慢病毒使用操作指南
慢病毒使用操作指南
慢使用操作指南慢使用操作指南1.慢简介1.1 定义：慢是一种特殊的，能够在细胞中长期存活并进行复制。
1.2 用途：慢广泛应用于基因转导、基因敲除和基因表达等实验研究中。
2.慢使用前准备工作2.1 实验室准备工作2.1.1 实验室空间准备：确保实验室内有足够的操作空间和合适的消毒设备。
2.1.2 材料准备：准备好所需的培养基、细胞培养物、慢载体等。
2.1.3 设备准备：确保离心机、冰箱等设备正常工作，并准备好相关的仪器和器材。
2.2 人员准备工作2.2.1 人员培训：对参与慢操作的人员进行培训，了解操作步骤和安全风险。
2.2.2 个人防护：提供必要的防护装备，如实验服、手套、面罩等。
3.慢操作步骤3.1 细胞培养3.1.1 细胞培养物准备：根据实验需求选择合适的细胞培养物，并进行细胞的预处理和培养。
3.1.2 细胞密度调整：根据实验要求，调整细胞培养物的密度，以保证细胞的正常生长。
3.2 慢感染3.2.1 慢载体注射：将慢载体注射到培养好的细胞中。
3.2.2 感染条件控制：根据实验需求，控制慢感染的时间、浓度和温度等条件。
3.3 细胞培养和检测3.3.1 细胞培养：将感染好的细胞进行培养，并观察细胞的生长状态。
3.3.2 细胞检测：使用相关实验方法，对感染细胞进行检测和分析。
4.实验安全措施4.1 操作环境控制：确保实验室内通风良好，避免慢的扩散和污染。
4.2 废液处理：将产生的废液经过正确处理，避免对环境和人体造成污染和伤害。
4.3 事故应急处理：在发生事故或意外情况时，立即采取应急措施，并及时报告相关人员。
5.附件本文档所涉及的附件，包括但不限于实验记录表格、实验数据文件等。
6.法律名词及注释6.1 慢：指一种具有长周期和潜伏期的。
7.结束语感谢您阅读本文档，如有任何疑问或意见，请随时与我们联系。
慢病毒使用手册
慢病毒使用手册慢病毒（Lentivirus）是一类非常常见的病毒，它属于逆转录病毒家族。
与其他病毒相比，慢病毒具有一些特殊的特征，使其在生物研究领域和基因治疗等应用中变得非常重要。
本文将介绍慢病毒的基本特征、制备和使用方法，以及慢病毒在基因转染、基因表达和基因治疗中的应用。
一、慢病毒的基本特征慢病毒是一类具有外包膜的病毒，其基因组由一条单链正义RNA组成。
慢病毒具有较大的基因载量能力，可携带长达9kb的外源DNA序列。
另外，慢病毒具有高度的细胞性选择性，能够感染多种哺乳动物细胞，并将外源基因稳定地集成到细胞基因组中。
二、慢病毒的制备方法慢病毒的制备包括构建慢病毒载体和包装慢病毒。
构建慢病毒载体通常采用三元质粒系统，其中包括基因载体、包装载体和包衣载体。
基因载体负责携带外源基因序列，而包装载体负责表达与慢病毒复制有关的基因，如gag、pol和env等。
包衣载体则负责表达包衣蛋白，使慢病毒能够正常装配和释放。
包装慢病毒的方法通常采用转染细胞的方式。
将构建好的慢病毒载体与包装载体和包衣载体一同转染到特定的细胞中，通过包装载体表达的基因来启动慢病毒的复制和包装过程。
经过适当的培养和处理后，可以获得高效包装的慢病毒颗粒。
三、慢病毒的使用方法慢病毒主要通过基因转染、基因表达和基因治疗等方式应用于生物研究和医学领域。
1. 基因转染：慢病毒可以用于将外源基因导入到细胞中，实现基因转染。
通过选择性的感染特定细胞或细胞系，可以研究和探索特定基因的功能和调控机制。
2. 基因表达：慢病毒可以被用作基因表达工具。
外源基因在细胞内被稳定地整合到基因组中，从而实现长期稳定的基因表达。
慢病毒可以用于产生稳定的细胞株，并通过基因敲入或敲除等方法研究基因功能。
3. 基因治疗：慢病毒在基因治疗中的应用非常广泛。
通过将修正后的基因导入到患者体内的细胞中，可以实现对某些慢病毒引起的遗传疾病的基因治疗。
此外，慢病毒载体还可以用于制备疫苗和用于癌症免疫治疗等领域。
慢病毒使用手册
培养基（DMEM+10% FBS，高糖）； C. 取待测定的病毒原液 11 µl 加入到第一个管中，混匀后，取 11 µl 加入到第
二个管中。继续相同的操作直到最后一管；
Shanghai GeneChem Co.,Ltd
Floor 2, NO.328,Aidisheng Rd . Pudong,Shanghai,201203 P.R.C. TE:(86)21 51320189 FAX:(86)21 51370635
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Lentiviral Vector Particle 使用操作手册
Lentiviral Vector Particle 使用操作手册
上海吉凯基因化学技术有限公司
二○一一年七月
Partner in gene function and drug target validation
Lentiviral Vector Particle 使用操作手册
手册内容
一．Lentivirus 的储存与稀释 二．Lentivirus 使用安全注意事项 三．Lentivirus 在体外培养原代细胞和细胞系水平的使用 四．常见问题 五．细胞 MOI 值列表
义为感染时病毒和细胞数量的比值。在我们实验中将某个细胞达到 80%感 染时所需的 MOI 值定义为这个细胞的 MOI 值。 Polybrene：是常用的感染添加剂，使用浓度为 5-10 µg/ml，polybrene 能显著
提高病毒对细胞的接触并提高病毒的感染效率，在一般细胞上有 3-4 倍的作用，对有些细胞可以提高 10-20 倍；吉凯基因提供的 Polybrene 储液浓度为 10 mg/ml，如有需要，使用过程中也可以 用 D-hanks，PBS 或培养基进行稀释。 ENi.S.：Enhanced Infection Solution(ENi.S.)是吉凯开发的感染增强溶液，使用 时需将培养基弃去，替换为 ENi.S.，然后加入病毒，也可以同时加入 polybrene。ENi.S.亦可以显著提高病毒对细胞的感染能力。
关于慢病毒感染的相关知识总结讲解
慢病毒使用操作手册一、慢病毒的储存与稀释:1. 病毒的储存：收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）①病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前需要重新滴定病毒滴度②反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。
2. 病毒的稀释：如果需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。
混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。
二、慢病毒用于体外（In Vitro）实验：感染培养原代细胞和建系细胞。
慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。
如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）。
慢病毒感染目的细胞预实验1. 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项：①测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。
②在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。
③一般慢病毒单位为TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。
如：病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。
2. 以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。
慢病毒使用操作指南
慢病毒使用操作指南慢病毒是一种常用的实验工具，广泛应用于细胞和分子生物学研究。
本文档旨在提供慢病毒使用的操作指南，帮助研究人员更好地利用慢病毒进行实验研究。
第一部分：慢病毒基本知识1. 什么是慢病毒？慢病毒是一种具有RNA基因组的病毒，属于反转录病毒。
它能够将自身的RNA基因组逆转录成DNA，再与宿主细胞的基因组融合，长期稳定地存在于宿主细胞中。
2. 利用慢病毒进行基因转染的优势相比其他常用的基因转染方法，慢病毒具有以下优势：- 高效性：慢病毒能够高效地转染多种类型的细胞，包括非分裂细胞。
- 长期稳定性：慢病毒转染的基因能够长期稳定地存在于宿主细胞中。
- 遗传稳定性：慢病毒转染的基因可以遗传给后代细胞，因此适用于长期实验研究。
第二部分：慢病毒使用的关键步骤1. 选择合适的慢病毒载体慢病毒载体是慢病毒的基础构建单元，其中包含转录启动子、报告基因等必要的元件。
根据实验需要选择合适的载体。
2. 包装慢病毒慢病毒的包装是将慢病毒载体与包装载体共转染至特定细胞株，通过包装载体中的包装酶，将慢病毒的RNA基因组逆转录成DNA，形成可复制的慢病毒。
3. 提取慢病毒经包装后的细胞培养基中含有包装好的慢病毒。
可通过超速离心等方法，将细胞培养物离心，提取慢病毒。
4. 病毒滴定病毒滴定是用来确定病毒滴度的重要步骤。
通过适当稀释提取的慢病毒，将其感染指定细胞株，计算出感染单位的浓度。
5. 慢病毒感染及筛选将提取的慢病毒添加至目标细胞中，通过细胞培养和筛选，筛选出具有所需基因的细胞株。
第三部分：慢病毒使用的注意事项1. 安全操作慢病毒具有一定的传染性，进行实验时需要遵守生物安全操作规范，佩戴一次性手套、口罩等个人防护装备，避免直接接触慢病毒。
2. 避免交叉感染实验室中使用慢病毒时，应尽可能避免交叉感染。
定期对实验室环境进行消毒，使用一次性材料，避免共享器械等措施可以减少交叉感染的风险。
3. 合理控制病毒滴度对于不同类型的细胞，需要确定合适的病毒滴度，以避免过度感染或感染不足的情况。
慢病毒转染手册
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
基本概述慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
慢病毒的应用目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。
当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。
U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。
在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。
Fitgene慢病毒使用说明
Fitgene慢病毒使用说明慢病毒使用说明1. 慢病毒的操作安全性说明1.1 慢病毒的安全性辉骏生物提供的慢病毒载体已经经过了一系列的遗传改造，能够最大限度的保证实验的安全性。
（1）编码HIV-1的毒性基因已经被全部删除，并替换入了外源的目的基因片段，慢病毒感染宿主细胞时，只会介导目的基因的表达，因此包装出的慢病毒为属于假型病毒，无致病性；（2）慢病毒颗粒在感染宿主细胞后并不能进行自我复制，不能再次感染其它类型的细胞，其危险性被大大降低了；（3）慢病毒包装必需的3种蛋白质的基因分别位于3个辅助载体上，并且与慢病毒表达载体相互独立，只有当四质粒共转染包装细胞时才可以包装产生慢病毒，最大限度地降低了慢病毒的重组概率；（4）VSV-G是水泡口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus)的G糖蛋白，它替代了HIV-1原始的包膜蛋白，进一步降低了病毒恢复成野生型的概率；（5）慢病毒感染宿主细胞时会整合入宿主细胞的基因组内，并且这种整合更偏向于基因表达活跃区，另外慢病毒LTR的转录激活能力也相对较低，因此激活沉默区原癌基因的概率和能力也比一般的逆转录病毒低；（6）迄今为止尚未出现慢病毒四质粒包装系统的任何重组报道，也未见感染HIV-1后的致瘤事件。
1.2 慢病毒操作规范尽管对慢病毒载体的一系列改造已经最大限度地保证了其使用的安全，但是慢病毒的使用仍然具有潜在的危险，因此操作时需要严格遵守安全规范。
具体要求如下：（1）所有操作均应在生物安全柜中进行，如果实验室只配备了超净工作台，则不能开启排风系统；（2）慢病毒操作者应穿着实验服，并佩戴一次性手套、口罩，谨防病毒接触眼、耳、口、鼻和伤口等；（3）严格操作，避免产生病毒气雾或喷溅，如操作台等不小心被病毒污染，应立即用1%的SDS溶液擦拭干净；（4）严格注意被病毒污染过的尖锐物品，防止不小心被病毒污染物划伤；（5）最好使用细胞培养瓶培养含病毒的细胞，当用到细胞培养板时，应注意避免病毒洒落；（6）利用显微镜观察细胞感染时，应将含有病毒的细胞培养板或细胞培养皿封紧，并用70%乙醇擦拭外壁；（7）显微镜台、生物安全柜台面等使用后，需用70%乙醇擦拭；（8）实验后，所有接触过病毒的实验用品应立即用巴氏消毒液浸泡：培养基和枪头等浸泡一天后丢弃；可回收的器皿浸泡巴氏消毒液一小时后用自来水冲洗干净，再进行常规灭菌处理；（9）操作人员在完成实验后，应立即清洗双手。
ips操作指南第五版-慢病毒版本
IPS操作指南第四版IPS简介：iPS细胞是通过基因转染技术（gene transfection）将某些转录因子导入动物或入的体细胞使，体细胞直接重构成为胚胎干细胞（embryonic stemcell,ESC）细胞样的多潜能细胞。
现在大多是通过病毒携带特定的转录因子进入体细胞内，来获得多能性干细胞。
2006年日本京都大学Shinya Yamanaka在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究。
他们把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。
现分别介绍一下小鼠的和人的iPS的诱导步骤。
一、实验材料慢病毒包装体系：慢病毒表达质粒plvx-OCT4、plvx-SOX2、plvx-KLF4和plvx-c-MYC；辅助质粒PSPAX2和PMD2；病毒包装细胞：293T细胞；ES Feeder细胞：MEF（C57）。
二、实验仪器和耗材（一）实验仪器二级安全柜、37度培养箱、4度冰箱、液氮储存器、倒置显微镜、低温离心机。
（二）实验耗材PBS、无菌水、明胶粉、DMEM培养基、FBS、非必须氨基酸、β-巯基乙醇、胰酶、血清替代物（SR）、mTESR1、T75培养瓶、无菌水、15ml离心管、50ml离心管，巴氏管等。
三、ips诱导方法（一）Feeder细胞1、Feeder细胞的分离（MEF）取妊娠13.5-14.5d的孕鼠，在无菌情况下取出胎鼠，去除鼠头，尾，四肢及内脏，然后用PBS进行冲洗。
将胎体剪碎成小于1mm2的组织块，1000rpm，3min，去掉上层PBS，加入0.25%胰酶-0.04%EDTA2~3ml浸泡组织块，常温消化2~3min。
轻微吹打，待较多细胞溢出后，加入等量的10%FBS DMEM终止消化，通过100目滤网过滤后，将获得的液体离心，1000rpm，5min。
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慢病毒使用操作指南
一、慢病毒的储存与稀释：
1. 病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 C保存；如需长期保存请放置于-80C（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）注：A.病毒可以存放于-80°C 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月, 我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度。
B.反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量进行分装。
2. 病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基（含血清或含双抗不影响病毒感染）混匀分装后4C保存（请尽量在三天内用完），分装后使用。
、慢病毒用于体外（in vitro ）实验：感染培养原代细胞和建系细胞
1. 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用Invabio 提供的慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数
（MOI 值）以及在体内（in vivo ）注射所需要的病毒量。
如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）
2. 慢病毒感染目的细胞预实验
① 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项
A. 测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的
（HEK293T，Hela）细胞作为平行实验的对照细胞。
B.在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清、双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。
C. Invabio提供的病毒单位为TU/ml,即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。
如：病毒滴度为＞1X108 TU/ml即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。
② 以24 孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验
实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液
第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3~5X104个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养基体积为100卩l ;进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。
第二天，观察细胞生长状态，如细胞状态较好则开始实验：
1、取出4C保存的病毒，使用台式离心机离心20秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80°C的病毒需要先在冰上融化后使用。
亦可以根据实验室的实际情况将按照MOI 准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积，以期获得最佳的感染效率。
2、病毒准备好之后，从培养箱中拿出细胞，
a 使用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基
b 吸去原细胞培养器皿中的培养基（如果细胞生长良好，密度适宜，则不用换液）
c 在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液
d 混匀后放于二氧化碳培养箱（37C、5%CO）2 孵育过夜
注：感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大，所以务必保证加病毒之前，细胞处于良好的生长状态。
如果慢病毒对目的细胞的感染效率偏低，则可以通过提高MOI 值来增加其感染效率，但是当MOI 高于20 时，我们建议客户在培养基中加入ploybrene
（8卩g/ml左右）来提高病毒的感染效率。
第三天，更换培养液：一般在24 小时候后将含有慢病毒的培养液更换成正常培养液；在感染后观察细胞状态，如果慢病毒对细胞有明显毒性作用而影响细胞生长状态，可以最短在加病毒4小时候更换新鲜培养液后继续培养（建议在8-12 小时更换为宜）。
第一次换液后，如果慢病毒对细胞没有明显毒性作用，按照正常培养条件培养换液。
第六天，感染效率检测：在倒置荧光显微镜观察荧光，估计慢病毒感染目的细胞
的效率；如何由于目的基因较大而造成选择的载体不能携带Marker Ge ne的，可以通Real-time RT-PCR佥测目的基因的表达来拍评估感染效率。
三、慢病毒使用注意事项
1. 病毒操作时最好使用生物安全柜。
如果使用普通超净工作台操作病毒，请不要打开排风机。
2. 病毒操作时请穿实验服，带口罩和手套。
3. 操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS 溶液擦拭干净。
接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于84 消毒液或1%SDS 中浸泡过夜后弃去。
4. 用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤：拧紧培养瓶或盖紧培养板。
用70%乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照。
离开显微镜实验台之前，用70%乙醇清理显微镜实验台。
5. 如需要离心，应使用密封性好的离心管，或者用封口膜封口后离心，而且尽量使用组织培养室内的离心机。
6. 脱掉手套后，用肥皂和水清洗双手。
四、悬浮细胞感染简单步骤
1. 根据细胞的量将细胞在1.5ml 管中离心收集然后用100-200ul 的无血清培养液稀释细胞沉淀，以细胞完全浸没在培养基中为准
2. 按照MOI 换算病毒颗粒数量，吸取病毒液加入细胞中，将1.5ml 管放在37C度培养箱中孵育30分钟
3. 将管中混合溶液吸出加到培养皿中或孔里
4. 加入足够量的新鲜培养液
5. 12 小时后换液
6. 96 小时后观察细胞阳性率。