绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析
生化绿色荧光蛋白的基因克隆及表达开题报告
学号：班级：姓名：《生物化学与生物分子学实验》——分子生物学设计性实验开题报告实验课题:绿色荧光蛋白的基因克隆及表达指导老师:作者姓名:所在院系：小组编号：小组成员:完成时间：成都医学院Cheng Du Medical College题目：绿色荧光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达立题依据：随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用，人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合,将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1].1.选材：大肠杆菌大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点.而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统,表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 ％，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。
2.基因标记技术基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。
荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。
荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白,分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白［2］.3。
绿色荧光蛋白从水母（Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。
分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成,第65～67位氨基酸(Ser-Tyr—Gly）形成发光团，是主要发光的位置。
其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定,且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光.绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因.【实验目的】研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达.【研究意义】研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达.通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取之欧阳道创编
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）85.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASE-FREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液139．PEGFP-N3质粒全图谱1310．P ET-28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
2021年绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取欧阳光明（2021.03.07）南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP 基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）85.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASE-FREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液139．PEGFP-N3质粒全图谱1310．P ET-28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取之欧阳理创编
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从 E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）85.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASE-FREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液139．PEGFP-N3质粒全图谱1310．P ET-28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。
然后用质粒DNA 的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言 (3)2 实验目的 (4)3 实验设备 (4)4 材料及试剂 (5)5 实验操作步骤 (5)5.1操作流程 (5)5.2质粒DNA的分离与纯化 (6)5.2.1 质粒的培养 (6)5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 (6)5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 (7)5.3酶切及连接 (8)5.3.1 双酶切 (8)5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收） (8)5.3.3 连接 (9)5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 (9)5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）.. 95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法) (9)5.4.3 转化涂板 (10)5.5GFP蛋白的诱导表达 (10)5.6绿色荧光蛋白的粗提取 (11)参考文献 (11)附录 (12)1LB培养基的配制： (12)2.溶液Ⅰ (12)3.溶液Ⅱ (12)4.溶液Ⅲ（100ML） (12)5.DN ASE-FREE RN ASE A (13)6.TE缓冲液（P H8.0） (13)7.20×TBE (13)8.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液 (13)9．PEGFP-N3质粒全图谱 (13)10．P ET-28A质粒全图谱 (14)1 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取之欧阳歌谷创作
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取欧阳歌谷（2021.02.01）南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从 E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞 E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）85.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)9 5.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASE-FREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液13 9．PEGFP-N3质粒全图谱1310．P ET-28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
绿色荧光蛋白基因克隆及表达 结题报告57页文档
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71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相
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24、勇气很有理由被当作人类德性之 首，因 为这种 德性保 证了所 有其余 的德性 。--温 斯顿． 丘吉尔 。 25、梯子的梯阶从来不是用来搁脚的 ，它只 是让人 们的脚 放上一 段时间 ，以便 让别一 只脚能 够再往 上登。
前言 EGFP基因的克隆及表达
绿色荧光蛋白(GFP)
• 绿色荧光蛋白(green-fluorescent protein, GFP) 是从太平洋水母中分离出来的一种荧光蛋白质, 为238 氨基酸组成的单体, 分子量约为27kD。
• 其野生型(wild-type GFP)的吸收/激发峰在395 nm , 在475 nm 有一个次要峰，发射峰为508 nm。对细胞无毒，用于转基因表达的检测。
质粒pEGFP-N3Байду номын сангаас谱
表达载体pET-28a
• pET表达体系是在大肠杆菌中克隆和表达 融合蛋白常用的体系之一。
• 使用T7Lac启动子； • BamHI下游存在转录终止信号； • 含有寡聚组氨酸链（His-tag),便于融合蛋白
的纯化。
pET- a
表 达 载 体
28 图 谱
3、无毒害：GFP 对生活的细胞基本无毒害,对目的基因的功能也没 有影响,转化后细胞仍可连续传代。
4、具有共用性和通用性：首先表现在GFP 的表达几乎不受种属范 围的限制，在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达；其次是 GFP 没有细胞种类和位置上的限制，在各个部位都可以表达发出荧 光。
5、易于构建载体：由于GFP 分子量较小，仅为27-30kD，编码GFP 的基因序列也很短，所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒。
GFP 的应用特点：
1、检测方便：不需要外加底物和辅助因子，用荧光显微镜甚至肉 眼就可以观察到，且灵敏度高，对于单细胞水平的表达也可识别。
2、荧光稳定：GFP 对光漂白有较强的耐受性，能耐受长时间的光 照；在pH范围在7-12 之间都能正常发光；对高温、碱、离子除垢 剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶都有较强抗性。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取之欧阳学创编
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从 E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP 基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞 E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的 E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）85.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASE-FREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液139．PEGFP-N3质粒全图谱1310．P ET-28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取之欧阳计创编
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）85.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASE-FREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液139．PEGFP-N3质粒全图谱1310．P ET-28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
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1
3 结果与分析
3.1质粒提取
用醋酸铵法提取pET-28a和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否
提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3
提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a提取成功。
3.2双酶切
用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3
的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳
道为pET-28a的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。
3.3 抗性筛选
通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP转入DH5α感
图 1 pET-28a和pEGFP-N3质粒提取电泳图
1、2泳道为pET-28a电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果
图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a
1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物
3号泳道为pEGFP-N3原始质粒
4号泳道为pET-28a酶切产物
5号用泳道为pET-28a原使质粒
2
受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有
抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板
长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中
不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。
失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致
培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃
上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。
3.4PCR鉴定
经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图
四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基
因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。
1号图为不含卡那的阴性对照
2号图为含卡那的阴性对照
3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照
4号图为含卡那的连接产物结果
图 3重组质粒转化DH5α感受态细胞
图 4阳性重组菌的PCR鉴定
1、2号泳道为重组质粒转化结果
3
3.5重组质粒提取
用醋酸铵法提取pET-28a-GFP后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，重组质粒是否
提取成功。得到电泳结果，如图五所示，1、2号泳道均有明显条带，说明重组质
粒提取成功。
图 5 pET-28a-GFP质粒提取
3.6重组质粒酶切鉴定
用BamH1和Xho1对重组质粒进行双酶切验证。1、2号泳道重组质粒的酶切结
果，如图六所示，电泳得到两条带，750bp左右的为GFP和5300bp左右的为PET-28a
说明质粒重组成功。
1、2号泳道为重组质粒转化结果
图 6 BamH1、Xho1对双酶切验证重组质粒
1、2号泳道为重组质粒电泳结果
4
3.7绿色荧光蛋白表达与观察
图 7重组质粒转化BL-21感受态细胞
结果如上图所示，一号板生长较多菌落，说明BL-21感受态细胞存活。二号
板也生长出菌落，有可能是因为发生突变。三号板中生长出较多菌落，证明卡那
有效。在四号平板中，经过IPTG的诱导，大部分菌落成功发出荧光，说明GFP基
因在大肠杆菌中成功表达。
1 2
3 4
一号板为平板中不含卡那的阴性对照 二号板为含卡那的阴性对照
三号板为含卡那的阳性对照 四号板为平板中含有卡那及IPTG的实验结果。
5
参考文献
[1]J. Sambrook, E. P Fritsch, T. Maaniatis, MolecuLar cloning A laboratory
Manual
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989
[2]L戴维斯等编著，姚志建等译，《分子生物学实验技术》,34-36，科学出版
社,1990
[3]贺竹梅，刘秋云，一种提取质粒DNA的改良方法，生物技术6(1),37
38,1996
[4]王重庆等编著，《高级生物化学实验教程》，北京大学出版社,95
107,1994
[5]郝福英，朱玉贤等编《基础分子生物学实验》，北京大学出版社,2010
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致 谢
感谢老师的专业指导，感谢同组同学的帮助。