青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析
（医学专业论文）人ALEX2基因的克隆、表达与纯化及生物信息学分析
蓬麓；毖簿鹱秉承学校严谨的学风与１Ｊｃ良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究Ｔ作及取得的研究成果。
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论文作者签名日期：————缫护链识产衩葶隳本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在较攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。
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论文作者签名导师鞯坪蛔吼一一第四军医大学硕士学位论文缩略语ＡｍｐＢＬＡＳＴｂｐＢＳＡｃＤＮＡＤＡＢＤＥＰＣｄＮＴＰＤＴＴＥＢＥ．ｃｏｌｉＥＤＴＡＩＰＴＧＫｂＯＤＯＲＦＰＡＧＥ缩略语表英文全称ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｂａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌｂａｓｅｐａｉｒｂｏｖｉＲｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎｃｏＩｌｌｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｉｃＤＮＡａｃｉｄ３－３’ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅｄｉｅｔｈｙｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅｓＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌｅｔｈｉｄｕｍｂｒｏｍｉｄｅＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅ－ｔｉＣａｃｊｄｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ—Ｂ—Ｂ—ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅｋｉｌｏｂａｓｅｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙＯｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｐｏｌａｃｒｙｌａｍｉｎｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉＳｌ中文全称氨苄青霉素基本局部相似性查询软件碱基对牛血清白蛋白互补ＤＮＡ３—３’二氨基联苯胺焦碳酸二乙酯脱氧核糖核苷三磷酸二硫苏糖醇溴化乙锭大肠杆菌乙二胺四乙酸谷胱甘肽Ｓ一转移酶异丙基硫代一Ｂ—Ｄ一半乳糖苷千碱基对光密度值开放读码框聚丙烯酰胺凝胶电泳damdoc为您倾心整理(小店)(QQ@2218108823)第霾攀蔽大学矮圭学位论文ＰＢＳＲＴ—ＰＣＲＳＤＳＴｒｉＳＰｈｏｓｐｈａｔｅ—ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ磷酸盐缓冲液ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ反转录聚合酶链斌ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ反旋ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ十二烷基硫酸钠Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｌａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ三羟甲基氨基甲烷２damdoc为您倾心整理(小店)(QQ@2218108823)人ＡＬＥＸ２基因的克隆、表达与纯化及生物信息学分析硕士研究生导烬张勇炳建屡教授第四军医火举病理教研室，西安７１００３２中文摘要ＡＬＥＸ２基因（Ａｒｍｐｒｏｔｅｉｎｓｌｏｓｔｉｎｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃａｎｃｅｒｓ，Ｘｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，２），矮子ＡＬＥＸ家族戎昃，豫ＡＬＥＸ２基嚣岁｝，该家族还毯舔ＡＬＥＸｌ和ＡＬＥＸ３基阑。
小鼠可溶性ST2基因的克隆及其真核表达载体的构建
小鼠可溶性ST2基因的克隆及其真核表达载体的构建李明才;柳晓金;郑晓璇;周艳春;苏绍波【期刊名称】《医学研究生学报》【年(卷),期】2008(21)5【摘要】目的:克隆小鼠可溶性ST2基因并构建其真核表达载体. 方法:从小鼠肥大细胞株P815中提取总RNA.逆转录为cDNA,用热启动PCR技术,扩增小鼠可溶性ST2基因全长编码区,经双酶切后,克隆入pcDNA3.1载体中,构建真核表达载体pcDNA3.1-mST2,然后进行酶切鉴定和序列分析. 结果:小鼠可溶性ST2基因的PCR产物和重组载体经凝胶电泳和酶切鉴定、测序分析证实,其序列与GenBank 中数据一致.小鼠可溶性ST2基因的全长编码序列为1 011 bp,编码336个氨基酸. 结论:用热启动PCR技术能方便、准确地获得目的基因片段.成功地克隆小鼠可溶性ST2基因并构建了其真核表达载体,为进一步进行小鼠可溶性ST2蛋白的表达和功能研究奠定了基础.【总页数】4页(P458-460,图版1)【作者】李明才;柳晓金;郑晓璇;周艳春;苏绍波【作者单位】汕头大学医学院炎症与免疫性疾病研究所,广东汕头515041;汕头大学医学院炎症与免疫性疾病研究所,广东汕头515041;汕头大学医学院炎症与免疫性疾病研究所,广东汕头515041;汕头大学医学院炎症与免疫性疾病研究所,广东汕头515041;汕头大学医学院炎症与免疫性疾病研究所,广东汕头515041【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.小鼠14-3-3ε蛋白基因的克隆及其真核表达载体的构建 [J], 孟峻;侯艳军;唐韬;张永梅;刘珊;刘洋;呼格吉乐2.小鼠FABP3基因全长cDNA的克隆、真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达 [J], 徐力致;李励芸;齐秋锋;闻娟;陈慧梅3.人可溶性血管内皮生长因子受体1基因克隆及真核表达载体的构建 [J], 吴荣耀;郑冬;郑朝旭4.小鼠结缔组织生长因子基因克隆及其真核表达载体构建 [J], 彭渊;罗俊生;霍晓川;关宁5.大鼠NeuroD2基因的克隆、真核表达载体的构建及其在小鼠MSCs细胞中的表达 [J], 姬菩忠;赵兴绪;秦文;宋学文;张勇;赵红斌因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
GAPC2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
Ａｒｓｏ ｍ ｅ ｃ ；其 他 常用 试 剂 购 于成 都 博瑞 克 生 物 公 司 。 １ ２ 方 法 ． １ ２ １ 基 因 全 长的扩 增 根 据 Ｎ Ｂ 上 已发表 的Ｇ Ｐ ２的基 因序 列 ．． ＣＩ ＡＣ 设 计特 异 性 引物 ，引 物序 列如 下 ：
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Ｌ１ ａ的 Ｂ 三 磷 酸 一 油 醛 脱 氢 酶 （ ｌ Ｃ ｒ １ ｅ ｙ ｅ ３ Ｐ ０ Ｐ ａ ｅ Ｇ Ｐ ２ 化 大 肠 杆 菌 Ｂ ２ 感 受 态 细 胞 中 ，在 含 有 Ｋ ｎ Ｌ 平 板 上 甘 Ｇ Ｙ ｅ ｅ ｄ ｈ ｄ 一 一 ｈ ｈ ｔ Ａ Ｃ 转 Ｓ ｄｈｄｏｅａｅ ｅｙｒｇｎｓ， 忉 是 高 等植 物 体 内糖 酵 解 和 糖异 生 途 径 中 培 养 过 夜 。挑 取 菌 落进 行Ｐ Ｒ 定 ，０ ８ 的琼 脂 糖凝 胶 电泳 检 测 Ｃ鉴 ．％ 的 关 键 酶 ，能 够 催 化 ３ 磷 酸 甘 油 醛 转 变 为 １ ３ 二 磷 酸 甘 油 酸 。 一 ，一 目的条 带 大 小 。 ．． 位于细胞质中 的 是 由４ 同种 亚基 个 组 成 的 多 聚 体 ，而 １ ２ ４ 融 合 蛋 白的 诱 导 表 达 挑 取 单 个 含 表 达 质 粒 的 阳 性 菌 落
１材 料 与 方 法
１ １ 材 料 ．
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牡丹PsAP2基因的克隆及表达
摘
要 ： 以 牡 丹 品种 ‘ 粉 ’ 试 材 ， 用 Ｒ — ＣＲ和 ＲＡＣ 赵 为 采 ＴＰ Ｅ方 法 从 花瓣 中 获 得 １个 牡 丹 Ａ ＥＴ Ｌ ２基 因 ｃ Ｐ ＡＡ ＤＮＡ全
长 ， 名 为 命
Ｐ ， ｅＢ ｎ 登 录 号 为 Ｈ ６ ５ １ ２ Ｇｎ ａｋ Ｍ１ ７ １ 。序 列 分 析 结 果 表 明 ： Ｐ Ｐ ２全 长 ２１ ８ｂ ， 含 ４ ｐ的 ５ 非 编 码 ３ ｐ 包 ７ｂ
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松褐天牛、棉卷叶野螟泛素基因的克隆与表达的开题报告
松褐天牛、棉卷叶野螟泛素基因的克隆与表达的开题报告
一、研究背景和意义
松褐天牛和棉卷叶野螟是两种重要的害虫，它们能够在林业和农业生产中造成巨大的经济损失。
目前，研究表明泛素在调节昆虫生长发育、免疫、生殖等多个生理功
能中发挥重要作用，因此克隆和表达松褐天牛和棉卷叶野螟泛素基因，对于深入研究
其生物学特性、开发特异性杀虫剂等方面具有重要的理论和实际意义。
二、研究内容和方法
1. 克隆松褐天牛和棉卷叶野螟泛素基因。
通过生物信息学技术，设计引物并进行PCR扩增，克隆出松褐天牛和棉卷叶野螟泛素基因的全长cDNA序列。
2. 构建表达载体。
选用高表达载体pET-28a，将松褐天牛和棉卷叶野螟泛素基因克隆到该载体中。
3. 表达并纯化蛋白。
将重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，在IPTG诱导条件下进行表达，利用亲和层析柱纯化表达的松褐天牛和棉卷叶野螟泛素蛋白。
4. 常规分子生物学技术分析蛋白表达特性。
利用Western blot、SDS-PAGE等分子生物学技术分析表达的泛素蛋白的分子量、纯度等特性。
三、预期结果和意义
通过克隆和表达松褐天牛和棉卷叶野螟泛素基因，在分析其结构和生物学特性的同时，为研究它们的生长发育、免疫、生殖等重要生理功能提供了有力的工具和基础，为研发特异性杀虫剂提供了新的研究思路，具有广阔的应用前景和意义。
8个小麦WRKY转录因子基因的克隆、表达及转录活性分析
独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。
对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。
本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。
学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。
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保密□，在年解密后适用本授权书。
本论文属于不保密☑。
（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日华中科技大学硕士学位论文摘要WRKY是植物中一类最大的转录因子家族之一。
WRKY转录因子的C末端有一个锌指结构，N端含有一个约由60个氨基酸残基组成的WRKYGQK结构域，WRKY 转录因子家族因这些结构特征而命名。
研究表明，WRKY转录因子参与多种植物的生长发育、植物应激反应、生物胁迫和非生物胁迫等。
但是，目前涉及小麦WRKY 基因的相关报道并不多，对小麦WRKY家族成员现阶段还缺少系统的鉴定、表达分析和功能研究。
本研究在实验室前期有关小麦WRKY基因工作的基础上，首先在DFCI、NCBI 和Ensembl数据库中搜索具有WRKY结构域的小麦EST序列，通过序列拼接得到9个新的WRKY基因的序列信息；进而以小麦的cDNA为模板，通过RT-PCR的方法克隆得到9个WRKY新基因的cDNA序列。
我们将其分别命名为TaWRKY45 -TaWRKY53。
生物信息学结果显示，这9个TaWRKY转录因子都含有保守的WRKY 结构域和锌指结构，它们分属于3个亚类：其中TaWRKY45属于第I亚类，TaWRKY48、TaWRKY51、TaWRKY52和TaWRKY53属于第II亚类，TaWRKY47、TaWRKY49和TaWRKY50属于第III亚类。
柞蚕核型多角体病毒ptp-2基因克隆及表达
柞蚕 核 型 多角体 病 毒 ｐ ｐ２基 因克 隆及 表 达 ｔ－
石 生林 ， 潘敏 慧 鲁 成 ，
（ ． 南 大学 农 业 部 蚕 桑 学 重 点 实 验 室 ， 庆 ４ ０ １ ２ 沈 阳 农 业 大 学 生物 科 学 技 术 学 院 ， 宁 沈 阳 １０ ６ ） １西 重 ０ ７ ６； ． 辽 １ １ １
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关 键 词 ： 型 多角 体 病 毒 ；基 因 表 达 ； 因 克 隆 ； 蚕 ； ｔ－ 因 核 基 柞 ｐ ｐ２基
中 图分 类 号 ： ３ Ｑ９ 文献标识码 ： Ａ
麻风树JcHDZ28_基因克隆与功能分析
江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２４ꎬ４０(１):３９￣４６ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ唐跃辉ꎬ赵雨凡ꎬ蒋心言ꎬ等.麻风树ＪｃＨＤＺ２８基因克隆与功能分析[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２４ꎬ４０(１):３９￣４６.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２４.０１.００４麻风树ＪｃＨＤＺ２８基因克隆与功能分析唐跃辉ꎬ㊀赵雨凡ꎬ㊀蒋心言ꎬ㊀张英颖ꎬ㊀王㊀寒ꎬ㊀包欣欣ꎬ㊀范雨杰ꎬ㊀李㊀彤(周口师范学院生命科学与农学学院ꎬ河南周口４６６００１)收稿日期:２０２３￣０９￣０２基金项目:河南省高等学校重点科研项目(２４Ａ１８００２９)ꎻ河南省周口师范学院大学生创新创业训练计划项目(２０２２１０４７８０３８㊁２０２２１０４７８０４０)作者简介:唐跃辉(１９８５－)ꎬ男ꎬ河南许昌人ꎬ博士ꎬ副教授ꎬ主要从事植物基因克隆与功能研究ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｙｈｔａｎｇ２００５＠１６３.ｃｏｍ㊀㊀摘要:㊀ＨＤ￣Ｚｉｐ家族基因与植物的生长和对环境胁迫的抗性密切相关ꎬ被认为是作物改良的关键因子ꎮ在本研究中ꎬ我们通过ＲＴ￣ＰＣＲ技术从麻风树中克隆了１个ＨＤ￣Ｚｉｐ家族基因ꎬ命名为ＪｃＨＤＺ２８ꎮＪｃＨＤＺ２８基因包含１个８８２ｂｐ的开放阅读框ꎬ编码１个含有２９３个氨基酸的蛋白质ꎮ氨基酸序列分析结果表明ꎬＪｃＨＤＺ２８含有高度保守的同源结构域和亮氨酸拉链(ＬＺ)基序ꎮ表达模式分析结果表明ꎬＪｃＨＤＺ２８基因在种子中的相对表达量最高ꎬ且盐胁迫下调该基因的表达ꎮ亚细胞定位分析结果表明ꎬＪｃＨＤＺ２８基因编码１个核定位蛋白ꎮ过表达ＪｃＨＤＺ２８基因增加了转基因拟南芥对盐胁迫的敏感性ꎬ且在盐胁迫条件下ꎬ转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥叶片脯氨酸含量显著低于野生型拟南芥ꎬ相对电导率显著高于野生型拟南芥ꎬ非生物胁迫相关基因在转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥中的表达也显著低于在野生型拟南芥中的表达ꎮ本研究结果可以为进一步阐明ＨＤ￣Ｚｉｐ转录因子基因ＪｃＨＤＺ２８在麻风树生长发育和响应非生物胁迫中的功能提供理论依据ꎮ关键词:㊀麻风树ꎻＪｃＨＤＺ２８ꎻＨＤ￣Ｚｉｐꎻ盐胁迫ꎻ转基因拟南芥中图分类号:㊀Ｓ５１１㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２４)０１￣００３９￣０８ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＪｃＨＤＺ２８ｇｅｎｅｆｒｏｍＪａｔｒｏｐｈａｃｕｒｃａｓＬ.ＴＡＮＧＹｕｅ￣ｈｕｉꎬ㊀ＺＨＡＯＹｕ￣ｆａｎꎬ㊀ＪＩＡＮＧＸｉｎ￣ｙａｎꎬ㊀ＺＨＡＮＧＹｉｎｇ￣ｙｉｎｇꎬ㊀ＷＡＮＧＨａｎꎬ㊀ＢＡＯＸｉｎ￣ｘｉｎꎬ㊀ＦＡＮＹｕ￣ｊｉｅꎬ㊀ＬＩＴｏｎｇ(ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＡｇｒｏｎｏｍｙꎬＺｈｏｕｋｏｕＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＺｈｏｕｋｏｕ４６６００１ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀ＴｈｅｇｅｎｅｓｏｆＨＤ￣Ｚｉｐｆａｍｉｌｙａｒｅｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈａｎｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓｔｒｅｓｓꎬａｎｄａｒｅｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄｔｏｂｅｋｅｙｆａｃｔｏｒｓｉｎｃｒｏｐｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ.ＩｎｔｈｅｓｔｕｄｙꎬｗｅｃｌｏｎｅｄａＨＤ￣ＺｉｐｆａｍｉｌｙｇｅｎｅｆｒｏｍＪａｔｒｏｐｈａｃｕｒｃａｓＬ.ｕｓｉｎｇＲＴ￣ＰＣＲｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬａｎｄｎａｍｅｄＪｃＨＤＺ２８.ＴｈｅＪｃＨＤＺ２８ｇｅｎｅｃｏｎｔａｉｎｅｄａｎｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｏｆ８８２ｂｐꎬａｎｄｅｎｃｏｄｅｄａｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈ２９３ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ.ＡｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＪｃＨＤＺ２８ｃｏｎｔａｉｎｅｄａｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄｈｏｍｏｌｏｇｕｓｄｏｍａｉｎａｎｄｌｅｕｃｉｎｅｚｉｐｐｅｒ(ＬＺ)ｍｏｔｉｆ.ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＪｃＨＤＺ２８ｇｅｎｅｗａｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｉｎｓｅｅｄｓꎬａｎｄｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｉｓｇｅｎｅ.ＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＪｃＨＤＺ２８ｇｅｎｅｅｎｃｏｄｅｄａｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ.ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＪｃＨＤＺ２８ｇｅｎｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｏｓａｌｔｓｔｒｅｓｓ.Ｕｎｄｅｒｓａｌｔｓｔｒｅｓｓꎬｔｈｅｐｒｏｌｉｎｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｗｉｌｄｔｙｐｅꎬａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｗｉｌｄｔｙｐｅ.Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓ￣ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｉｎＪｃＨＤＺ２８ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｗａｓａｌｓｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｗｉｌｄｔｙｐｅ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｃａｎｐｒｏｖｉｄｅａｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｅｌｕｃｉｄａｔｉｎｇｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＨＤ￣ＺｉｐｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｇｅｎｅＪｃＨＤＺ２８ｉｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈꎬｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｉｎＪａｔｒｏｐｈａｃｕｒ￣ｃａｓＬ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ＪａｔｒｏｐｈａｃｕｒｃａｓＬ.ꎻＪｃＨＤＺ２８ꎻＨＤ￣ＺｉｐꎻｓａｌｔｓｔｒｅｓｓꎻｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ９３㊀㊀非生物胁迫如干旱㊁高温㊁低温㊁氧化胁迫㊁高盐等都会降低作物产量ꎬ给农业生产造成重大的经济损失ꎮ为了适应这些极端环境条件ꎬ植物在生理㊁代谢㊁形态和分子水平上进化出复杂的调控机制ꎬ通过激活或者抑制胁迫相关基因的表达使得植物在这些极端条件下能够更好地生存[１]ꎮ研究结果表明ꎬ一些转录因子如ＭＹＢ㊁ＮＡＣ㊁ＨＤ￣Ｚｉｐ㊁ＡＰ２/ＥＲＦ㊁ＷＲＫＹ㊁ｂＺＩＰ等家族成员参与调控植物生长发育和逆境胁迫的调控[１￣６]ꎮＨＤ￣Ｚｉｐ蛋白是植物特异性转录因子ꎬ具有１个由６１个氨基酸组成的高度保守的同源结构域(ＨＤ)ꎬ以及１个与ＨＤ的羧基端紧密相连的亮氨酸拉链(ＬＺ)元件ꎮＨＤ负责特异性ＤＮＡ序列结合ꎬ调控下游基因的转录ꎮＬＺ元件协助ＨＤ￣Ｚｉｐ蛋白特异性识别目标ＤＮＡ序列ꎬ起到二聚化的作用[１ꎬ７]ꎮ植物ＨＤ￣Ｚｉｐ转录因子最先在玉米中被发现ꎬ编码１个涉及叶片发育的ＨＤ￣ＺｉｐＩ类的转录因子[７]ꎮ之后ꎬＨＤ￣Ｚｉｐ基因在不同的植物中被发现ꎬ并通过构建这类基因的功能缺失突变体或功能获得突变体对其功能进行了研究ꎬ结果表明ＨＤ￣Ｚｉｐ蛋白在植物生长发育和逆境胁迫的调控中扮演重要的角色[６￣８]ꎮ例如ꎬＴａＨＤＺｉｐｌ￣２正调控小麦花期和穗的发育[９]ꎻｏｓｈｏｘ３３突变体通过改变ＧＳ１和ＧＳ２的表达呈现出叶片衰老的表型[１０]ꎻＡｔＨＢ１２是一种潜在的关键调节因子ꎬ参与植物叶片发育的调节[１１]ꎮ除此之外ꎬ许多研究结果表明ＨＤ￣Ｚｉｐ蛋白也参与调节植物对非生物胁迫的响应[１２￣１３]ꎮ提高ＴａＨＤＺｉｐＩ￣５基因的表达水平增强了转基因小麦对干旱胁迫和冷胁迫的抗性[１２]ꎻ提高ＯｓＨＯＸ２４基因的表达水平增强了转基因水稻抗旱㊁抗盐能力[１３]ꎻ玉米ＨＤ￣Ｚｉｐ家族基因Ｚｍｈｄｚ１０通过调控干旱胁迫相关基因的表达正调控转基因拟南芥对干旱胁迫的响应[１４]ꎮ尽管许多物种ＨＤ￣Ｚｉｐ基因家族成员已被克隆并进行功能分析ꎬ然而ꎬ麻风树中参与生长发育和胁迫调控的ＨＤ￣Ｚｉｐ基因仍然有待挖掘和进一步研究ꎮ麻风树又名小桐子ꎬ由于其具有生长快㊁适应性强㊁耐贫瘠㊁耐干旱㊁耐盐碱㊁种仁含油量高等特点成为生产生物柴油的明星物种ꎬ越来越引起科学家的重视[１５]ꎮ因此ꎬ本研究拟从麻风树中挖掘响应盐胁迫的ＨＤ￣Ｚｉｐ家族基因并对其调控的分子机制进行研究ꎬ以期为麻风树耐盐品种的培育提供理论依据ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀植物材料与胁迫处理试验材料为麻风树自交系品种ＧＺＱＸ０４０１和拟南芥Ｃｏｌｕｍｂｉａ￣０ꎮ选取６叶期麻风树的根㊁茎㊁叶㊁花和授粉后３５ｄ的种子进行ＪｃＨＤＺ２８基因组织特异性表达分析ꎮ盐胁迫试验ꎬ对６叶期麻风树直接浇灌１５０ｍｍｏｌ/Ｌ的ＮａＣｌ溶液ꎬ选取胁迫处理０ｈ㊁２ｈ㊁６ｈ㊁１２ｈ和２４ｈ的第４片叶ꎬ－８０ħ保存备用ꎮ１.２㊀ＪｃＨＤＺ２８基因序列分析麻风树ＪｃＨＤＺ２８序列和该基因在别的物种中的同源基因均来自于ＮＣＢＩ(美国国立生物技术信息中心)ꎬＪｃＨＤＺ２８在拟南芥中的同源基因来自ＴＡＩＲ数据库ꎮ采用ＤＮＡＭＡＮ９.０软件进行蛋白质氨基酸序列分析ꎮ１.３㊀ＪｃＨＤＺ２８基因亚细胞定位以麻风树叶片ｃＤＮＡ为模版ꎬ通过ＲＴ￣ＰＣＲ技术克隆获得不含终止密码子的ＪｃＨＤＺ２８编码序列ꎬ随后将其连接到ｐＢＷＡ(Ｖ)ＨＳ￣ＧＬｏｓｇｆｐ载体构建ｐＢＷＡ(Ｖ)ＨＳ￣ＪｃＨＤＺ２８￣ＧＬｏｓｇｆｐ融合表达载体ꎮ将构建好的ｐＢＷＡ(Ｖ)ＨＳ￣ＪｃＨＤＺ２８￣ＧＬｏｓｇｆｐ载体和ｐＢＷＡ(Ｖ)ＨＳ￣ＧＬｏｓｇｆｐ载体通过聚乙二醇(ＰＥＧ)介导转入拟南芥原生质体细胞ꎬ在共聚焦扫描显微镜(ＬｅｉｃａＴＣＳＳＰ８)上获得定位样品的荧光图像ꎮ聚乙二醇介导的转化和原生质体制备参照文献[１６]的方法进行ꎮ１.４㊀基因克隆与转基因植株构建以麻风树叶片ｃＤＮＡ为模版ꎬ通过ＲＴ￣ＰＣＲ技术克隆获得ＪｃＨＤＺ２８基因的全长编码序列ꎬ测序后ꎬ将测序正确的序列连接到ｐ１３０１载体ＫｐｎＩ和ＸｂａＩ的酶切位点之间ꎬ构建３５Ｓ::ＪｃＨＤＺ２８￣ｐ１３０１植物表达载体ꎮ然后通过ＧＶ３１０１介导的花序浸染法将３５Ｓ::ＪｃＨＤＺ２８￣ｐ１３０１载体转化到拟南芥中获得转基因植株[１４]ꎮ通过潮霉素㊁β￣葡萄糖苷酸酶(ＧＵＳ)染色和ＲＴ￣ＰＣＲ确定有效ＪｃＨＤＺ２８转基因植株用于后续试验研究ꎬ以期为麻风树耐盐品种的培育提供理论依据ꎮ１.５㊀转ＪｃＨＤＺ２８基因植株盐胁迫分析首先用潮霉素将野生型拟南芥和转ＪｃＨＤＺ２８基因植株种子消毒ꎬ４ħ暗处理２ｄ后ꎬ将拟南芥Ｃｏｌｕｍｂｉａ￣０(ＷＴꎬ野生型)和转ＪｃＨＤＺ２８基因植株种０４江苏农业学报㊀２０２４年第４０卷第１期子点播到１/２ＭＳ和含有１００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ的１/２ＭＳ培养基中ꎬ置于２２ħ生长间中生长(１６ｈ光照/８ｈ黑暗)ꎬ２０ｄ后观察表型ꎮ１.６㊀生理指标分析选用盐胁迫处理１５ｄ的野生型拟南芥和转ＪｃＨＤＺ２８基因植株叶片进行相对电导率和脯氨酸含量测定ꎮ相对电导率的测定方法参照文献[１４]ꎬ脯氨酸含量测定方法参照文献[１７]ꎮ１.７㊀ＲＮＡ提取和定量ＰＣＲ分析ＲＮＡ采用ＴＲＩｚｏｌ试剂进行提取ꎬ采用ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆转录酶试剂盒合成第一链ｃＤＮＡꎬ具体操作方法参照试剂盒使用说明书进行ꎮ采用ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭＩＩ试剂盒和ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０定量ＰＣＲ仪进行ｑＲＴ￣ＰＣＲ检测ꎮ基因相对表达量采用２－әәＣｔ方法进行计算ꎮ本研究所用引物信息见表１ꎮ表１㊀本研究所用引物Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ基因㊀㊀㊀㊀㊀引物序列(５ᶄң３ᶄ)㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀目的ＪｃＨＤＺ２８Ｆ:ＧＴＧＡＧＣＧＴＧＴＴＧＣＧＧＴＣＣＣＲ:ＣＧＡＡＣＧＧＴＣＣＴＧＧＴＧＴＧＡＴＧ基因表达量检测Ｐ５ＣＳ１Ｆ:ＧＣＣＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＧＡＧＡＧＧＴＲ:ＴＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＣＡ基因表达量检测ＳＮＡＣ１Ｆ:ＧＴＣＡＡＧＡＣＴＧＡＴＴＧＧＡＴＣＡＴＧＣＲ:ＣＣＡＡＴＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＡＧＡＧＡ基因表达量检测ＡｔＣＡＴＡＦ:ＴＧＧＡＧＣＴＡＣＴＡＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＡＡＣＴＧＲ:ＴＧＧＣＡＴＣＧＧＡＡＧＣＣＡＧＡＡ基因表达量检测ＬＥＡ３Ｆ:ＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＴＣＧＧＴＧＧＧＡＴＣＲ:ＣＡＣＧＣＡＴＧＴＴＴＡＣＧＧＧＴＴＴＣ基因表达量检测ＪｃＡｃｔｉｎＦ:ＴＡＡＴＧＧＴＣＣＣＴＣＴＧＧＡＴＧＴＧＲ:ＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＣ内参基因ＡｔＡｃｔｉｎ２Ｆ:ＧＣＡＣＣＣＴＧＴＴＣＴＴＣＴＴＡＣＣＧＲ:ＡＡＣＣＣＴＣＧＴＡＧＡＴＴＧＧＣＡＣＡ内参基因ＪｃＨＤＺ２８Ｆ:ＡＴＧＡＴＧＧＴＴＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴＴＲ:ＴＴＡＣＧＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＡＧＧ编码区序列片段克隆ＪｃＨＤＺ２８Ｆ:ＡＴＧＡＴＧＧＴＴＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴＴＲ:ＣＧＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＡＧＧＧＣ亚细胞定位片段克隆２㊀结果与分析２.１㊀ＪｃＨＤＺ２８基因的生物信息学分析设计特异性引物ꎬ以麻风树叶ｃＤＮＡ为模版ꎬ通过ＲＴ￣ＰＣＲ克隆获得ＪｃＨＤＺ２８基因编码区序列ꎬ测序并通过ＮＣＢＩ比对ꎬ结果表明ꎬＪｃＨＤＺ２８基因编码区序列(ＣＤＳ)全长８８２ｂｐꎬ编码２９３个氨基酸ꎮ我们进一步通过ＤＮＡＭＡＮ软件对ＪｃＨＤＺ２８及其与在别的物种中的同源基因的相似性进行了分析ꎬ结果表明ꎬ麻风树ＪｃＨＤＺ２８蛋白与拟南芥㊁玉米和水稻中的ＨＤ￣Ｚｉｐ家族成员高度同源ꎬ且均含有高度保守的ＨＤ和ＬＺ基序(图１)ꎮ２.２㊀ＪｃＨＤＺ２８基因的表达模式分析为了进一步研究ＪｃＨＤＺ２８在植物生长发育中的作用ꎬ我们使用ｑＲＴ￣ＰＣＲ分析了ＪｃＨＤＺ２８基因在根㊁茎㊁叶㊁花和种子中的表达模式ꎬ结果表明ꎬ在所有被检测的器官中都检测到ＪｃＨＤＺ２８的表达ꎬ且ＪｃＨＤＺ２８基因在生殖器官(花和种子)中的相对表达量较高(图２ａ)ꎮ我们进一步检测了ＪｃＨＤＺ２８基因在盐胁迫下的表达模式ꎬ结果表明ꎬＪｃＨＤＺ２８基因在盐胁迫２ｈ㊁６ｈ㊁１２ｈ和２４ｈ的相对表达量均显著低于盐胁迫０ｈ的相对表达量ꎬ且盐胁迫２４ｈ的相对表达量相比盐胁迫６ｈ㊁１２ｈ有所提高(图２ｂ)ꎮ该结果进一步表明ꎬＪｃＨＤＺ２８基因也许在植物响应盐胁迫中起重要的调控作用ꎮ２.３㊀ＪｃＨＤＺ２８蛋白的亚细胞定位为了检测ＪｃＨＤＺ２８蛋白的亚细胞定位ꎬ我们构建了３５Ｓ::ＪｃＨＤＺ２８￣ＧＬｏｓｇｆｐ融合表达载体ꎮ随后将构建好的质粒连同３５Ｓ::ＧＦＰ质粒一起转化到拟南芥原生质体细胞ꎬ在共聚焦扫描显微镜上获得定位样品的荧光图像ꎮ结果(图３)表明ꎬ３５Ｓ::ＧＦＰ质粒在所有细胞中都可以检测到荧光信号ꎬ然而ꎬ１４唐跃辉等:麻风树ＪｃＨＤＺ２８基因克隆与功能分析３５Ｓ::ＪｃＨＤＺ２８￣ＧＦＰ质粒只在细胞核中检测到了明亮的绿色信号ꎮ这些结果表明ꎬＪｃＨＤＺ２８蛋白定位于细胞核中ꎮＯｓｈｏｘ１表示水稻中的ＨＤ￣Ｚｉｐ家族蛋白ꎻＺｍｈｄｚ２５表示玉米中的ＨＤ￣Ｚｉｐ家族蛋白ꎻＡｔＨＢ２表示拟南芥中的ＨＤ￣Ｚｉｐ家族蛋白ꎮ图１㊀ＪｃＨＤＺ２８蛋白质氨基酸序列分析Ｆｉｇ.１㊀ＡｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＪｃＨＤＺ２８ｐｒｏｔｅｉｎａ:ＪｃＨＤＺ２８基因组织特异性表达ꎻｂ:ＪｃＨＤＺ２８基因在盐胁迫条件下的表达模式分析ꎮ∗∗表示在盐胁迫２ｈ㊁６ｈ㊁１２ｈ㊁２４ｈ与０ｈ相比差异极显著(Ｐ<０ ０１)ꎮ图２㊀ＪｃＨＤＺ２８基因表达模式分析Ｆｉｇ.２㊀ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＪｃＨＤＺ２８ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅ２.４㊀转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥表型分析为了进一步研究ＪｃＨＤＺ２８基因的功能ꎬ我们构建了过表达转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥植株ꎮＲＴ￣ＰＣＲ结果表明ꎬ检测到ＪｃＨＤＺ２８基因在转基因株系中高表达ꎬ在野生型中没有检测到表达(图４ａ)ꎮ表型分析结果表明ꎬ过表达ＪｃＨＤＺ２８不影响拟南芥地上部分生长发育(图４ｂ)ꎮ开花时间统计结果表明ꎬ转ＪｃＨＤＺ２８基因植株开花时间与野生型相比没有显著差异ꎬ表明过表达ＪｃＨＤＺ２８不影响拟南芥开花时间(图４ｃ)ꎮ这些结果表明ꎬＪｃＨＤＺ２８基因不影响转基因拟南芥地上部分的生长和发育ꎮ２.５㊀转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥盐胁迫抗性分析ｑＲＴ￣ＰＣＲ结果表明盐胁迫抑制ＪｃＨＤＺ２８基因的表达(图２ｂ)ꎬ因此我们推测ＪｃＨＤＺ２８也许参与植物对盐胁迫的响应ꎮ为了证明这个假设ꎬ我们进２４江苏农业学报㊀２０２４年第４０卷第１期图３㊀ＪｃＨＤＺ２８蛋白亚细胞定位分析Ｆｉｇ.３㊀ＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＪｃＨＤＺ２８ｐｒｏｔｅｉｎａ:ＪｃＨＤＺ２８基因在野生型拟南芥和转基因拟南芥中的表达情况ꎻｂ:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株表型分析ꎻｃ:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株开花时间统计ꎮＷＴ:野生型ꎻＯＥ１:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株１号株系ꎻＯＥ２:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株２号株系ꎻＯＥ３:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株３号株系ꎮ图４㊀转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥表型分析Ｆｉｇ.４㊀ＰｈｅｎｏｔｙｐｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＪｃＨＤＺ２８ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ一步检测了野生型和转基因植株对盐胁迫的抗性ꎮ我们将消毒后的野生型和转ＪｃＨＤＺ２８基因植株直接点播到１/２ＭＳ和含有１００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ的１/２ＭＳ培养基中生长２０ｄꎮ结果表明ꎬ在盐胁迫条件下ꎬ转基因拟南芥植株大小明显小于野生型拟南芥植株大小ꎬ叶片白化更严重(图５ａ)ꎬ存活率极显著低于野生型拟南芥(图５ｂ)ꎮ生理指标测定结果表明ꎬ在盐胁迫条件下ꎬ转基因拟南芥植株叶片相对电导率极显著高于野生型拟南芥(图５ｃ)ꎬ脯氨酸含量极显著低于野生型拟南芥(图５ｄ)ꎮ这些结果表明ꎬ过表达ＪｃＨＤＺ２８降低了转ＪｃＨＤＺ２８基因植株对盐胁迫的抗性ꎮ２.６㊀盐胁迫条件下非生物胁迫相关基因表达为了进一步阐明ＪｃＨＤＺ２８调控拟南芥响应盐胁迫的分子机理ꎬ我们通过ｑＲＴ￣ＰＣＲ技术检测了ＳＮＡＣ１㊁ＡｔＣＡＴＡ㊁ＬＥＡ３㊁Ｐ５ＣＳ１等胁迫相关基因的表达ꎮ结果表明ꎬ在正常生长条件下ꎬＳＮＡＣ１㊁ＡｔＣＡ￣ＴＡ㊁ＬＥＡ３㊁Ｐ５ＣＳ１在野生型拟南芥和转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥植株中的相对表达量没有显著差异ꎬ然而ꎬ在盐胁迫条件下ꎬ这些基因在转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南３４唐跃辉等:麻风树ＪｃＨＤＺ２８基因克隆与功能分析芥植株中的相对表达量显著低于在野生型拟南芥中的相对表达量(图６)ꎮ这些结果表明ꎬ盐胁迫条件下ꎬ过表达ＪｃＨＤＺ２８增加转基因拟南芥对盐胁迫的敏感性也许是通过改变这些非生物胁迫相关基因的表达引起的ꎮａ:野生型拟南芥和转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥在正常生长和盐胁迫(１００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ)条件下的生长分析ꎻｂ:成活率分析ꎻｃ:相对电导率分析ꎻｄ:脯氨酸含量分析ꎮＷＴ:野生型ꎻＯＥ１:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株１号株系ꎻＯＥ２:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株２号株系ꎻＯＥ３:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株３号株系ꎮ∗∗表示在盐胁迫条件下转基因植株与野生型植株相比差异极显著(Ｐ<０ ０１)ꎮ图５㊀转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥对盐胁迫的抗性分析Ｆｉｇ.５㊀ＲｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＪｃＨＤＺ２８ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｏｓａｌｔｓｔｒｅｓｓＷＴ:野生型ꎻＯＥ１:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株１号株系ꎻＯＥ２:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株２号株系ꎻＯＥ３:转ＪｃＨＤＺ２８基因植株３号株系ꎮ图６㊀盐胁迫条件下相关基因的表达水平Ｆｉｇ.６㊀Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｕｎｄｅｒｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ４４江苏农业学报㊀２０２４年第４０卷第１期３㊀讨论ＨＤ￣Ｚｉｐ基因是植物特异性转录因子基因ꎬ这些转录因子基因在植物生长发育(如胚胎发生㊁分生组织调控等)和非生物胁迫(如高盐㊁干旱等)过程中发挥重要的作用[１]ꎮ尽管许多ＨＤ￣Ｚｉｐ转录因子基因在拟南芥㊁水稻和别的物种中的功能已经被阐述ꎬ但是ＨＤ￣Ｚｉｐ基因在大戟科尤其是麻风树中的研究较少ꎮ在本研究中ꎬ我们克隆了麻风树ＪｃＨＤＺ２８基因(１个ＨＤ￣Ｚｉｐ家族基因的成员)并分析了该基因的功能ꎬ在拟南芥中超表达ＪｃＨＤＺ２８增加了转基因植物对盐胁迫的敏感性ꎮ前人研究结果表明ꎬ超表达ＨＤ￣Ｚｉｐ家族基因能够改变转基因植物对非生物胁迫的抗性[１２￣１５]ꎮ在水稻中ꎬ过表达ＨＤ￣Ｚｉｐ家族基因增加了转基因水稻对非生物胁迫的敏感性[１５]ꎮ与此相似ꎬ在本研究中ꎬ转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥在盐胁迫条件下的植株大小和存活率均低于野生型拟南芥ꎮ前人研究结果表明ꎬ当植物遭遇非生物胁迫的时候ꎬ其体内的一些生理指标迅速变化使得植物能够更好地应对这些极端环境条件[１２￣１４]ꎮ因此ꎬ生理指标可以用来衡量植物对非生物胁迫的抗性ꎮ相对电导率是植物遭受逆境胁迫时其细胞膜损伤程度的重要评价因子[１５]ꎮ本研究结果表明ꎬ转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥在盐胁迫条件下的相对电导率极显著高于野生型拟南芥ꎬ该结果进一步表明ꎬ盐胁迫对转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥细胞膜的破坏程度显著高于野生型拟南芥ꎮ脯氨酸能够用来作为稳定剂降低高盐㊁干旱等极端环境胁迫对植物的危害[１６￣１７]ꎮ本研究结果表明ꎬ在盐胁迫条件下ꎬ转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥叶片脯氨酸的含量显著低于野生型拟南芥ꎬ该结果进一步表明ꎬ在盐胁迫条件下ꎬ脯氨酸也许是一个导致转ＪｃＨＤＺ２８基因拟南芥具有更高敏感性的因子ꎮ以上结果进一步表明ꎬ盐胁迫对转基因拟南芥的破坏程度显著高于野生型拟南芥ꎮ除了上述生理指标外ꎬ转基因植物对盐胁迫敏感性的增加也归因于非生物胁迫响应基因的下调表达[１８]ꎮ例如ꎬＨｓｆＡ３ｓ通过降低非生物胁迫响应基因的表达增加了转基因植物对盐胁迫的敏感性[１８]ꎮ与此类似ꎬ在我们的研究中ꎬ在盐胁迫条件下ꎬ一些非生物胁迫应答基因(ＳＮＡＣ１㊁ＡｔＣＡＴＡ㊁ＬＥＡ３和Ｐ５ＣＳ１)在转基因拟南芥中的相对表达量显著低于在野生型拟南芥中的相对表达量ꎮ综上ꎬ过表达ＪｃＨＤＺ２８降低了转基因拟南芥对盐胁迫的抗性可能是因为降低了非生物胁迫相关基因的表达ꎮ本研究结果将有助于我们进一步了解ＨＤ￣Ｚｉｐ转录因子基因ＪｃＨＤＺ２８在麻风树中的生理功能ꎮ参考文献:[１]㊀ＬＩＹＸꎬＹＡＮＧＺＲꎬＺＨＡＮＧＹＹꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｒｏｌｅｓｏｆＨＤ￣ＺＩＰｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｐｌａｎｔａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉ￣ｅｎｃｅꎬ２０２２ꎬ１３:１０２７０７１.[２]㊀沈㊀丹ꎬ杨㊀莉ꎬ胡㊀威ꎬ等.柑橘胁迫响应基因ＷＲＫＹ４７的克隆与表达分析[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２１ꎬ３７(１):１２９￣１３８. [３]㊀董舒超ꎬ凌嘉怡ꎬ赵丽萍ꎬ等.转录因子调控番茄抗旱性研究进展[Ｊ].江苏农业科学ꎬ２０２３ꎬ５１(９):９￣１６.[４]㊀ＪＩＡＯＭＹꎬＺＨＡＮＧＪꎬＣＨＥＮＧＷＷꎬｅｔａｌ.ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＡＰ２/ＥＲＦｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｆａｍｉｌｙｏｆＥｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓａｎｄｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓ[Ｊ].３Ｂｉｏｔｅｃｈꎬ２０２３ꎬ１３(７):２５９.[５]㊀ＷＡＮＧＨＬꎬＣＨＥＮＧＸꎬＹＩＮＤＭꎬｅｔａｌ.Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎｔｈｅｒｅ￣ｓｅａｒｃｈｏｎｐｌａｎｔＷＲＫＹｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｔｏｅｘｔｅｒｎａｌｓｔｒｅｓｓｅｓ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＩｓｓｕｅｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０２３ꎬ４５(４):２８６１￣２８８０.[６]㊀ＪＯＯＨꎬＢＡＥＫＷꎬＬＩＭＣＷꎬｅｔａｌ.Ｐｏｓｔ￣ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｏｄｉｆｉｃａ￣ｔｉｏｎｓｏｆｂＺＩＰｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｎａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄｓｉｇｎａｌｉｎｇａｎｄｄｒｏｕｇｈｔｒｅｓｐｏｎｓｅｓ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＧｅｎｏｍｉｃｓꎬ２０２１ꎬ２２(１):４￣１５. [７]㊀ＡＲＩＥＬＦＤꎬＭＡＮＡＶＥＬＬＡＰＡꎬＤＥＺＡＲＣＡꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｔｒｕｅｓｔｏｒｙｏｆｔｈｅＨＤ￣Ｚｉｐｆａｍｉｌｙ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２００７ꎬ１２(９):４１９￣４２６.[８]㊀ＬＩＺＱꎬＺＨＡＮＧＣꎬＧＵＯＹＨꎬｅｔａｌ.Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａ￣ｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｒｏｌｅｏｆｔｈｅＨＤ￣Ｚｉｐｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｒｅｇｕ￣ｌａｔｉｏｎｏｆｅｍｂｒｙｏａｂｏｒｔｉｏｎｉｎｇｒａｐｅｓ(ＶｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａＬ.)[Ｊ].ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓꎬ２０１７ꎬ１８:７４４.[９]㊀ＫＯＶＡＬＣＨＵＫＮꎬＣＨＥＷＷꎬＳＯＲＮＡＲＡＪＰꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｈｏｍｅ￣ｏｄｏｍａｉｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＴａＨＤＺｉｐＩ￣２ｆｒｏｍｗｈｅａｔｒｅｇｕｌａｔｅｓｆｒｏｓｔｔｏｌｅｒａｎｃｅꎬｆｌｏｗｅｒｉｎｇｔｉｍｅａｎｄｓｐｉｋｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｂａｒ￣ｌｅｙ[Ｊ].ＮｅｗＰｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔꎬ２０１６ꎬ２１１(２):６７１￣６８７.[１０]ＬＵＡＮＷＪꎬＳＨＥＮＡꎬＪＩＮＺＰꎬｅｔａｌ.ＫｎｏｃｋｄｏｗｎｏｆＯｓＨｏｘ３３ꎬａｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅｃｌａｓｓⅢｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ￣ｌｅｕｃｉｎｅｚｉｐｐｅｒｇｅｎｅｆａｍｉｌｙꎬａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓｌｅａｆｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｉｎｒｉｃｅ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｃｅＣｈｉｎａ￣ＬｉｆｅＳｃｉ￣ｅｎｃｅｓꎬ２０１３ꎬ５６(１２):１１１３￣１１２３.[１１]ＨＵＲＹＳꎬＵＭＪＨꎬＫＩＭＳꎬｅｔａｌ.Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｈｏｍｅｏｂｏｘ１２(ＡＴＨＢ１２)ꎬａｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ￣ｌｅｕｃｉｎｅｚｉｐｐｅｒｐｒｏｔｅｉｎꎬｒｅｇｕｌａｔｅｓｌｅａｆｇｒｏｗｔｈｂｙｐｒｏｍｏｔｉｎｇｃｅｌｌｅｘｐａｎｓｉｏｎａｎｄｅｎｄｏｒｅｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ[Ｊ].ＮｅｗＰｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔꎬ２０１５ꎬ２０５(１):３１６￣３２８.[１２]ＹＡＮＧＹＦꎬＬＵＡＮＧＳꎬＨＡＲＲＩＳＪꎬｅｔａｌ.ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｃｌａｓｓＩｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＴａＨＤＺｉｐＩ￣５ｉｎｃｒｅａｓｅｓｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｆｒｏｓｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｗｈｅａｔ[Ｊ].ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈ￣ｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌꎬ２０１８ꎬ１６(６):１２２７￣１２４０.５４唐跃辉等:麻风树ＪｃＨＤＺ２８基因克隆与功能分析[１３]ＴＡＮＧＹＨꎬＷＡＮＧＪꎬＢＡＯＸＸꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ￣ｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｏｆＨＤ￣ＺＩＰｇｅｎｅｓｉｎｐｈｙｓｉｃｎｕｔａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＪｃＨＤＺ１６ｇｅｎｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｉｃｅ[Ｊ].ＢＭＣＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１９ꎬ１９:２９８.[１４]ＢＨＡＴＴＡＣＨＡＲＪＥＥＡꎬＫＨＵＲＡＮＡＪꎬＪＡＩＮＭ.ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｒｉｃｅｈｏｍｅｏｂｏｘｇｅｎｅｓꎬＯｓＨＯＸ２２ａｎｄＯｓＨＯＸ２４ꎬａｎｄｏｖｅｒ￣ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＯｓＨＯＸ２４ｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｓｕｇｇｅｓｔｔｈｅｉｒｒｏｌｅｉｎａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０１６ꎬ７:６２７. [１５]ＺＨＡＯＹꎬＭＡＱꎬＪＩＮＸＬꎬｅｔａｌ.Ａｎｏｖｅｌｍａｉｚｅｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ￣ｌｅｕｃｉｎｅｚｉｐｐｅｒ(ＨＤ￣Ｚｉｐ)ＩｇｅｎｅꎬＺｍｈｄｚ１０ꎬｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｓｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｂｏｔｈｒｉｃｅａｎｄＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌａｎｄＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２０１４ꎬ５５(６):１１４２￣１１５６.[１６]ＡＢＤＵＬＬＡＲꎬＣＨＡＮＥＳꎬＲＡＶＩＮＤＲＡＰ.ＢｉｏｄｉｅｓｅｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｆｒｏｍＪａｔｒｏｐｈａｃｕｒｃａｓ:ａｃｒｉｔｉｃａｌｒｅｖｉｅｗ[Ｊ].ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＢｉ￣ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１１ꎬ３１(１):５３￣６４.[１７]ＬＩＵＫＱꎬＴＡＮＧＹＨꎬＴＡＮＧＹＹꎬｅｔａｌ.ＥｃｔｏｐｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＷＲＩＮＫＬＥＤ１ｉｎｒｉｃｅｉｍｐｒｏｖｅｓｌｉｐｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｂｕｔｒｅｔａｒｄｓｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ[Ｊ].ＰＬｏＳＯｎｅꎬ２０２２ꎬ１７(８):ｅ０２６７６８４. [１８]ＷＵＺꎬＬＩＡＮＧＪＨꎬＷＡＮＧＣＰꎬｅｔａｌ.ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｉｌｙＨｓ￣ｆＡ３ｓｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｃｏｎｆｅｒｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄｓａｌｔｓｅｎ￣ｓｉｔｉｖｉｔｙｖｉａａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｉｎｐｒｏｌｉｎｅｃａｔａｂｏｌｉｓｍ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉ￣ｍｅｎｔａｌＢｏｔａｎｙꎬ２０１８ꎬ６９(８):２００５￣２０２１.(责任编辑:陈海霞)６４江苏农业学报㊀２０２４年第４０卷第１期。
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青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析
周xx,xx班级
摘要
广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐
等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通
过RACE-PCR的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA全长,
共987 bp,其中编码区723 bp,共编码240个氨基酸。利用
生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行
分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa,理论等
电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水
蛋白。PwUSP2具有USP家族典型的UspA结构域,但无典
型的ATP结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR分析表明,
PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中
均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸
(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等非生物胁迫下表达量有明显
变化,推测PwUSP2可能参与青杄对逆境胁迫的响应。
材料与方法
青杄植
物材料
实验结果
通过RACE-PCR方法获得PwUSP2基因的末端序列,与EST
序列拼接后获得完整的cDNA序列全长。PwUSP2基因cDNA
序列全长共987 bp, 编码区共723 bp, 共编码240个氨基酸。
在85 bp处为起始密码子ATG, 805 bp处为终止密码子TGA,
968 bp处为Poly(A)20尾巴。
PwUSP2全cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
青杄PwUSP2 全长cDNA的获得 生物信息
学分析
组织特异
性表达
胁迫
处理
PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2
受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h表达量达到最高,在
42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整
体下降趋势。
PwUSP2在ABA胁迫下表达量出现下降, 与42℃热激
胁迫模式相似,而在MeJA胁迫下,PwUSP2基因受到诱导,
表达量显著上调。
ABA和MeJA胁迫下PwUSP2的表达分析
在NaCl胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降,
同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。
温度胁迫下PwUSP2的表达分析
NaCl和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析
讨论
目前,在细菌和植物中,只有少数USPs基因被克隆和
分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁
迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差
异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参
与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能,
以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。
林学院第五届学生学术论坛