基因克隆及克隆基因的表达
目的基因的克隆实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子克隆技术，将目的基因从基因库中提取并克隆到合适的载体上，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定基础。
二、实验原理分子克隆技术是基因工程的核心技术之一，其基本原理是将目的基因片段与载体DNA片段通过酶切、连接等步骤形成重组DNA分子，然后将重组DNA分子导入宿主细胞进行扩增和表达。
三、实验材料1. 实验试剂：限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、dNTPs、质粒载体、目的基因DNA、LB液体培养基、LB固体培养基、IPTG、X-Gal、0.1 M MgCl2、0.1 M CaCl2等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、恒温培养箱、显微镜、超净工作台等。
四、实验步骤1. 目的基因的获取（1）设计引物：根据目的基因的序列，设计特异性引物，引物5'末端带有酶切位点。
（2）PCR扩增：以目的基因DNA为模板，PCR扩增目的基因片段。
（3）PCR产物回收：采用PCR产物回收试剂盒回收目的基因片段。
2. 载体与目的基因的连接（1）载体线性化：用限制性核酸内切酶酶切质粒载体，获得线性化载体。
（2）连接反应：将回收的目的基因片段与线性化载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接。
（3）连接产物转化：将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中。
3. 重组子筛选与鉴定（1）菌落培养：在含有IPTG和X-Gal的LB固体培养基上培养转化菌，挑选白色菌落。
（2）菌落PCR鉴定：以白色菌落为模板，进行PCR扩增，检测目的基因片段是否插入载体。
（3）重组子测序：对PCR鉴定阳性的重组子进行测序，验证目的基因片段是否正确插入载体。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：通过PCR扩增，成功获得了目的基因片段。
2. 菌落PCR鉴定结果：白色菌落PCR鉴定阳性，表明目的基因片段已插入载体。
3. 重组子测序结果：测序结果显示，目的基因片段正确插入载体。
六、实验结论本实验成功克隆了目的基因，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定了基础。
基因克隆的基本原理
基因克隆的基本原理
基因克隆是指通过技术手段复制和传递生物体的基因信息，使得新生命体具有与原生物一样的基因组成。
基因克隆的基本原理涉及以下几个步骤：
1. DNA提取：从源生物体中获取含有目标基因的DNA。
这可以通过多种方法实现，例如细胞溶解、离心、染色体提取等。
2. 载体DNA准备：选择一种外源载体（例如质粒或病毒）作为基因传递的工具。
这些载体DNA通常会被处理以使其具备接受外来基因并复制自身的能力。
3. DNA连接：将目标基因与载体DNA进行连接。
这可以通过酶切和连接的方法实现。
酶切指的是利用特定的内切酶，将目标基因和载体分别切割，然后通过连接酶将它们结合在一起。
4. 转化：将连接好的载体DNA导入目标细胞内。
这可以通过多种方法实现，例如热冲击、电穿孔、微注射等。
目标细胞内的酶系统将自动复制和表达导入的基因。
5. 筛选和分离：将转化后的细胞进行筛选，找出具有目标基因的克隆细胞。
通常会引入某种选择标记来帮助鉴定带有目标基因的细胞。
6. 培养和繁殖：将筛选出的克隆细胞进行培养和繁殖。
这样就可以得到大量含有目标基因的细胞群体或生物个体。
基因克隆的基本原理是通过将目标基因与载体DNA连接，并将其导入目标细胞中，利用细胞内的酶系统实现基因的复制和表达。
这个过程经历了多个步骤，包括DNA提取、载体DNA准备、DNA连接、转化、筛选和分离，最终得到带有目标基因的克隆细胞或生物个体。
小鼠β-actin基因的克隆表达(2)
小鼠β-actin基因的克隆表达（2）实验步骤：（1）目的基因与表达载体的连接反应：①表达载体和目的片段的酶切管号①②pGEX 4T-1 42μlPCR产物42μlBamHⅠBuffer（10×）5μl5μlBamHⅠ1μl1μlSalⅠ2μl2μl加样后混匀，置于37℃水浴中，保温3~4h。
然后将酶切产物全部经琼脂糖凝胶电泳后回收。
②表达载体与目的片段的连接取一个200µl的EP管依次加入下列试剂：2×buffer：5 μlpGEX 4T-1酶切回收产物：1 μlPfu扩增并酶切回收的片段：3μlT4连接酶：1 μl离心30Sec，使反应体系充分混合，16～22℃连接3～4h。
（2）克隆载体与目的片段的连接取一个200µl的EP管依次加入下列试剂：pMD18-T 1 μl目的片段4μllSolution Ⅰ(含连接酶和buffer) 5 μl离心30Sec，使反应体系充分混合，4℃过夜连接。
感受态细胞的制备及转化实验目的：把体外重组的DNA引入受体细胞，使受体菌具有新的遗传特性，并从中选出转化子。
实验原理：所谓感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态。
关于感受态的本质说法很多。
目前主要有两种假说：1.局部原生质体化假说—细菌表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过质膜进入细胞。
2.酶受体假说—感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
DNA分子的转化过程如下：1.吸附—完整的双链DNA分子吸附在受体菌的表面。
2.转入—双链DNA分子解链。
单链DNA进入受体菌，另一条链降解。
3.自稳—外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA。
表达—供体基因随同复制子同时复制，并被转录翻译。
实验步骤：（1）感受态的制备① 从LB平板上挑取单克隆于5ml LB培养基中，37℃ 200rpm摇菌12～1 6h。
基因克隆的一般程序
基因克隆的一般程序
基因克隆通常包括以下步骤：
1.选择一个目标基因，并设计引物：在开始之前选择要克隆的
基因，并设计引物。
引物通常包括两个寡核苷酸序列，它们与目标基因的两端相匹配，并且在引物的末端含有限制性内切酶识别位点。
2.将目标基因PCR扩增：使用引物进行PCR扩增，从而扩增
目标基因。
PCR扩增过程中，添加限制性内切酶识别位点的
引物，则可以获得含有限制酶切割位点的PCR产物。
3.剪切PCR产物：将PCR产物用限制性内切酶进行切割，因
为PCR产物含有限制性酶切割位点，因此可以选择正确的限
制性内切酶来切割。
4.连接载体：将PCR产物和质粒（或其他载体）用T4 DNA
连接酶连接在一起。
质粒通常被用作载体，因为它们可以在细胞内稳定复制。
5.转化：将连接好的质粒导入大肠杆菌等推动器中，并将其生
长在培养基上，以让它们自我复制。
6.筛选克隆：使用蓝白斑筛选法确定哪些细菌含有转化的基因。
该方法利用质粒上的LacZ基因，这可以使含有原核素三硝基
甲酸的菌落变成蓝色，而不含此基因的细菌则是白色的。
7.确定序列：将可能的克隆 DNA 提取出来，然后将其进行测序，从而确定克隆基因的精确序列。
8.表达蛋白质：克隆基因的表达，可以用来表达蛋白质。
这可以通过让此基因插入到一个表达载体中来完成，然后将其转化至宿主细胞中，也可对其进行人工表达分析。
基因克隆的顺序
基因克隆的顺序
基因克隆的顺序通常包括以下步骤：
1. 选择目标基因：确定需要克隆的基因，可以是某个特定的基因，也可以是一段DNA序列。
2. 提取DNA：从源生物体中提取目标基因的DNA，通常使用DNA提取试剂盒来提取。
3. 制备质粒：选择一个适当的质粒，将其准备好作为目标基因的载体。
质粒通常是一段环状的DNA分子，可以自复制并在细胞中稳定存在。
4. 执行DNA切割：使用限制性内切酶将目标基因和质粒切割成相应的DNA片段。
内切酶是能够识别特定DNA序列并在其特定的位置进行切割的酶。
5. 连接DNA片段：将目标基因的DNA片段与质粒的DNA片段连接起来。
这可以通过DNA连接酶来实现，DNA连接酶能够催化两个DNA片段的连接。
6. 转化宿主细胞：将连接好的质粒转化到宿主细胞中，通常使用细菌作为宿主细胞。
转化可以通过电穿孔、化学方法或热激转化等方式进行。
7. 筛选重组细胞：利用筛选性培养基或标记基因等方法筛选出含有重组质粒的
细胞。
8. 纯化重组质粒：从筛选出的重组细胞中提取重组质粒。
9. 分析重组质粒：对提取出的重组质粒进行测序、限制性酶切等分析，确认克隆基因的准确性。
10. 表达目标基因：如果希望表达克隆的基因，可以将重组质粒转化到表达宿主细胞中，例如真核细胞或类似细胞。
需要注意的是，基因克隆的具体步骤可能会因实验目的、实验方法和克隆体的复杂性而有所不同。
基因克隆具体实验报告
一、实验目的1. 学习基因克隆的基本原理和方法。
2. 掌握PCR扩增、酶切、连接等基因克隆实验技术。
3. 验证目的基因的克隆是否成功。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段从基因组中分离出来，并插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。
实验过程中，主要涉及PCR扩增、酶切、连接、转化、筛选等步骤。
三、实验材料1. 模板DNA：含有目的基因的基因组DNA。
2. 引物：根据目的基因序列设计的上下游引物。
3. Taq DNA聚合酶：用于PCR扩增。
4. 酶切体系：限制性内切酶、缓冲液、连接酶等。
5. 连接载体：线性化载体。
6. 转化宿主菌：大肠杆菌DH5α。
7. 筛选培养基：含抗生素的LB培养基。
8. PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2等。
四、实验方法1. PCR扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计上下游引物，长度约为20-30bp，分别位于目的基因的上下游。
（2）PCR反应体系：取模板DNA 1μl，上下游引物各1μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl2 2μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加ddH2O至50μl。
（3）PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后延伸10min。
2. 酶切连接（1）酶切：取PCR产物5μl，加限制性内切酶（如EcoRI）1μl，10×酶切缓冲液2μl，ddH2O 2μl，混匀后置于37℃水浴酶切2h。
（2）连接：取线性化载体5μl，酶切产物5μl，10×连接缓冲液2μl，T4 DNA 连接酶1μl，混匀后置于16℃连接过夜。
3. 转化（1）制备感受态细胞：将大肠杆菌DH5α在LB培养基中培养至对数生长期，按照1:100的比例加入CaCl2，混匀后冰浴30min。
（2）热激转化：将连接产物加入感受态细胞中，混匀后置于42℃水浴45s，迅速转移至冰浴中。
基因克隆的主要方法
基因克隆的主要方法目的基因是指要研究其生物学功能的一段编码特定蛋白的DNA 序列。
在基因克隆中，首先需要利用分子生物学技术，将目的基因从染色体上分离出来，获得基因序列并构建到载体上。
一般来讲，基因克隆的策略可分为两种途径：正向遗传学途径和反向遗传学途径。
正向遗传学途径以克隆的基因所表现的功能为基础，通过基因的表达产物或表型性状鉴定进行克隆，如功能克隆和表型克隆等；反向遗传学途径则是着眼于基因本身特定的序列或者在基因组中的特定位置进行克隆，如定位克隆、同源序列法克隆等；随着DNA测序技术和生物信息学的进一步发展，又产生了电子克隆等新兴克隆技术。
简单地说，正向遗传学是从表型变化到基因变化，而反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。
目前，在农业生物技术领域，已经从玉米、水稻、油菜、小麦、拟南芥、烟草、番茄等多种植物与动物及微生物中克隆得到了许多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。
1.功能克隆利用蛋白质的表达和功能信息分离鉴定出未知基因的方法称为未知基因的功能克隆（functional cloning）。
功能克隆法是根据性状的基本生化特征，鉴定已知基因的功能后分离目标基因的一种方法，该法是人类采用的第一个基因克隆策略。
其基本过程为：分离纯化感兴趣的蛋白质并测定部分氨基酸序列，设计相应的抗体待用；分离可能含有该蛋白的组织，提取RNA 和mRNA 进行体外翻译，在蛋白合成过程中，加入已制备的抗体，此时正在合成的该蛋白连同其模板mRNA 一同被沉淀；用蛋白酶消化沉淀中的蛋白质得到mRNA，进行反转录得到cDNA，进行测序获得要克隆的基因编码序列。
如果用功能克隆同源基因，其基本过程为：根据已知序列制备核苷酸探针或者蛋白抗体，杂交筛选cDNA文库或基因组文库，或者使用相应蛋白的抗体探针，筛选表达载体构建的cDNA 文库获得相应克隆，对选中的克隆进行测序，获得目的基因序列。
功能克隆的关键在于需要先分离出纯度高的蛋白质，测定其部分氨基酸序列或得到相应抗体；其次构建cDNA 文库或者基因组文库。
克隆基因的操作流程
克隆基因的操作流程
克隆基因是一种基因工程技术，它可以将感兴趣的基因从一个生物体中复制到另一个生物体中。
克隆基因的操作流程包括以下几个步骤：
1. 选择目标基因：首先需要确定感兴趣的基因，这个基因可以是任何生物体中的基因，如人类、动物、植物等，也可以是一种人工设计的基因。
2. 剪切DNA：通过限制性内切酶，将目标基因从DNA分子中切割出来。
这些切割出来的DNA片段被称为限制性内切片段。
3. 连接载体：将目标基因插入到载体DNA中。
载体是一种DNA 分子，可以承载基因并将其引入到目标生物体中。
在这个步骤中，需要使用一种酶来将目标基因和载体DNA连接起来。
这个过程被称为“重组”。
4. 转化宿主细胞：将重组后的载体DNA转化到宿主细胞中，使宿主细胞能够表达目标基因。
5. 筛选：筛选出表达目标基因的宿主细胞。
这个步骤可以通过一些特定的实验方法来实现，如PCR、Southern blotting等。
6. 验证：验证目标基因是否被正确地插入到宿主细胞中，并且是否表达出来。
通过这些步骤，就可以成功地克隆基因了。
克隆基因技术在医学、农业、工业等领域中有着广泛的应用，可以用来生产新药、改良农作物品种、生产高效酶等。
第三章 基因克隆的载体
没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。
外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡
外源基因Pst I Tet中存活 但在Amp中死亡
② 分子小，克隆能力大 载体越小越好。 >10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。
③ 高拷贝数
2. 质粒载体相关知识介绍
（4）pBluescript SK
pBluescript SK is similar to the pGEM vectors except that it also carries an origin of replication for a filamentous phage, f1. f1 uses a single stranded DNA molecule as a genome and pBluescript KS
表达型质粒载体
装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯 化的元件，主要用来使外源基因表达出 蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。 如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆 的真核生物的基因臵于大肠杆菌的转 录—翻译信号控制之下。
① 表达载体的结构
1）普通载体元件 复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS
1.质粒的生物学特性
（4）质粒的复制类型 一种质粒在宿主细胞中存
在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将质粒分为 两种复制型：“严紧型”质粒（stigent plasmid）, 拷贝数为1-3；“松弛型”质粒（relaxed plasmid）, 拷贝数为10-60。不过，即使是同一质粒，其拷贝数在 不同的寄主细胞间也可能有很大的变化。
基因克隆常用的方法
3.2 Differential display PCR(DD-PCR) PCR(DDDD-PCR是在AP-PCR基础上发明的一种RTDD-PCR是在AP-PCR基础上发明的一种RTPCR方法,主要用于2 PCR方法,主要用于2种或多种类似生物个体在基因 表达上的差异分析。其基本原理是: 表达上的差异分析。其基本原理是:所有真核生物 的成熟mRNA都含有不同长度的poly+(A)尾部序列, 的成熟mRNA都含有不同长度的poly+(A)尾部序列, 根据poly+(A)内部的2个核苷酸排列的不同, 根据poly+(A)内部的2个核苷酸排列的不同,可以将 所有的mRNA分子分为12类 见图3)。 所有的mRNA分子分为12类(见图3)。
PCR反应模式图： 反应模式图： 反应模式图
Nested PCR反应模式图 反应模式图
根据蛋白质序列也可或cDNA 序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1 序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引 物(degen做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。
另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究, 另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的 PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof)功能的酶, pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点 proof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点 突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。
图３真核生物12种mRNA的序列特点
根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即 根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即 M’N’TTTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成 M’N’TTTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成 12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物,以这12种cDNA分别做 12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物,以这12种cDNA分别做 模板进行PCR扩增(见图1和图4)，那么与表型相关的mRNA就很容易被 模板进行PCR扩增(见图1和图4)，那么与表型相关的mRNA就很容易被 发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于2 发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于2种种源近似生 物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而, PCR的模板必须是 物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而,其PCR的模板必须是 来自2个生物或同一生物的不同发育阶段的mRNA。DD-PCR的优点是快 来自2个生物或同一生物的不同发育阶段的mRNA。DD-PCR的优点是快 速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所 速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所 扩增的mRNA的质量不能有差异, mRNA不应降解。目前这一方法已广 扩增的mRNA的质量不能有差异,即mRNA不应降解。目前这一方法已广 泛应用于生物表型相关基因的克隆及比较研究。
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三、目的DNA与载体连接（接）
T4DNA ligase
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四、重组DNA转入宿主细胞进行扩增（转）
宿主细胞
感受态细胞（competent cell）：
处于易于接纳外源物质的状态的细菌
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几个相关概念：
Lac I
Prokaryotic Expression Plasmid
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一、原核宿主细胞 大肠杆菌（E.coli)
优点：简便, 快速、成本低 可高密度发酵培养 20-30min
注意：
12 hours Once 用来克隆基因和表达基因的菌株不一样， the recombinant system is established, it is cheap to manufacture.
T-载体：
T7
pMD18-T 2692bp
HindIII Spln PstI HincII AccI SalI
T
T
Xbal BamHI SmaI XmaI KpnI SacI EcoRI
LOGO Sp6
克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖
（二）常用克隆载体的种类
速高效表达基因产物。
真核表达系统： 外源基因引入真核细胞，使外源
基因在真核细胞中表达。
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第一部分.外源基因在原核细胞中的表达
原核细胞表达 系统组成
一、原核宿主细胞 二、原核表达载体
Recombinant Protein
wΒιβλιοθήκη
转化（transformation） 质粒或黏粒→细菌 质粒→酵母（真核细胞） 转染（transfection） 外源DNA→真核细胞（酵母除外） 感染（infection） 噬菌体颗粒→细菌 病毒颗粒→哺乳细胞
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将重组DNA转入受体细胞的常用方法：
化学法：
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
时间（min）
4
5
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PCR的基本原理
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+ 各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L
（2）M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） 单链闭合环状DNA分子
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克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖
（二）常用克隆载体的种类 3.穿梭载体(shuttle vector) 可在不同宿主细胞中应用
人工构建，含有不止一个复制起点，能携带外源DNA序列在不同种类 宿主细胞中复制、扩增。
Recombinant vector
Proteins
原核表达系统
Prokaryotic expression system
真核表达系统
Eukaryotic expression system
大肠杆菌
酵母
昆虫 细胞
哺乳动物 细胞
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表达体系
原核表达系统： 外源基因引入原核细胞，使其快
1. 利用抗生素抗性标志可筛选出带有载体的重组子
细胞在含有相应抗生素的培养基中培养：
无载体转入的细胞——dead；含有载体的细胞——alive。
尚需进一步鉴定载体是否为含有目的DNA的重组载体
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五、重组体的筛选与鉴定（筛）
2. 蓝白筛选
Blue-white screening of recombinants
例如，既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体。 这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因；还有真 核生物的自主复制序列及选择标记性状；具有多克隆位点。 通常穿梭载体：在细菌中用于克隆（扩增克隆的基因）， 在酵母菌中用于基因表达分析。
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表达载体用于外源DNA的表达
克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖
（一）克隆载体（cloning vector）应具备的主要特点 1.至少有一个复制起点（origin of replication, ori） 2.至少有一个选择性标志（selection marker）
3.有适宜的限制性内切酶的单一切点：多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）
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基因克隆、 克隆基因的表达
吉林大学白求恩医学院 分子生物学教研室 讲师
孙 巍
Tel: 0431 - 85619369
2012-10
一、目的DNA的分离获取（分）
分离获取目的DNA有多种方法：
(一) PCR——待扩增目的基因两端序列法——直接合成目的DNA（序列已知、片段较短）如何从中钓取基因？LOGO
PCR的基本原理
高温变性 低温退火 适温延伸 温 度 72 （℃）
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
94
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
形 成
DNA 2
55 22
条变 DNA 一个细胞只接受一个 重组DNA分子
单克隆
LOGO基因组DNA（genomic DNA library）： 包含某一个生物细胞或组织全部基因组DNA序列的随机克
隆群体，以DNA片段的形式贮存了所有的基因组DNA信息。
（二）考虑目的DNA的大小及受体细胞的种类和来源
载体 质粒 λ 噬菌体载体 黏粒 BAC YAC 插入DNA片段 <5~10 kb ~ 20 kb ~50 kb ~400 kb ~3Mb 宿主细胞 细菌，酵母 细菌 细菌 细菌 酵母
（三）含有合适的MCS
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最常用。 原核表达质粒
噬菌体：长片段
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1、原核表达质粒的元件：
Prokaryotic promoter start piont
PT7
SD
MCS
Terminator
复制原点 克隆元件： 插入位点 筛选标记 强启动子 表达元件： 终止子 SD序列
Ampicillin resistance
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
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二、载体的选择与准备（择）；
载体（vector）：携带外源DNA，实现外源DNA在受体细胞中 的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
分类：
1.按功能
克隆载体（cloning vector） 表达载体（expression vector）
——在指示培养基上用颜色直接筛选重组克隆的方法
Lac Operon ?
诱导物
IPTG
β半乳糖苷酶
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五、重组体的筛选与鉴定（筛）
3. 限制性内切酶法：根据限制酶切图谱筛选特定DNA
提取阳性克隆的重组DNA
RE消化
NcoI HindIII
300bp
2700bp
表达时，选用与表达载体相匹配的菌株。
Recombinant insulin
6-8 Billion bacteria LOGO
原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下的特点：
①生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表 达产物。
②基因组结构简单，便于基因操作和分析。
电泳
有无DNA片段的插入； 插入片段的大小
M
空质粒 重组质粒
Linear vector (2700bp)
连接前用什么酶， 就用什么酶切
insert (300bp)
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五、重组体的筛选与鉴定（筛）
4. PCR法：直接鉴定目的DNA的存在
利用序列特异性引物，可鉴定阳性克隆。 如利用克隆位点两侧序列设计引物进行PCR，再结合序列分析，能
表达载体（expression vector）：用来在宿主细胞 中表达外源基因的载体
依据其宿主细胞的不同可分为:
原核表达载体（prokaryotic expression vector） 真核表达载体（eukaryotic expression vector）
可靠地证实插入片段的方向、序列和阅读框的正确性。
5. 核苷酸序列测定是最准确的鉴定目的DNA的方法
可明确序列和阅读框的正确性
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基因克隆技术是分子生物学的核心技术
•人源抗体 •重组多肽药物 •重组疫苗 DNA序列测定
重组蛋白
基因突变
核酸探针标记
基因克隆技术
③多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的 表达载体。
④生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。 ⑤不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空 间构象。 ⑥内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳 定性。
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二、原核表达载体
在原核细胞中表达外源基因的载体。 质粒： 最方便，
质粒载体 噬菌体载体 黏粒载体 病毒载体 人工染色体载体等
2.按基本元件 的来源
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二、载体的选择与准备（择）；
（一）根据DNA克隆的目的选择与准备适宜载体
1. 获得目的DNA片段——选用克隆载体； 2. 获得目的DNA片段所编码的蛋白质——选用表达载体。
会赋予宿主细胞一些遗传性状
质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象。
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目前，已有一系列商品化质粒克隆载体可供选择，可容纳 10kb以内的外源DNA 。
pUC18/19质粒图谱
pUC18/19质粒，2686bp，是最常用的质粒载体
缺乏控制拷贝数的rop基因，因此其拷贝数达 500-700 LOGO