｋ ｎｚ 为 白 ｉ ｏ ｉｍ ｓ ｎｅ ｕ ｔ ｎ ｅ）
Ｂ ｒｅｔ 大豆 根 中发现 ． 蛋 白富 含 Ｃ ｓ 能 结合 ａ ｔ在 ｎ 该 ｙ， 多种 重金属 离 子降 低 或 解 除 重金 属 毒 害 ； 能 并
Ｔｉ ｌ Ｒ Ａ提取试 剂 、 ｒｏ 总 Ｎ ｚ 逆转 录合 成试 剂盒 、 Ｄ Ａ片 段 回收试 剂 盒 、 ａＤ Ａ 聚合 酶 、 Ｌ ０ ０ Ｎ Ｔｑ Ｎ Ｄ２０ 、
Ｐ Ｒ扩增 得 到 的 目的条 带 经 切 胶 回 收纯 化 Ｃ 后 ， 接到 ｐ １ 一 连 ＭＤ ８ Ｔ载 体 上 ， 化 大 肠 埃 氏菌 转 Ｄ ５ 感 受态 细 胞 ，７℃ 培 养 过 夜 ， 单 菌落 扩 Ｈ ３ 挑
ｔａａ ｈｔ ：／ ｕ ｅｐｓ．ｒ ｃｉ ｉ／ ｒｔａ ｍ） Ｐｒ ｍ（ ｔ ／ ａ ．ｘ ａｙｏｇ ｇ－ ｎ ｐｏｐｒ 计 ｐ ／ ｂ ａ
算蛋 白 的 分 子 质 量 及 等 电 点． ｆｍ ７ ０（ ｔ ： Ｐａ ｌ ． ｈｔ ／ ｐ ／
ｐａ ｗ ｓ １ ｕ ｈ ｍ ｅｒｈ ｓｔ１ 程序对该基 因进 ｆ ｍ． ｕｔ ｅ ／ ｍ ｓａｃ ．ｈｍ ） ．ｄ
ＧＨ ＧＧＷ ＡＡＳ ＴＧＹＧＧＨＴＧＴＧＧ ３
ｏ ／ ｇ．ｉ／ ｒ ｓａｅ ｐ ）以 默 认 算 法 （ ｐ ｏ ． ￣ ｃｉｂｎ ｐｏ ｃｌ． １ ｇ ｔ Ｈ ｈｂ／ Ｋ ｔ Ｄ ｏ ｔｅ 进 行疏水 性分析． ｙ ＆ ｏｌｔ ） ｅ ｉｌ
１４ ３ ａ 处 理不 同时 间条 件下 ＭＴ基 因表 ． ％Ｎ Ｃｉ
特异 引物 ２ Ｓ ｅｉｃｓｎｅｐｉ ｅ ： Ｇ Ｔ Ｃ ． ｐｃ — ｓ ｒ ｒ ５Ｇ Ｃ Ｇ Ｇ ｉ ｆ ｅＳｎｅｐｉ ｅ ： Ｔ Ｔ Ｔ Ｇ Ｔ Ｙ ． ｅｓ ｒ ｒ１ ５Ａ Ｇ Ｃ Ｆ Ｙ Ｇ Ｇ ｍ
ｄＴ Ｎ Ｐ购 自 ＴＫ Ｒ （ 连 ） 司 ； ａａａ大 公 其余 常规 药 品均
为进 口或 国产分 析 纯 级 ； 引物 由上 海生 工 生 物技
术 有 限公 司合成 ．
１ ２ 材料 ．
增 培养 ， 提取质 粒 委托 北 京六 合 华 大基 因科 技股
份 有限公 司进行 测序 ．
引物 序列 ， 引物序列 如下 ．
特异 引 物 １ Ｓ ｅｉｃ ａ ｔｅ ｓ ｒ ｅ ：５ Ａ Ｇ ｐ ｃ ．ｎｉ ｎｅｐ ｍ ｒ１ Ｃ — ｉ ｆ ｓ ｉ
ＧＡＡＣＴＩ １ ＣＡＣＧＣＡＣＡＡＡ ３
ｉ ｓＳ ｎｌ／ 检测其有无信号 肽序列 ； ｃ ／ｉ ａ ） ｅ ｇ Ｐ 利用 Ｂａｔ ｌＰ ｓ
中华 补血草 种子 在 Ｍ Ｓ培 养基 上 无 菌培 养 ２ 周 至长 出 ２片 真 叶 ， 幼 苗转 移 到 洗净 的河 沙 中 将 在 温室 内培 养至 ６— ７片 真 叶期 时 ， 取 １ 选 ５盆长 势一致 的幼 苗用 于实验 ， 每个处 理设置 ３盆重 复 ， 用 ３ Ｎ Ｃ 浇灌 处理 ， 别处 理 ７ 、８ ２ 、２ ｈ ％ ａ１ 分 ２ ４ 、４ １ ， 实验 时保证 在 同一 时 间取 材进 行下一 步 的实 验．
Ｃ ＡＧＢ ＴＧＣＡＧＹＴＲＴＣＷ ＣＣＲＣＡＹ１ｒ ＡＢＣＣ ３ ＴＧＣ
用 ３ ａ１ ％Ｎ Ｃ 浇灌 全植 株 ０ １ 、４、８ ７ ， 、２ ２ ４ 、２ｈ 分