实验5 琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
酶的竞争性抑制
丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用竞争性抑制作用是指，当抑制剂在结构上与底物类似，能与底物竞争酶分子活性中心的结合基团，从而阻碍酶与底物结合。
它是可逆的，抑制作用的强弱取决于抑制剂与底物的相对浓度。
丙二酸对琥珀酸脱氢酶有竞争性抑制作用。
丙二酸的结构和琥珀酸非常相似，可竞争性地与酶的活性中心结合，使其不能与琥珀酸结合。
因此可通过研究不同浓度比例的丙二酸和琥珀酸，观察其对琥珀酸脱氢酶活性的影响。
1实验材料1.1酶提取液实验室提供1.2仪器滴管；玻璃棒；试管6支1.3试剂0.2mol/L琥珀酸；0.02mol/L琥珀酸；0.2mol/L丙二酸；0.02mol/L丙二酸；0.02％甲烯蓝；液体石蜡；蒸馏水2实验方法2.1实验原理琥珀酸经琥珀酸脱氢酶催化，脱氢生成延胡索酸。
在体外隔绝空气条件下，从琥珀酸上脱下的一对氢可由人工受氢体甲烯蓝（蓝色）接受后，被还原成甲烯白。
抑制剂丙二酸竞争琥珀酸脱氢酶的活性中心，阻碍底物与该酶的结合和催化反应，使甲烯蓝褪色的速度变慢。
丙二酸对该酶的抑制程度取决于其与琥珀酸的相对浓度比例。
2.2实验设计2.2.1竞争性抑制作用鉴定取6支试管，按下表操作：试剂\管号 1 2 3 4 5 6酶提取液20 20 20 20 20 - 0.2mol/L琥珀酸10 10 10 - - 10 0.02mol/L琥珀酸- - - 10 10 - 0.2mol/L丙二酸- 10 - 10 - - 0.02mol/L丙二酸- - 10 - 10 -蒸馏水10 - - - - 25 0.02％甲烯蓝 4 4 4 4 4 4各管混匀液体石蜡15 15 15 15 15 15放置室温不断观察各管甲烯蓝褪色置甲烯白（即呈肝匀浆色）的时间，比较各管顺序。
3实验结果记录各管褪色顺序，得下表：管号 1 2 3 4 5 6顺序 1 3 2 5 4 6 1号管中无抑制剂（丙二酸），所以琥珀酸在酶的催化下脱氢，使甲烯蓝褪色速度最快。
实验十三琥珀酸脱氢酶的作用及竞争性抑制的观察
本文档由无尘大哥上传至豆丁网实验十三琥珀酸脱氢酶的作用及竞争性抑制的观察实验类型：验证型目的和要求（1）了解琥珀酸脱氢酶的作用（2）掌握酶的竞争性抑制作用原理琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中的一个重要的酶，测定细胞中有无这种酶可以初步鉴定三羧酸循环途径是否存在。
琥珀酸脱氢酶可使其底物脱氢，产生的氢可通过一系列传递体最后递给氧而生成水。
在缺氧的情况下，若有适当的受氢体也可显示出脱氢酶的作用。
如心肌中的琥珀酸脱氢酶在缺氧的情况下，可使琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色的甲烯白。
这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。
琥珀酸+ 甲烯蓝琥珀酸脱氢酶延胡索酸+ 甲烯白无氧条件丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀酸竞争而和琥珀酸脱氢酶结合。
若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种现象称为竞争性抑制。
如相对地增加琥珀酸的浓度，则可减轻丙二酸的抑制作用。
操作方法1．猪心脏制备液：称取新鲜猪心1.5~2.0g放组织捣碎机中，加入等体积的石英砂及1/15mol/LNa2HPO4溶液3~4ml，捣碎成浆，再加入6~7ml1/15mol/LNa2HPO4溶液，放置1小时，不时摇动，离心取上清液备用。
2．取4支试管，编号并按下表操作：试管心脏制备液1.5%琥珀酸钠溶液1%丙二酸钠溶液蒸馏水0.02%甲烯蓝（滴）（滴）（滴）（滴）（滴）1 5 5 －10 22 5 5 －10 2（先煮沸）3 5 5 5 5 24 5 10 5 5 23．各管溶液混匀后，每管各加液体石蜡一薄层（约5~10滴）。
4．各管置于37℃水浴中，半小时内观察各管颜色变化，比较其速度并说明原因。
然后将第1管用力摇动，观察其有何变化？为什么？试剂和仪器1．1.5%琥珀酸钠溶液：称取琥珀酸钠1.5g，用蒸馏水溶解并稀释至100ml。
如无琥珀酸钠可用琥珀酸配成水溶液后，以氢氧化钠溶液中和至pH7~8。
2．1%丙二酸钠溶液：称取丙二酸钠1g，用蒸馏水溶解并稀释至100ml。
实验三：琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制 南京医科大学
3、丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂
浓 度
4、本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔离空气条件下，
以甲烯蓝褪色程度来观察、判断丙二酸对琥珀酸脱氢
酶活性的抑制作用。
琥珀酸脱氢酶
琥珀酸
延胡索酸ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
FAD
FADH2
三、操作步骤：
1、酶提取液的制备 1 g 兔肌肉、剪碎＋海沙（研磨成糜状）
＋12 ml 1/15M磷酸盐缓冲液 (区别于0.1mol/L) （两次，研成糊状）；纱布过滤
２、酶促反应及竞争抑制作用
试剂（滴） １ ２ ３ ４ ５
酶提取液
20 20 20 20 -
0.2 mol/L琥珀酸 4
4
4
-
4
0.02mol/L琥珀酸 -
-
- 4-
0.2 mol/L丙二酸 -
4
-
4
-
0.02mol/L丙二酸 -
-4--
蒸馏水
4
-
-
- 24
0.02%甲烯蓝
2 2 2 22
3、 各管混匀，加石蜡5滴隔绝空气， 37℃水浴
保温，观察褪色情况。（斜执试管，沿壁缓慢加， 不要产生气泡）
四、结果、讨论： 阴性对照
编号 １
２
３
４
５
时间
10min
20min
30min 40min 50min 60min
褪色快
不褪色 褪色缓慢 不褪色 不褪色
五、注意事项：
1 、充分碾磨家兔肌肉，碾磨器械、纱布要及时清 洗，注意回收。
2 、滴加液体石蜡。(实验结束,试管用洗衣粉刷净) 3 、观察结果时不能振摇试管，避免甲烯白重新氧
实验三 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制[原理]肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶，能催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸。
反应中生成的FADH2可使蓝色的甲烯蓝还原为无色的甲烯白(还原型甲烯蓝)。
丙二酸与琥珀酸的分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，故能与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶的活性中心。
丙二酸与琥珀酸脱氢酶结合后，酶活性受到抑制，则不能再催化琥珀酸的脱氢反应。
抑制程度的大小，随抑制剂与底物两者浓度的比例而定。
本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔绝空气的条件下，通过甲烯蓝的褪色程度来判断琥珀酸脱氢酶的活性，并籍此观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的抑制作用。
CH2COOHCH2 COOH FAD MB•2H（甲烯白）琥珀酸琥珀酸脱氢酶CHCOOHHOOCCH FADH2MB（甲烯蓝）延胡索酸[试剂]1．0.2mol/L琥珀酸: 取琥珀酸钠(MW:270.14)27克加水至500ml。
2．0.02mol/L琥珀酸: 取1液稀释10倍。
3．0.2mol/L丙二酸: 取丙二酸钠(MW:166.05)16.7克加水至500ml。
4．0.02mol/L丙二酸: 取3液稀释10倍。
5．1/15mol/L pH7.4磷酸盐缓冲: 1/15mol/LNa2HPO4溶液80.8ml与1/15mol/LKH2PO419.2ml 混合即成。
（1）1/15mol/LNa2HPO4溶液: 取Na2HPO4.12H2O （MW：358.14）23.876 克, 加水至1000ml。
（2）1/15mol/LKH2PO4溶液:取KH2PO4（MW：136.09）1.814克,加水至200ml.6．0.02％甲烯蓝溶液7．液体石蜡[主要器材]1．新鲜猪心2．玻璃研钵3．漏斗4．手术剪5．棉花6．恒温水浴箱[操作步骤]1．心肌提取液的制备取新鲜猪心约6g，用蒸馏水清洗后剪成碎块，置于研钵中，加入适量净沙，研磨成糜状。
再加1/15mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液12ml，研成糊状，用棉花过滤，滤液即为猪心提取液。
实验5 琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
生物化学实验之－－
实验五 琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
山东师范大学生命科学学院
【实验目的】
了解丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制 作用。
【实验原理】
由于丙二酸与琥珀酸结构相似，可以竞争性 地抑制琥珀酸脱氢酶对于琥珀酸的脱氢作用。 在生物体内，肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶， 能催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸，同时放出大 量能量供肌体利用。
【思考题】
1. 为什么酶液的提取要在冰浴中进行？ 2. 各管中美蓝的褪色情况有何不同？为什么？
氧化型（蓝色）
【器材与试剂】
（一）器材 1. 恒温水浴锅 3. 研钵 5. 试管架 7. 漏斗 9. 脱脂棉 2. 手术剪 4. 试管 6. 刻度吸管 8. 小白鼠的肌肉 10. 吸水纸
（二）试剂 1. 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4） 2. 0.02mol/L丙二酸钠溶液 3. 0.02mol/L琥珀酸钠溶液 4. 0.01%美蓝溶液 5. 生理盐水 6. 液体石蜡
—
1 2 5
1
— 2 5
—
1 2 5
3. 将各试管摇匀，倾斜试管，沿管壁滴加 液体石蜡5滴，盖在液面，以隔绝空气。置于 370C水浴中保温，随时观察各管中美蓝的褪色 情况，并记录时间，解释结果。
【要点提示】
1. 提取酶液需在冰浴中进行，以防酶失活。 2. 实验过程中，需快速加入试剂，摇匀后迅 速加入液体石蜡。 3. 加液体石蜡的目的是为了使反应液与空气 隔绝，因此加液体石蜡时需斜执试管，沿管壁 加入，不要产生气泡。 4. 加完液体石蜡后，在观察结果的过程中， 不要摇动试管，以免溶液与空气接触而使美蓝 重新氧化变蓝。
琥珀酸脱氢酶作用及竞争抑制的观察
1.琥珀酸脱氢酶作用及竞争抑制的观察2.紫外分光法测定核酸含量本实验分组为15组，如果为16组，相应材料要增加。
需要的试剂配制方法注意事项1.5%琥珀酸钠溶液7.5g琥珀酸钠→500ml→15小瓶没有琥珀酸钠则用琥珀酸代替后用NaOH调和至PH7.01%丙二酸钠5g丙二酸钠→500ml→15小瓶没有丙二酸钠则用丙二酸代替后用NaOH调和至PH7.00.02%甲稀蓝0.1g甲稀蓝→500ml→15小瓶（棕色瓶）甲稀蓝别名亚甲酰蓝1/15mol/L Na2HPO4 23.6g Na2HPO4 →2000ml→15大瓶石蜡油可以不用分装每个房间在水浴锅前放1个核酸称一定量的小牛胸腺DNA融入0.1%的NaOH5-50ug/mL浓度羊的心脏切碎成小块大约2g左右提前购买，将皮、脂肪处理掉分割后放在冰箱里石英砂均匀的撒在上面注：每三个人一组，分为15组。
如果人数多可以适当多分几瓶试剂。
所需仪器所需数量40ml试剂瓶4560ml试剂瓶15试管4x152x15 共90个移液管（优先10ml的本次用5ml移液管）15研钵15种类数量心脏提取液151.5%琥珀酸钠151%丙二酸钠150.02%甲稀蓝15蒸馏水15液体石蜡 2胶头滴管共77个紫外吸收法测定核酸含量1、实验目的：1.掌握紫外吸收法测定核酸含量的原理2.掌握利用紫外线分光度计测定核酸含量二、实验原理：DNA和RNA都有吸收紫外线的性质，最大吸收峰在260nm波长处紫外线吸收是嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（－C＝C一C＝C 一），能够强烈吸收250~280nm 波长的紫外光。
等书上112页三、实验试剂与器材DNA样品紫外分光光度计四、实验步骤1.取DNA样品5ml，于紫外分光光度计上测定260nm与280nm处的OD值按下式按下式计算核酸浓度计算核酸浓度 DNA的质量浓度(mg/l)=OD260nm/0.020xL x稀释倍数计算核酸纯度=OD260nm/OD280nm2.取DNA样品5ml，沸水浴中加热5min于紫外分光光度计上，测260nm处的OD值比较DNA前后吸光度OD的差异。
琥珀酸
先在试管中加入琥珀酸钠、丙二酸钠、水、甲烯蓝、磷酸缓冲液等试剂，放在37℃恒温水浴中保温10min，再加入肌肉浆，混匀后立即在各管中加入0.5~1mL 液体石蜡，覆盖于液面上使试样与空气隔绝。在37℃恒温水浴中继续保温。从加入液体石蜡开始记录甲烯蓝变白所需时间。
注意事项
①第3管加入的肌肉浆预先用100 ℃恒温水浴中保温5min，以杀死酶活性作为对照管。
②观察变色时不要振动试管以免氧气调入管内影响变色。
三、仪器、原料和试剂
仪器
试管、恒温水浴锅、研钵。
原料
肌肉
试剂
1. 1/15mol/L—pH 7.0磷酸缓冲液
2. 0.1mol/L 琥珀酸钠
3. 0.01％甲烯蓝溶液
4. 0.04mol/L 丙二酸钠溶液
5. 石英砂
6. 液体石腊
四、操作方法
1.琥珀酸脱氢酶
(1)取肌肉2g，加磷酸缓冲液5mL 在研钵中研成肌肉浆。
(2)取试管2支，各加肌肉浆2mL，其中一管置100℃恒温水浴锅中保温5min，灭酶作为对照管。
两管各加0．01％甲烯蓝溶液2滴，各加0．1mol/L 琥珀酸钠溶液lmL，摇匀。
(3)各加液体石腊封口。
(4)在40℃恒温水浴中保温10min。
2.丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用
取3支试管编号(若定量，用比色法)，按下表加入各种试剂。
丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制刑。细菌量越多或脱氢酶活性越高甲烯蓝脱色所需时间越短。因此，甲烯蓝脱色所需时间的倒数可用来表示酶的活性或细菌生长的情况。
根据上述原理，可用甲烯蓝脱色法来测定脱氢酶或细菌含量。例如，在评定牛奶的等级时，可用此法测定牛奶中的杂菌含量，脱色越快，含菌量越高，牛奶质量越差。由于甲烯蓝容易被空气中的氧所氧化，所以实验需在无氧情况下进行。常用Thnbe ro(邓氏)管抽去空气进行反应，也可简化为，用液体石腊(或冻结琼脂)封闭反应液，制造无氧环境，这样可不用抽真空设备。
琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制实验的改进
０ ． ０ ２ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ丙 二 酸钠 ／ ｍ ｌ 蒸馏水／ ｍ ］
０ ． ０ ２ ｍｏ ｌ ／ Ｌ琥 珀 酸钠 ／ ｍ１
０ ３
１
１ ３
０
１ ２
１
１ １
２
１ ０
３
０ ． ０ １ ％ 次 甲基 蓝 ／ 滴
粗酶液／ ｍｌ
大 ，则 抑 制 作 用 增 强 。 生 物 化学 实 验教 程 （ 第 二 版 ） 教 材 中 琥 珀 酸 脱 氢酶 的竞 争 性 抑 制 实 验 是 生 物 化 学 实 验 课 程 的重
行 对 照 ，以 提 高 实 验 的 教 学 效 果 。
１ 粗 酶 液 制 备
称取活性 干酵 母 １ ｇ ，加 入 １ ０ ｍｌ ｐ Ｈ７ ． ４磷 酸 缓 冲溶 液 ，于 室 温 下 研 磨 成 匀 浆 备 用 。
琥 珀 酸 脱 氢 酶 的 竞 争 性 抑 制 实 验 的 改 进
刘 少 华 ，王 燕 ， 王 仁 雷
（ 江苏 第二 师范 学 院 生命 科 学与化 学化 工学 院 ，江苏 南 京 ２ １ ０ ０ １ ３ ）
摘 要 ：对 生 物 化 学 实验 中琥 珀 酸 脱 氢酶 的 竞 争性 抑 制 的 实验 进 行 改进 ，增 加 了平 行 对 照 ，从 而 增
等 ，从 而 最 终 影 响 了该 实 验 的 效 果 和 开 出率 。 针 对
分２ ０秒 左 右 褪 色 ，反 应 非 常灵 敏 。
３ 讨 论
改 进 后 的 实 验 不 仅 验 证 了丙 二 酸 对 琥 珀 酸 脱 氢
酶 的 竞 争 性 抑 制 作 用 ，而 且 还 进 一 步 增 强 了 学 生 关
应 的快 慢 ，还 可 以判 断 丙 二 酸 对 琥 珀 酸 脱 氢 酶 活 性 的抑 制 效 果 。
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3. 将各试管摇匀，倾斜试管，沿管壁滴加 将各试管摇匀，倾斜试管， 液体石蜡5滴 盖在液面，以隔绝空气。 液体石蜡 滴，盖在液面，以隔绝空气。置于 370C水浴中保温，随时观察各管中美蓝的褪色 水浴中保温， 水浴中保温 情况，并记录时间，解释结果。 情况，并记录时间，解释结果。
【要点提示】 要点提示】
试剂 ml） 肌提液 （ml） 0.02mol/L丙二酸钠 0.02mol/L丙二酸钠 溶液（ml） 溶液（ml） 蒸馏水（ml） 蒸馏水（ml） 0.02mol/L琥珀酸钠 0.02mol/L琥珀酸钠 溶液（ml） 溶液（ml） 0.01%美蓝溶液 美蓝溶液（ 0.01%美蓝溶液（滴） 1 2 — 1 2 5 试管编号 2 3 煮沸） 2 2（煮沸） 1 — 2 5 — 1 2 5
（二）试剂 1. 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4） 磷酸缓冲液（ 磷酸缓冲液 ） 2. 0.02mol/L丙二酸钠溶液 丙二酸钠溶液 3. 0.02mol/L琥珀酸钠溶液 琥珀酸钠溶液 4. 0.01%美蓝溶液 美蓝溶液 5. 生理盐水 6. 液体石蜡
【实验步骤】 实验步骤】
1. 制备肌提液（酶液）：取新杀死的动物肌肉 制备肌提液（酶液）： ）：取新杀死的动物肌肉 3～5g，加冷的磷酸缓冲液研磨，过滤，低温保 ～ ，加冷的磷酸缓冲液研磨，过滤， 备用。 存，备用。 2. 取试管 支，按下表操作。 取试管3支 按下表操作。
生物化学实验之－－ 生物化学实验之－－
实验五 琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
山东师范大学生命科学学院
【实验目的】 实验目的】
了解丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制 作用。 作用。
【实验原理】 实验原理】
由于丙二酸与琥珀酸结构相似， 由于丙二酸与琥珀酸结构相似，可以竞争性 地抑制琥珀酸脱氢酶对于琥珀酸的脱氢作用。 地抑制琥珀酸脱氢酶对于琥珀酸的脱氢作用。 在生物体内，肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶， 在生物体内，肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶， 能催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸， 能催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸，同时放出大 量能量供肌体利用。 量能量供肌体利用。
【思考题】 思考题】
1. 为什么酶液的提取要在冰浴中进行？ 为什么酶液的提取要在冰浴中进行？ 2. 各管中美蓝的褪色情况有何不同？为什么？ 各管中美蓝的褪色情况有何不同？为什么？
FAD FADH2
CH珀酸脱氢酶 氧化型（蓝色）
CHCOOH CHCOOH
＋ 美蓝－2H
还原型（无色）
延胡索酸
【器材与试剂】 器材与试剂】
（一）器材 1. 恒温水浴锅 3. 研钵 5. 试管架 7. 漏斗 9. 脱脂棉 2. 手术剪 4. 试管 6. 刻度吸管 8. 小白鼠的肌肉 10. 吸水纸
1. 提取酶液需在冰浴中进行，以防酶失活。 提取酶液需在冰浴中进行，以防酶失活。 2. 实验过程中，需快速加入试剂，摇匀后迅 实验过程中，需快速加入试剂， 速加入液体石蜡。 速加入液体石蜡。 3. 加液体石蜡的目的是为了使反应液与空气 隔绝，因此加液体石蜡时需斜执试管， 隔绝，因此加液体石蜡时需斜执试管，沿管壁 加入，不要产生气泡。 加入，不要产生气泡。 4. 加完液体石蜡后，在观察结果的过程中， 加完液体石蜡后，在观察结果的过程中， 不要摇动试管， 不要摇动试管，以免溶液与空气接触而使美蓝 重新氧化变蓝。 重新氧化变蓝。
在生物体外， 在生物体外，可以人为地提供无氧的条件进 行实验，反应中生成的FADH2可使氧化型美蓝 行实验，反应中生成的 蓝色）转变成还原型美蓝（无色）。因此， ）。因此 （蓝色）转变成还原型美蓝（无色）。因此，可 以从美蓝的颜色变化观察琥珀酸脱氢酶的作用。 以从美蓝的颜色变化观察琥珀酸脱氢酶的作用。