黄蜀葵毛状根培养体系的建立及次生代谢产物研究
高产巨大戟醇铁海棠毛状根培养体系的构建
孙 茜，李丕睿，陈梅香，等．高产巨大戟醇铁海棠毛状根培养体系的构建［Ｊ］．江苏农业科学，２０２４，５２（１）：１３４－１４１．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２４．０１．０２０高产巨大戟醇铁海棠毛状根培养体系的构建孙 茜１，２，李丕睿２，陈梅香２，代 炎１，２，陈鹏旭１，２，冯 煦２，陈 雨２［１．南京中医药大学，江苏南京２１００２３；２．江苏省中国科学院植物研究所（南京中山植物园）／江苏省中药材生态种植与高值化利用工程研究中心，江苏南京２１００１４］ 摘要：为构建高产巨大戟醇的铁海棠毛状根培养体系，研究比较了６个不同品种铁海棠茎叶部分的巨大戟醇含量，以含量高的铁海棠原种的花梗及叶盘为外植体，考察不同菌株以及不同侵染条件对其诱导率的影响，筛选适宜铁海棠毛状根生长的液体培养基，并比较了铁海棠毛状根和植株中的巨大戟醇含量差异。
结果表明：（１）铁海棠６个品种间巨大戟醇含量存在显著差异，含量最高的为铁海棠原种。
（２）以铁海棠原种的花梗为外植体，预培养７ｄ，以Ｄ６００ｎｍ＝０．６的ＡｒＡ４菌液侵染６ｍｉｎ，转入１／２ＭＳ固体培养基中共培养３ｄ可获得最佳转化效果，毛状根诱导率最高达６８．３３％。
（３）毛状根在１／２ＭＳ液体培养基中生长迅速，长势良好。
（４）毛状根中巨大戟醇的含量显著高于铁海棠原种植株中各部位的含量，达到５９３．１４ｍｇ／ｋｇ，鲜质量为０．５０ｇ的毛状根经悬浮培养１０ｄ后，可获得１３２．２７μｇ巨大戟醇。
铁海棠６个品种中以铁海棠原种巨大戟醇含量最高，利用发根农杆菌ＡｒＡ４侵染铁海棠原种花梗，成功建立了铁海棠毛状根的高效诱导及悬浮培养体系，且获得的毛状根中巨大戟醇含量高于原植株，为高效获得巨大戟醇提供了新的途径。
关键词：铁海棠；巨大戟醇；毛状根；发根农杆菌；诱导率 中图分类号：Ｓ５６７．１＋９０．４３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０２４）０１－０１３４－０７收稿日期：２０２３－０３－０９基金项目：国家自然科学基金（编号：３２２７０４０４）；江苏省农业科技自主创新资金［编号：ＣＸ（２２）３０６８］。
植物次生代谢产物的生产技术及工艺进展
植物次生代谢产物的生产技术及工艺进展植物次生代谢产物是植物生命活动中的重要组成部分，在生态系统中发挥着重要的作用。
它们除了在自己的生长中起到重要的作用外，还有很多药用价值。
其中有一些物质已经被广泛地用于医药、香料、染料、高级材料等领域。
然而，由于各种因素的制约，植物次生代谢产物的生产一直是相对困难的。
接下来，我会就植物次生代谢产物的生产技术及工艺进展这一话题进行探讨。
一、植物次生代谢产物的生产技术大体分类生产一直是植物次生代谢产物生产的难点。
在过去，传统的化学合成方法被认为是主要的生产途径。
然而，这种方法的成本较高，且仅适用于某些化学物质的生产。
现在，人们发现通过细胞培养建立起的次生代谢产物生产系统是一种新的方法。
这种方法借助植物本身的代谢机制，可以建立高效、连续、大规模的生产系统，从而大大提高了生产效率。
接下来，我们将对这两种方法进行简单的介绍。
1.1 传统的化学合成方法传统的化学合成方法是指通过人工合成的方式，在实验室中根据物质结构和反应机理对物质进行合成。
和传统的制药行业一样，这种方法也存在许多缺陷。
首先，植物次生代谢产物的化学结构较为复杂，需要很多繁琐的反应步骤，耗时耗力，且合成的产物纯度较低。
其次，这种方法长期以来忽视了环境和生态等方面问题，不利于现代可持续发展的趋势。
1.2 细胞培养方法细胞培养技术是指在体外培养细胞，利用细胞本身的基因信息和代谢途径来合成目标产品。
细胞培养技术具有高效、连续、规模化生产、高纯度、低成本等优点。
尤其在植物次生代谢产物生产领域已经得到广泛应用，成为一种主要的生产方式。
现有的细胞培养方式大致分为固定化细胞培养、悬浮细胞培养、和器官培养三类。
二、植物次生代谢产物的生产工艺进展近年来，随着生物技术的不断发展，植物次生代谢产物的生产效率有了很大的提高。
这里，我们将分别从遗传工程、代谢工程、转化工程、预处理工程和精制工程等方面来介绍植物次生代谢产物生产的几项技术进展。
三叶青毛状根的诱导及其液体培养体系的研究
三叶青毛状根的诱导及其液体培养体系的研究向倩倩;杨佳瑶;侯梓淇;杨宗岐;郭万里【摘要】为建立三叶青毛状根的诱导和液体培养体系,采用发根农杆菌株系C58C1和ATCC15834进行毛状根的诱导,通过无菌三叶青叶片预培养、浸染、共培养、筛选、形态和PCR鉴定等过程获得三叶青毛状根根系,并对三叶青毛状根和两年生块根总黄酮进行比较分析.试验结果表明,发根农杆菌C58C1能从三叶青叶片诱导出毛状根,三叶青毛状根在不添加生长素的1/2MS液体培养基中生长状态良好,其总黄酮含量约是2年生三叶青块根的1/5.【期刊名称】《林业科技》【年(卷),期】2019(044)004【总页数】5页(P5-9)【关键词】三叶青;毛状根;C58C1;黄酮;液体培养【作者】向倩倩;杨佳瑶;侯梓淇;杨宗岐;郭万里【作者单位】浙江理工大学生命科学与医药学院,杭州 310018;浙江理工大学生命科学与医药学院,杭州 310018;浙江理工大学生命科学与医药学院,杭州 310018;浙江理工大学生命科学与医药学院,杭州 310018;浙江理工大学生命科学与医药学院,杭州 310018【正文语种】中文【中图分类】S567.23+9;S503.52三叶青(Tetrastigma hemsleyanum)是葡萄科崖爬藤属植物，俗名金线吊葫芦、蛇附子、石老鼠等，为我国特有珍稀药用植物，全草可入药，以地下块根最佳[1,2]。
近些年来，三叶青块根被发现具有低毒和抗癌特性[3-10]，自然资源遭到规模化人为破坏[11-12]。
三叶青自然生长条件苛刻，生长缓慢，人工栽培技术还不成熟，难以满足快速增长的市场需求。
尽管人们对三叶青进行了微繁和细胞培养研究，但规模化应用明显不足[13-14]。
另一方面，人们在三叶青块根中发现了大量的黄酮类物质[15-19]，但一直没有确定其主效成分。
毛状根具有生长速度快、遗传稳定、培养周期短、条件可控等优点，可为植物次生代谢产物的规模生产、作物品种改良、环境修复以及相关理论的研究提供快捷的培养体系[20]。
第六章毛状根培养
毛状根培养反应器
毛状根培养技术的优点
1.生长速度快
毛状根有大量的分枝和根毛, 生长快,可用于大量培养。 毛状根中的T-DNA片段上有生长 素合成酶基因。 毛状根是细胞分化而来的根组 织，属于单克隆,具有遗传稳 定性。 发根农杆菌中的Ri质粒是一个 很好的转基因载体,可把目的 基因导入植物细胞中
2.激素自养性
毛状根的培养方法
具体培养方法
固体培养
•
成批培养 连续培养
液体培养法
两相培养法
•
•
大规模发酵培养
毛状根的筛选与鉴定
筛选：选择生长速度较快、分枝较多的毛状根 株系进行扩大培养 鉴定：
形态学水平：激素自养，根丛生，多分枝
多根毛，无向地性 细胞水平：冠瘿碱的测定 （硝酸银染色）
，
毛状根培养反应器
利用发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA
整合到植物细胞上,使植物细胞诱导产生 毛状根。
2.毛状根培养体系
除菌
发根农杆菌菌株的筛选及活化
发根农杆菌菌株的类型： 农杆碱型（agropine type） 胭脂碱型 章碱型
农杆菌菌株的筛选及活化
将菌株在液体培养基上培养（含乙酰丁香酮），
激活vir区的基因，为Ri质粒的转移提供先决条件
生物技术，其次级代谢物质的生产能力遗传及生化稳定性增 加生物量的可操作性等特点都引起了人们相当大的兴趣 。 缺：目前的生物反应器还难以满足毛状根大规模培养的要求, 主要限制因素为物质的转移,毛状根生长时易成团,限制了营养 和氧气的进入。 缺：由于目前对农杆菌不同菌株间侵染物种能力的差异机理 还不够了解，并且不同物种间诱导形成毛状根的能力也不同 ，目前为止仅应用于部分的双子叶植物和少部分的单子叶植 物及裸子植物，应用范围较窄。
园艺疗法
Structure of flavonoids
根据C3单位的氧化程度不同，类 黄酮又分为不同的种类： 黄酮醇（flavonols)
黄
酮（flavones)
花色素苷（anthocyanins) 异类黄酮（isoflavonoids)
黄酮生物合成的途径
（液体培养）。
在工厂化生产中，为了提高有用物质产品的产量和质量， 对细胞培养的选择有两个基本要求： ①有用物质的合成积累能力强 ②生长速度快
2.3 苯丙烷类 phenylpropanoid
广泛分布于植物界 ，尤其在伞形科、芸香科、菊科、豆科、 茄科中更为普遍，多以游离态或糖苷等形式存在于植物的花、果实、 叶、茎中
2.4 醌类 quinonoid
醌类化合物 (quinonoids, quinones)广泛存在于自然界，源 于植物的醌类主要集中于紫草科、茜草科、紫葳科、蓼科、 胡桃科、鼠李科、紫金牛科、百合科
宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。
利用细胞培养生产有用物质
利用细胞培养生产有用物质的一般程序
（1）选材 应注意以下条件：
①药效肯定； ②对其有效成分有充分的了解； ③有测定有效成分和药理的可靠方法； ④市场短缺或价格昂贵； ⑤取有药效成分的部位，且该部位较 易形成愈伤组织。
（2）细胞株系建立 将诱导产生的愈伤组织进行分离，建立悬浮细胞繁殖体系
植物细胞培养
在离体条件下将易分散的植物组织或植物愈伤组织臵于液体 培养基中，将组织振荡分散成游离的悬浮细胞，通过继代培 养使细胞增殖来获得大量细胞群体的方法。
从细胞生长与培养技术方面讲必须满足 以下3个条件：
1、培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产 量恒定的产物。 2、细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时 间内能得到较高产量的终产物。 3、代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解， 最好能将其释放到培养基中。
黄芪次生代谢研究进展
黄芪次生代谢研究进展张开雪;刘振鹏;闫嵩;任伟超;刘秀波;马伟【摘要】目的:黄芪为豆科植物,它的生物活性成分种类很多,且都有不同的药理作用.黄芪内生真菌的报道很少,所以对它的研究才刚刚开始.植物次生代谢网络复杂,利用诱导子提高植物特定代谢途径的次生代谢产物的产量,对生物合成途径进行调控.诱导子分为生物诱导子和非生物诱导子,而关于诱导子的作用机理,只有一个初步的假说,没有作用机理的指导,筛选也较盲目.为了消除试验的背景噪音,无土栽培方式在植物内生真菌及根际微生物研究中,消除了土壤菌群的影响.随着新学科的产生和新技术的发展,组学技术、新一代测序技术应运而生,并在各个领域得到广泛应用.【期刊名称】《世界科学技术-中医药现代化》【年(卷),期】2016(018)005【总页数】8页(P875-882)【关键词】黄芪;次生代谢;诱导子;无土栽培;组学技术;新一代组学技术【作者】张开雪;刘振鹏;闫嵩;任伟超;刘秀波;马伟【作者单位】黑龙江中医药大学药学院哈尔滨 150040;黑龙江中医药大学药学院哈尔滨 150040;黑龙江中医药大学药学院哈尔滨 150040;黑龙江中医药大学药学院哈尔滨 150040;黑龙江中医药大学药学院哈尔滨 150040;黑龙江中医药大学药学院哈尔滨 150040【正文语种】中文【中图分类】R282.2《中国药典》（2015版）规定，黄芪是蒙古黄芪 Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.var. mongholicus (Bge.) Hsiao或膜荚黄芪 Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.的干燥根，而蒙古黄芪是膜荚黄芪的变种。
黄芪又称戴糁、芰草、百木、黄耆，首载于中国古代第一部本草著作《神农本草经》，味甘，性微温，归肺、脾经，具有补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，行滞通痹，托毒排脓，敛疮生肌等功效[1-6]。
转基因何首乌毛状根的研究进展
转基因何首乌毛状根的研究进展作者：罗巧妮黎世婵佘婷婷生书晶来源：《现代农业科技》2020年第02期摘要; ; 何首乌毛状根体系因为遗传稳定、生长迅速的特点，在次生代谢产物合成和提取方面具有优势。
本文概述了何首乌毛状根体系的诱导和培养过程、影响何首乌毛状根生长及其次生代谢产物积累的因素，并就何首乌毛状根在生物转化以及次生代谢工程方面的应用前景进行了展望。
关键词; ;何首乌;毛状根;生物转化;次生代谢工程中图分类号; ; R282.71; ; ; ; 文献标识码; ; A文章编号; ;1007-5739（2020）02-0054-02; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ;开放科学（资源服务）标识码（OSID）Abstract; ; Because of the characteristics of genetic stability and rapid growth，the hairy root system of Polygonum multiflorum has advantages in the synthesis and extraction of secondary metabolites.This paper summarized the induction and culture process of Polygonum multiflorum hairy roots，the factors affecting the growth of hairy roots and the accumulation of secondary metabolites and forecasted the application prospects of Polygonum multiflorum hairy roots in biotransformation and secondary metabolic engineering.Key words; ; Polygonum multiflorum;hairy root;biotransformation;secondary metabolic engineering何首烏是我国历代常用的传统中药材，含有二苯乙烯苷类、蒽醌类、总糖及还原糖等重要化学成分，具有极大的药用价值[1]。
发根农杆菌侵染大豆产生发根的研究
发根农杆菌侵染大豆产生发根的研究李泉木;朱筠;曹越平【摘要】利用A4发根农杆菌,对不同大豆品种的无菌苗采用针刺的方法对子叶节部位进行接种,诱导毛状根产生,测定毛状根中大豆苷元的含量.结果表明,以合丰35为受体材料,毛状根诱导率最高,为58％,明显高于其他处理.发根中大豆苷元的含量是正常无菌苗和大田幼苗根中含量的2倍.%12 soybean materials were infected by Agrobacterium rhizogenes A4, and daidzein content was determined in hairy roots which were induced by inoculating Agrobacterium rhizogenes A4. "Hefeng 35" was tested to be the best receptor among the 12 materials. Inoculating by needle on soybean cotyledon node was the best method for inducing hairy roots, the induced rate was 58%. Daidzein content in hairy roots was 2 times of that in seedling cultivated in medium and field.【期刊名称】《上海交通大学学报（农业科学版）》【年(卷),期】2012(030)001【总页数】6页(P55-60)【关键词】大豆;发根农杆菌;发根;大豆苷元【作者】李泉木;朱筠;曹越平【作者单位】上海交通大学农业与生物学院,上海200240;辽宁省农业科学院所,沈阳110161;上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海200240【正文语种】中文【中图分类】S565.1大豆是重要的粮油兼用作物，其脂肪、蛋白质、碳水化合物、粗纤维的组成比例非常接近于肉类食品。
黄蜀葵的资源及药学研究进展
(BMC) 和骨矿物质密度(BMD) 明显提高。说明黄蜀葵有一定
预防骨丢失作用 。
3 小结与讨论
黄蜀葵疗效确切 ,应用广泛。但是目前由于种种原因 ,
黄蜀葵市场比较小 ,应用范围有局限性 ,没有得到充分地开
发和利用。为了更好地开发黄蜀葵 ,应尽快建立黄蜀葵的
GAP 基地 ,与此同时采取生物工程技术 ,加深研究开发力度。
(1. 西藏民族学院医学系 ,陕西咸阳 712082 ;2. 西北大学生命科学学院中药学系 ,陕西西安 710069)
摘要 [ 目的]研究黄蜀葵的资源及药理学作用。[ 方法]通过查阅国内外发表的文献 ,综述了黄蜀葵各部分的化学成分及其药理作用。 [ 结果]传统中药蜀葵中含有黄酮、蜀葵多糖、槲皮素、挥发油、甙类及有机酸等 ;药理研究证明 ,蜀葵具有镇痛、抗炎、解热及降低血脂的 作用。[ 结论]蜀葵含有多种化学成分 ,从蜀葵中可找到治疗抗感染和心脑血管的药物。 关键词 蜀葵 ;成分 ;药理活性 ;黄蜀葵花总黄酮(TFA) 中图分类号 S567. 23 + 9 文献标识码 A 文章编号 0517 - 6611(2009) 15 - 06979 - 02
药用植物毛状根的诱导及其应用
药用植物毛状根的诱导及其应用植物毛状根培养是植物组织培养中的一种，因其不仅克服了植物生长缓慢、有效成分积累有限的不足，且具有不依赖外源植物激素等优点，近年来研究较多。
文章介绍了目前药用植物毛状根的诱导情况，并总结了植物毛状根培养体系在次生代谢物的生产、生物合成机制及调控基因的研究、植物基因工程、生物转化以及药物蛋白中的应用，旨在为其他药用植物毛状根的培养及利用提供参考依据。
标签：毛状根；药用植物；次生代谢产物；发根农杆菌；生物转化1 药用植物毛状根的诱导1.1 毛状根的发根机制毛状根（hairy roots）是发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes感染植物后，在植株创伤表面诱导产生的一种特殊表现型。
早在1907年，Smith和Townsend 就发现发根农杆菌能够诱导植物产生毛状根，此后，学者们发现无论是发根农杆菌还是根癌农杆菌A. tumefaciens，其致病原因均是由大分子质粒引起的[1-2]，但发根农杆菌的致病质粒与其他Ti质粒（根瘤诱导质粒）功能既有差异又有联系[3]。
直到1982年，美国科学家Chilton[4]发表文章阐述其发根机制：发根农杆菌中Ri质粒上T-DNA进入宿主植物细胞引发了毛状根的产生。
Ri质粒是发根农杆菌染色体外的一个约250 kb的大质粒，其上面存在2个与转化有关的功能区，即T-DNA（转移区）和Vir（致病区）。
T-DNA的主要功能是在转化时进入植物细胞并插入到寄主植物基因组中，表达决定毛状根生长和冠瘿碱合成的基因；Vir区的作用是协助T-DNA区完成转化。
Vir区上有7个操纵子VirA-G，轉化时，植物伤口产生小分子酚类化合物与VirA的表达产物结合，激活其他Vir基因，使T-DNA被剪切、转移并最终整合到宿主细胞基因组中。
因此，单子叶植物不能合成特异性小分子酚类化合物是其难以被侵染诱导出毛状根的主要原因[5-7]。
1.2 药用植物毛状根诱导情况目前，已有近百种药用植物成功诱导出毛状根，总结发现其中76%为草本植物，也有少量藤本及木本植物，比例分别占到7%，17%；在植物学分类方面，已诱导出毛状根的药用植物科属分类较为分散，其中豆科、茄科、菊科和唇形科占有相对较大的比例（表1）。