凋落物PLFA取样和处理方法
土壤PLFA的步骤
取液
4.5ml/ 样品数
氯仿:甲醇:柠檬酸缓冲 液=1:2:0.8(体积比)
3 正已烷氯仿混合液
4ml/样品数
正已烷:氯仿=4:1(体积 比)
4 甲醇甲苯混合液
1ml/样品数
甲醇:甲苯=1:1(体积比)
试5
丙酮
剂
0.2mol/L 氢氧化钾
6
甲醇溶液
内标 14:0 脂肪酸 7
甲酯
8
1M 冰醋酸
5ml/样品数 1ml/样品数 0.2ml/ 样品数 0.3ml/ 样品数
之后，按顺序加入以下试剂：1.5ml 柠檬酸缓冲液（可用枪），1.9ml 氯仿（移液管，凡 是转移有机溶剂，均需用移液管或滴管等玻璃仪器，以下同），3.75ml 甲醇，2mlBligh-Dyer 土壤提取液。 3、旋涡振荡 5 分钟。 4、避光静置过夜（提取效率 95％）。
第三天： 1、吸取上清液于 30mlTeflon 离心管中，注意不要把土样移入，宁可少转一点。放入 0℃冰
的 2-4 个 10ml 的 3 个,5ml 的 6 个,2ml 的 5 个,1ml
的5个 5 个/样品数
50ml 的带盖试管
分析化学：取样与样品预处理方法
3、吸附法
利用组分的挥发性和沸点不同， 提取挥发性组分。
5、溶剂萃取法
（1）提取溶剂的选择原则：相似相溶
（2）常用溶剂的种类
强极性溶剂：水 中等极性溶剂：乙醇、甲醇、丙酮 低极性溶剂：石油醚、氯仿、乙酸乙酯
（3）常用提取方法
萃取法（分液漏斗中） 冷浸法（适用于热不稳定组分的提取） 回流法 超声波和微波辅助溶剂提取法
二、降解法
因化学分析是在溶液中进行，故需要先将试样分解， 使被测组分定量转入溶液中，然后进行其它预处理和测 定。
1、碱熔法：固体样品+碱熔剂→高温熔融→加适当
酸 溶解→样品溶液
2、燃烧法 3、干式消化（灰化）：
高温干式消化（500～800℃）（有机物灼烧破坏） 低温干式消化（100～150℃）（有机物缓慢氧化）
2、原则： 均匀、合理
二、取样的方法 代表性
气体、液体：均匀，易达到 固体：四分法 不均匀个体大的固体样品（如中药材）：
1、破碎 2、过筛 3、混合 4、缩分（四分法）
三、样品的保存 应防止污染、分解及基体变化
第二节 经典样品预处理方法
一、分离技术： 利用待测组分与共存干扰组分和基质理
化性质的差异，对样品进行分离纯化处理。 1、过滤与离心
4、湿式消化：加高浓度酸或混酸加热分解样品 三、（样硝酸品、浓硝缩酸技-硫术酸、硝酸-高氯酸）
当样品组分浓度较小时，可通过挥发溶剂浓集样品。
第三节 现代样品预处理技术
一、固相萃取技术：基于液-固分离萃取的样品预处理技术
固相萃取可近似看成是一个简单的液相色谱过程，吸附剂作 为固定相，当样品溶液与吸附剂相接触时，其中的某些组分 （杂质或待测组分）保留在吸附剂上，然后待测组分再被适当 的洗脱剂洗脱，即可得到纯化和富集的待测组分。
森林凋落物取样及剖面结构图片获取技术
辽
宁 林 业
科 技
２ ０１ ５ № ５
第 ５期
Ｊ ｏ ｕｒ ｎａ ｌ ｏｆ Ｌｉ ａ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ Ｆｏ ｒ ｅ ｓ ｔ ｒ ｙ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎｃ ｅ ＆ Ｔｅ ｃ ｈ ｎ ｏｌ ｏｇ ｙ
森林凋落物取样及剖面结构图片获取技术
陈英 敏 ， 李 根柱 ， 张 自川
Ａｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙｆ ｏ ｒ ｆ ｏ ｒ ｅ ｓ ｔ ｌ ｉ ｔ ｔ ｅ ｒｓ ａ ｍｐ ｌ ｉ ｎ ｇａ ｎ ｄ
ｉ ｔ ｓ ｃ ｒ ｏ ｓ ｓ — － ｓ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｕ ｒ ｅ ｃ ａ ｐ ｔ ｕ ｒ ｉ ｎ ｇ
进 行 石蜡 固化 以提 高硬 度 ， 再 对 经石 蜡 固化 的凋 落物模 块 剖 面切 割 、 刨光， 将 剖 面 刨光 部分 的石 蜡
溶化 后 ， 对 剖 面进行 扫 描 ， 以获得 森 林 凋 落物剖 面结构 图片 。结 果表 明 ， 取样 凋落物 基 本保 持 了原 始 结构 ， 具有 一 定 的硬 度 ， 可 以取 回 实验 室操 作 ， 所 获剖 面 结构 图片 清晰 准 确 ， 可 以 对 图 片进 行 信
ＣＨＥＮ Ｙｉ ｎｇ ｍｉ ｎ， ＬＩ Ｇｅ ｎ ｚ ｈ ｕ， ＺＨＡＮＧ Ｚｉ ｃ ｈ ｕａ ｎ
（ Ｉ ｎ ｓ ｉ ｔ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｍｏ ｄ ｅ ｍＡ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ， Ｄａ ｌ ｉ ａ ｎ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｄ ａ ｌ ｉ ａ ｎ １ １ ６ ６ ２ ２ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
息提取 及 相 关数据 的 计算 工作 。
凋落物PLFA取样和处理方法
凋落物和土壤前处理取样：每个次小区分别取1袋米老排凋落物和1袋杉木凋落物，每个网袋单独装入一个塑料袋；同时用土钻取网袋下面0-10cm土壤装入自封袋。
共36个网袋+36个土样。
网袋和土壤放在装有冰块的冰盒带回实验室。
凋落物前处理：1，混合：凋落物带回实验室后，用剪刀剪碎混合，分成三份，一份-20℃冷藏做PLFA，一份4℃保鲜做凋落物酶，另一份烘干称重计算分解速率。
2，脱水：把-20℃冷藏的凋落物放入冷冻干燥机脱水（-80℃），24小时左右3，粉碎：脱水之后的凋落物用球磨机粉碎，装入自封袋，封好袋口，-20℃冷冻。
4，运输：把凋落物和土壤样品装入放有冰块的大冰盒带到广州。
5，实验时每个样品用量为0.1g（华南植物园），其他程序与土壤PLFA一样。
土壤前处理：带回实验室的土壤人工挑拣出石子，细根等，然后混合放在-20℃冷冻带到广州。
具体实验步骤：1、凋落物样品用球磨机粉碎（<10 μm）2、称取冷冻干燥后的凋落物样品（250±1 mg）于玻璃离心管中（25 ml），用磷酸钾溶液（50 mmol l-1, pH 7.4）1.6 ml 、甲醇4 ml、氯仿 2 ml；3、涡旋30s，超声2 min，在37℃下温育30min，然后离心（800×g），将上层清液倒入50 ml分液漏斗中。
然后再重复浸提一次，合并两次上层清液。
4、向分液漏斗中再加入4 ml氯仿，4 ml水，然后轻轻的摇匀，放置整晚。
第二天5、收集分液漏斗中的下层清液（氯仿相），在氮气下吹干。
6、通过色谱硅胶小柱进行脂质分离：用氯仿（3×2 ml）洗脱中性脂质，用丙酮（3×2 ml）洗脱糖脂，这些全部丢弃。
最后用甲醇（3×2 ml）洗脱极性脂类，收集到玻璃试管中。
在氮气下吹干。
7、在剩余残留物中，加入2ml氢氧化钾（KOH），1 ml甲苯：甲醇（1：1，v/v），然后在37℃下温育30 min。
长期稻-稻-油菜轮作对土壤理化性质及微生物群落结构的影响
长期稻-稻-油菜轮作对土壤理化性质及微生物群落结构的影响杨敬林;李琳;胡德勇【摘要】为探究南方丘陵地区稻-稻-油菜轮作对土壤理化性质和微生物群落结构的影响,采用常规土壤农化分析和磷脂脂肪酸(PLFA)分析方法,以安仁县长期稻-稻-油菜轮作(DDY)和稻-稻连作(DD)土壤为研究对象,比较长期(30 a)DDY和DD处理后3个时期(早稻成熟期、晚稻成熟期、油菜成熟期)土壤理化性质和微生物群落结构的差异.结果表明,DDY处理土壤全氮、全磷含量及pH值均低于DD处理,其中,全氮含量在3个时期均差异显著,全钾含量增加但与DD处理差异不显著,有机质、碱解氮、速效磷、速效钾含量呈动态变化.轮作对土壤全氮含量影响较大,3个时期DDY处理全氮含量分别较DD处理降低50.76％、46.67％、49.62％.土壤微生物PLFA分析结果表明,与DD处理相比,DDY处理土壤微生物PLFA总量显著提高,3个时期分别提高19.69％、20.20％、49.12％,其中,DDY处理土壤细菌PLFA量显著增加,真菌PLFA量显著降低,真菌与细菌PLFA量比值显著降低.对土壤微生物PLFA进行主成分分析表明,轮作对微生物群落结构产生明显影响,2种种植方式主要影响土壤中细菌和真菌的数量.总之,长期稻-稻-油菜轮作促进了土壤全氮和全磷的分解,显著提高微生物生物量,尤其是细菌生物量,显著降低真菌生物量,提高两者的比值.%To explore the effect of rice-rice-rape rotation on soil physicochemical properties and microbial community structure in hilly area of southern China,the soil microbial biomass and composition of two kinds of different tillage systems[long rice-rice-rape rotation(DDY) and rice-rice continuous cropping(DD)] after 30 years of rotation were analyzed by PLFA marker spectrum analysis method,and the soil physicochemical properties during three periods(including the mature stages of early rice,late rice and oilseedrape) were studied.The results showed that compared with DD treatment,the contents of total N and total P and pH value of DDY treatment decreased,there was a significant defference for total N content,the total N content of DDY treatment significantly decreased by 50.76%,46.67%,49.62%;the total K content of DDY treatment increased,but the difference was not significant;the contents of organic matter,alkali-hydrolyzable N,available P,available K showed dynamic changes.Soil microbial PLFA marker test showed that compared with DD treatment,soil microbial PLFA amount of DDY treatment increased by 19.69%,20.20% and 49.12% at three different determination stages,respectively;the bacterial PLFA amount of DDY treatment increased,the fungi PLFA amount of DDY treatment decreased,and the ratio of fungi PLFA amount to bacteria PLFA amount of DDY treatment decreased.The principal component analysis of microbial PLFA showed that rotation obviously influenced the microbial community structure,the amount of bacteria and fungi were mainly affected by two tillage methods.Overall,the long term rice-rice-rape rotation promoted the decomposition of total N and P,significantly improved the microbial biomass,especialy bacteria,significantly decreased the fungal biomass,significantly increased the ratio of bacteria to fungi.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2017(046)009【总页数】6页(P45-49,61)【关键词】稻-稻连作;稻-稻-油菜轮作;土壤;微生物群落结构【作者】杨敬林;李琳;胡德勇【作者单位】湖南农业大学工学院,湖南长沙 410128;湖南师范大学数学与计算机科学学院,湖南长沙 410081;湖南农业大学工学院,湖南长沙 410128【正文语种】中文【中图分类】S154.3轮作是指同一块土地上有计划地按顺序轮种不同类型作物的复种形式，该栽培措施对改善土壤质地、促进作物生长和产量提高具有显著效应[1-3]。
PLFA 方法分为三个步骤
PLFA 方法分为三个步骤，分别是提取、分离和甲酯化（1）提取：称2 g 干土加入4 mL 柠檬酸缓冲液（0.15 mol/L 二水柠檬酸三钠，0.15 mol/L 柠檬酸），5 mL 氯仿，10 mL 甲醇（柠檬酸缓冲液∶氯仿∶甲醇=0.8∶1∶2），轻微涡旋震荡30 s，超声处理2 min，25 ℃避光震荡2 h，4000 r/min离心10 min，将上清液转移到一个新的离心管中，重复操作取上清液（重复取的上清液放置于一个新的40 mL 的离心管中）。
每个离心管中各加入5 mL 柠檬酸缓冲液和5 mL 氯仿（柠檬酸缓冲液∶氯仿∶甲醇=0.9:1:1），震荡过夜，2500 rpm 离心20 min。
经过夜分离后，吸走上层（大约2/3）保留底层氯仿相，过处理定量滤纸（氯仿和甲醇混合液（2:1，V/V）浸泡处理），二者合并，在氮气流下吹干氯仿或者旋转蒸发（温度低于35 ℃）。
（2）分离：用0.5 mL 氯仿溶解，将氯仿加到硅胶柱顶部，过填充有活化硅胶（使用丙酮索氏提取硅胶6-8 h，120 ℃活化2 h）的玻璃管柱（高100 mm，直径6 mm），然后依次分别加入4×2.5 mL 氯仿、4×2.5 mL 丙酮、4×2.5 mL 甲醇（每次溶剂加入后自然洗脱至无液滴自然流下时真空抽干），收集甲醇相在氮气流下吹干。
（3）甲脂化：向吹干样品中加入1 mL 甲醇∶甲苯（1:1）和1 mL 0.2mol/LKOH 甲醇溶液（新鲜配制，甲醇不含水），手动摇晃 1 min，放入水浴35~36℃温浴15 min，后冷却到室温，依次加入2 mL 去离子水，0.3 mL 1 mol/LHAc，2 mL 正己烷，漩涡混合30 s，然后3000 r/min 离心10 min，重复提取（仅添加正己烷）一次，合并两次提取的正己烷相，加入甲脂化的C19:0 为内标，氮气流下吹干或者旋转蒸发，-20 ℃冷冻保存，在上机测定前用100 μL 正己烷（色谱纯）定容待测。
PLFA法研究稻草固态发酵中的微生物群落结构变化
Ｍｉ ｏｉ Ｃ ｍｍ ｎ ｙ ａｇｓ ｒ ｇ Ｄ ｇａａ ｏ ｏ Ｓｒｗ ｉ Ｐ ｏｐｏｐ ｃ ｂａ ｏ ｕ ｉ Ｃ ｎｅ Ｄ ｉ ｔｅ ｒｄｔ ｎ ｔ Ｕ ｎ ｈｓｈｌ ｉ ｒ ｌ ｔ ｈ ｕｎ ｈ ｅ ｉ ｆ ａ ｓ ｇ ｉｄ Ｆｔ Ａ ｉ Ａ ａ ｓ ａ ｙ ｄ ｌ ｉ ｔ ｃ ｎ ｙｓ
生物降解效率提供依据 ．
１ 材料与方法
Ｐ ＡＰ ｓｏ ｉａ ａ ） 分 法５ １ ｉｇ Ｌ （ ｏｈｉ ｆｙ 谱图 析 １１、ｏ Ｆ ｈｐｌｄ ｃ ｐ ｔ ｉ ｔ ｄ － ｌ ７ Ｂｏ 法．ｌ 子生物学方法“’ 力图克 【０ ２ 和分 ， 〔‘ 一都 〕 服这一 难
点， 但是Ｂ ｌ 法不适于分析整个微生物群落结构， ｉｇ ｏ ｏ
（ 湖南大学环境科学与工程学院， 长沙 ４０８） １ ２ ０
摘要： 在稻草固态发酵体系中同时接种土壤微生物和黄抱原毛平革菌， 用磷脂脂肪酸（ＩＡ Ｐ ） Ｍ 谱图分析法研究发酵过程的微生
物群落和生物量变化， 同时监侧木质纤维素降解率的变化， 结果表明 发酵后木质纤维素的降解率可达４％， ４ 根据标记性脂肪 酸的变化， 在发酵第６ ， ｄ革兰氏阳 性菌、 革兰氏阴性菌、 真菌的含量都达ห้องสมุดไป่ตู้了最高值， 其中， 革兰氏阳性菌的含量较低； 真菌和
革兰氏阳性菌的生物量通过以下 ＰＦ ＬＡ的总含量估
算 ：Ｏ ｅ６ ０ ＩＭ ｌ ： ，Ｏ ｅ８ ０ ｉ ： ，１：， ＩＭ ｌ： ，Ｏ ｅ７ ０ １Ｍ ｌ： ，１ ０ ａ５０ ５
（Ｋ Ｆ１ ７购自 Ｂ Ｍ － ６） 武汉大学中国典型培养物保藏中 ７
PLFA测定方法2015
PLFA试剂及配制：3.1氯仿3.2甲醇3.3正己烷3.40.2 mol/L KOH 甲醇溶液：0.34g KOH溶于30ml甲醇；3.51M 冰醋酸：1.74ml冰醋酸溶于30 ml去离子水(现用现配)；3.61：1 = 甲醇：甲苯(现用现配)(30ml)；3.70.15M pH=4.0 柠檬酸缓冲液：准确称取20.66g柠檬酸，柠檬酸钠15.23g，加去离子水定容至1000ml。
3.8提取液-柠檬酸缓冲液:氯仿:甲醇=0.8:1:2(v/v/v)(约850ml)。
3.9硅胶柱(0.8克，100-200 目)：于120℃烘干2小时进行活化,并于干燥器中保存；3.10 Nonadecanoic acid methyl ester (19:0, Sigma)：190ug/ml;Supelcoe 37 Component FAME Mix：1000μg/ml;Supelcoe BAME (Bacterial Acid Methyl Esters) mix:1000μg/ml。
上GC前：取30μl 19:0脂肪酸甲酯+ 150μl 37Componet FAME s]定量标准。
仪器: 气相色谱一台；高纯N2；N2吹扫系统；真空干燥器；5ml衍生瓶；气谱上样瓶；150ul内插衬管；90ml带盖玻璃离心管；玻璃吸管；测定步骤：步骤1.所用有的器皿：去离子水和正己烷洗，玻璃管用锡箔纸包好，并编号；土壤样品冻干后，于干燥器中保存。
步骤2 从全土样品中提取脂肪酸第一天(6个样品+1个控制样+1个空白；每个样品三次重复)1.准确称取冻干土样5克，倒入50ml玻璃三角瓶●土壤样品重量应该准确记录●不同样品或处理编号应该一一对应，且应防止字迹被有机溶剂溶去。
2.用防毒面具：于每个样品管中加浸提液20ml;3.避光振荡2小时：小心放置以期达到最佳振荡效果。
4.25℃，2500 rmp离心10分钟。
5.尽可能于避光!：上清加入50ml具盖离心管中，于离心管外壁与盖上清楚地标记编号；6.并于土壤沉淀中再次加入浸提液12ml，充分振荡1小时；7.提取液再次离心，将上清合并；8.于合并的上清液中加入8.6ml柠檬酸缓冲液，10.6ml 氯仿；9.振荡离心管1分钟(盖子盖紧)，定时放气(vent periodically)；10.于黑暗(外加铝箔)中静置过夜，使两相分离；远离热源。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
凋落物和土壤前处理
取样：每个次小区分别取1袋米老排凋落物和1袋杉木凋落物，每个网袋单独装入一个塑料袋；同时用土钻取网袋下面0-10cm土壤装入自封袋。
共36个网袋+36个土样。
网袋和土壤放在装有冰块的冰盒带回实验室。
凋落物前处理：
1，混合：凋落物带回实验室后，用剪刀剪碎混合，分成三份，一
份-20℃冷藏做PLFA，一份4℃保鲜做凋落物酶，另一份烘干称重计算分解速率。
2，脱水：把-20℃冷藏的凋落物放入冷冻干燥机脱水（-80℃），24小时左右
3，粉碎：脱水之后的凋落物用球磨机粉碎，装入自封袋，封好袋口，-20℃冷冻。
4，运输：把凋落物和土壤样品装入放有冰块的大冰盒带到广州。
5，实验时每个样品用量为0.1g（华南植物园），其他程序与土壤PLFA 一样。
土壤前处理：带回实验室的土壤人工挑拣出石子，细根等，然后混合放在-20℃冷冻带到广州。
具体实验步骤：
1、凋落物样品用球磨机粉碎（<10 μm）
2、称取冷冻干燥后的凋落物样品（250±1 mg）于玻璃离心管中（25 ml），用磷酸钾溶液（50 mmol l-1, pH 7.4）1.6 ml 、甲醇4 ml、氯仿 2 ml；
3、涡旋30s，超声2 min，在37℃下温育30min，然后离心（800×g），将上层清液倒入50 ml分液漏斗中。
然后再重复浸提一次，合并两次上层清液。
4、向分液漏斗中再加入4 ml氯仿，4 ml水，然后轻轻的摇匀，放置整晚。
第二天
5、收集分液漏斗中的下层清液（氯仿相），在氮气下吹干。
6、通过色谱硅胶小柱进行脂质分离：用氯仿（3×2 ml）洗脱中性脂质，用丙酮（3×2 ml）洗脱糖脂，这些全部丢弃。
最后用甲醇（3×2 ml）洗脱极性脂类，收集到玻璃试管中。
在氮气下吹干。
7、在剩余残留物中，加入2ml氢氧化钾（KOH），1 ml甲苯：甲醇（1：1，v/v），然后在37℃下温育30 min。
参考文献：
Prior to analysis, frozen samples were ground with a Wiley Mill to pass through a 40-mesh screen.
(From:Temporal dynamics of microbial communities on decomposing leaf litter of 10 plant species in relation to decomposition rate: SBB) Subsamples for PLFA and enzyme assays were frozen (-20C) until analysis. (From: SARAH E. HOBBIE)
LFAs were extracted from 0.5 g freeze-dried residues(Petra Marschner; SBB)。