吸光光度法
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吸光光度法
光电管 光电倍增管 光二极管阵列
光电管分为红敏和紫敏，阴极表面涂银和氧 化铯为红敏，适用625－1000nm波长；阴极 表面涂锑和铯为紫敏，适用200－625nm波长
目视比色法—比色管
光电比色法—光电比色计
光源、滤光片、比色池、硒光电池、检流计
分光光度法与分光光度计
722型分光光度计光学系统图
1.光源；2.滤光片；3,8聚光镜 4,7.狭缝；5.准直镜；6.光栅 9.比色池；10.光电管
e 表示物质的浓度为1mol/L,液层厚度为1cm时溶液
的吸光度。单位： (L•mol-1 •cm-1)
桑德尔(Sandell)灵敏度： S 当仪器检测吸光度为0.001时，单位截面积光
程内所能检测到的吸光物质的最低含量。 单位：mg/cm2
S=M/e
氯磺酚S测定钢中的铌 50ml容量瓶中有Nb30μg，用2cm比色池，在650nm
AHB和AB-分别为有机弱酸HB在强酸和强碱性时的吸光度，它 们此时分别全部以[HB]或[B-]形式存在。
pKa=pH+ lg
AB- - A A- AHB
lg AB- - A A- AHB
对pH作图即可求得pKa
2 络合物组成确定 饱和法（摩尔比法） 制备一系列含钌3.0×10-5 mol/L (固定不变)和不 同浓度（小于12.0×10-5 mol/L）的PDT溶液，按 实验条件，485nm测定吸光度,作图。
c 显色反应时间 针对不同显色反应确定显示时间 显色反应快且稳定；显色反应快但不稳定； 显色反应慢，稳定需时间；显色反应慢但不稳定
d 显色反应温度 加热可加快反应速度，导致显色剂或产物分解
e 溶剂
有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率
光电管分为红敏和紫敏，阴极表面涂银和氧 化铯为红敏，适用625－1000nm波长；阴极 表面涂锑和铯为紫敏，适用200－625nm波长
目视比色法—比色管
光电比色法—光电比色计
光源、滤光片、比色池、硒光电池、检流计
分光光度法与分光光度计
722型分光光度计光学系统图
1.光源；2.滤光片；3,8聚光镜 4,7.狭缝；5.准直镜；6.光栅 9.比色池；10.光电管
e 表示物质的浓度为1mol/L,液层厚度为1cm时溶液
的吸光度。单位： (L•mol-1 •cm-1)
桑德尔(Sandell)灵敏度： S 当仪器检测吸光度为0.001时，单位截面积光
程内所能检测到的吸光物质的最低含量。 单位：mg/cm2
S=M/e
氯磺酚S测定钢中的铌 50ml容量瓶中有Nb30μg，用2cm比色池，在650nm
AHB和AB-分别为有机弱酸HB在强酸和强碱性时的吸光度，它 们此时分别全部以[HB]或[B-]形式存在。
pKa=pH+ lg
AB- - A A- AHB
lg AB- - A A- AHB
对pH作图即可求得pKa
2 络合物组成确定 饱和法（摩尔比法） 制备一系列含钌3.0×10-5 mol/L (固定不变)和不 同浓度（小于12.0×10-5 mol/L）的PDT溶液，按 实验条件，485nm测定吸光度,作图。
c 显色反应时间 针对不同显色反应确定显示时间 显色反应快且稳定；显色反应快但不稳定； 显色反应慢，稳定需时间；显色反应慢但不稳定
d 显色反应温度 加热可加快反应速度，导致显色剂或产物分解
e 溶剂
有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率
吸光光度法
ε
S与
ε 关系式的推导： ε b c 可得 εbc
根据 S 的定义和 A = A = 0.001 =
因为 所以
A = 0.001 =
εbc
（1）
0.001 c= εb
将单位代入(1)式右端
0.001 mol ⋅ cm 0.001 mol c= ⋅ = ⋅ b cm εL εb L
即
0.001 mol c= ⋅ εb L
3、多元络合物(MRARB)的种类 a.三元混配络合物: 如V(v)—H2O2—PAR b.离子缔合物: [Ag(phen)2]+· [BPR]c.金属离子—络合剂—表面活性剂体系 如稀土元素—XO—CPB体系
d.杂多酸: 杂多酸 磷酸盐 + 钼酸盐 阴离子 或硅酸盐 （过量） 或砷酸盐 (如[PMo12O40]3-
6.2.3 测量波长和吸光度范围的选择 1、测量波长的选择 “最大吸收原则” 或“吸收最大， 干扰最小”原则。
2、吸光度范围的选择
一般控制标准溶液和被测试液的吸 光度在 0.2 ~ 0.8 范围内，才能保证 测量的相对误差较小。 原因 浓度测量的相对误差 Er 与透射 比 T（或吸光度）有关。
_________________
6.2.4 参比溶液的选择 1、参比溶液：光度测量时用来调节仪 器的零点的一种溶液。 2、参比溶液的用途 消除由于吸收池壁及溶剂对入射光 的反射和吸收带来的误差，并扣除 干扰的影响。如参比溶液选择不 当， 会使标准曲线不通过原点。
以 M + n R(过量，乙色) = MRn(甲色) 为例，说明参比溶液的重要性。 ——— A(甲)+A(乙) MRn + —— A(乙) R R (1)零点——————————— 水 —— A(甲) MRn + (2)零点______________ 调A(乙)=0 R R
吸光光度法
第20 章吸光光度法吸光光度法(light absorption method)是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。
包括比色法（colorimetric method）和分光光度法（spectrophotometry）。
前者是通过比较有色溶液颜色深浅来确定有色物质的含量；后者是根据物质对一定波长光的吸收程度来确定物质的含量的。
分光光度法包括紫外分光光度法（ultraviolet spectrophotometry）、可见光分光光度法（visible spectrophotometry）、红外分光光度法（infrared spectrophotometry）。
本章主要讨论可见光分光光度法。
20.1 概述20.1.1 物质对光的选择性吸收1. 光的性质光是一种电磁波，具有波粒二象性。
光的偏振、干涉、衍射、折射等现象就是其波动性的反映，波长λ与频率ν之间的关系式：λν=c （c为光速）亦反映光的波动性。
光又是由大量具有能量的粒子流所组成，这些粒子称为光子。
光子的能量则反映微粒性，光子的能量E 与波长λ的关系：E = hν = hc/λ（h为普朗克常量）亦可用来表示光的微粒性。
由上述关系可知，光子的能量与光的波长（或频率）有关，波长越短，光能越大，反之亦然。
光的能量范围很广，在波长或频率上相差大约20个数量级。
不同光的波长范围及其在分析化学中的应用情况见表20-1。
表20-1 各种光的波长范围及其在分析化学中的应用情况光的名称波长范围跃迁类型分析方法X-射线远紫外光近紫外光可见光近红外光中红外光远红外光微波无线电波10-1~ 10nm10 ~ 200nm200 ~ 400nm400 ~ 750nm0.75 ~ 2.5μm2.5 ~ 50μm50 ~ 1000μm0.1 ~ 100cm1 ~ 1000mK和L层电子中层电子价电子价电子分子振动分子振动分子振动和低位振动分子转动X射线光谱法真空紫外光度法紫外光度法比色及可见光度法近红外光谱法中红外光谱法远红外光谱法微波光谱法核自旋共振光谱2. 物质的颜色与其对光的选择性吸收光可分为单色光与复合光，单色光（chromatic light）是仅具有单一波长的光，而复合光（polychromatic light）是由不同波长的光（不同能量的光子）所组成。
第九章 吸光光度法
发生相互作用。 假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)时才基本符合。 当溶液浓度c >10 －2 mol/L 时，吸光质点间可能发 生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。 故：朗伯—比耳定律只适用于稀溶液。 溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的 形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化 ，影响吸光度。
度的乘积成正比。 朗伯——比耳定律不仅适用于有色溶液，也适 用于其它均匀、非散射的吸光物质(包括液体、气 体和固体)，是各类吸光光度法的定量依据。
A bc
式中，A：吸光度，描述溶液对光的吸收程度； b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位； c：溶液的摩尔浓度，单位mol· －１； L
无线电波 11000m
光谱名称 波长范围 X射线 0.1—10nm 远紫外光 10—200nm
跃迁类型
辐射源
分ห้องสมุดไป่ตู้方法 X射线光谱法
真空紫外光 度法
K和L层电子 X射线管 中层电子 氢灯 氢灯 钨灯
碳化硅热棒
近紫外光 200—400nm 价电子 可见光 400—750nm 价电子
近红外光 0.75—2.5μ m 分子振动 中红外光 2.5— 分子振动 5.0μ m
A总 lg(I01 I02 ) /(I01 10
1bc
I02 10
2bc
)
讨论: A总 lg(I0 I0 ) /(I0 10
1 2 1
1bc
I02 10
2bc
)
(1) 1= 2 = 则： A总 ＝lg（Ｉo/Ｉt）＝ bc
(2) 若 2≠ 1 ；A与C则不成直线关系。 2与 1
I0 A lg I t A Kbc
吸光光度法
显示装置
6.2
光度分析法的设计
1 显色反应（color reaction）
待测物质本身有较深的颜色，直接测 定；待测物质是无色或很浅的颜色，需 要选适当的试剂与被测离子反应生成有 色化合物再进行测定，此反应称为显色 反应，所用的试剂称为显色剂（color reagent）。
6.2
光度分析法的设计
苯 (254nm) A 甲苯 (262nm)
230
250
270
苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱
6.1 概述
在可见光，KMnO4溶液 对波长525 nm附近绿色光 的吸收最强，而对紫色和 红色的吸收很弱。λmax= 525 nm。浓度不同时， 光吸收曲线形状相同， λmax不变，吸光度不同。
光吸收程度最大处的波 长，称为最大吸收波长， 常用λ最大或λmax表示， 任何可见光区内、溶液 的颜色主要是由这个数值决定的。
6.1 概述
溶液中溶质分子对光的吸收与吸收光谱
不同颜色的可见光波长及其互补光
/nm
吸收光
颜色
400-450 450-480
480-490 490-500 500-560 560-580 580-610 610-650 650-760
紫 蓝
绿蓝 蓝绿 绿 黄绿 黄 橙 红
黄绿 黄
橙 红 红紫 紫 蓝 绿蓝 蓝绿
6.1 概述
其实，任何一种溶液．对不同波长的光的吸收
程度是不相等的。如果将某种波长的单色光依 次通过一定浓度的某一溶液，测量该溶液对各 种单色光的吸收程度，以波长为纵坐标，以吸 光度为纵坐标可以得到一条曲线，叫做吸收光 谱曲线或光吸收曲线。它清楚地描述了溶液对 不同波长的光的吸收情况。
项目五——吸光光度法
03
吸光光度法的仪器和试剂
分光光度计
01
定义
分光光度计是分光光度法中使用的核心仪器，用于测量溶液对特定波长
的光的吸光度。
02 03
工作原理
分光光度计通过光源发出连续光谱的光，经过单色器分光后，得到特定 波长的单色光，照射到样品上，然后通过检测器检测透过样品的光强， 从而计算出样品的吸光度。
类型
常见的分光光度计有紫外-可见分光光度计、红外分光光度计等。
酶活性测定
某些酶催化的反应会产生或消耗具有 特定吸光特性的物质，利用吸光光度 法可以测定这些物质的浓度变化，从 而推算出酶的活性。
工业生产中的吸光光度法
产品质量控制
在某些工业生产过程中，产品的吸光特性与其质量密切相关。通过吸光光度法测 量产品的吸光度，可以实时监控产品质量，确保生产过程的稳定性和产品的一致 性。
通过合成具有更高选择性和灵敏度的试剂和探针，提高吸光光度法 对目标分析物的检测灵敏度。
引入多元校正技术
利用多元校正算法，消除干扰因素，提高吸光光度法在复杂样品中 的测量精度和灵敏度。
拓展应用领域和范围
环境监测领域
将吸光光度法应用于大气、水体 等环境样品的检测，实现对环境
污染物的快速、准确测定。
生物医学领域
引入人工智能、物联网等技术， 实现吸光光度法仪器的远程操控 、数据自动处理和分析等功能， 提高仪器的易用性和分析效率。
多功能集成
将多种分析方法集成到一台仪器 中，实现一台仪器同时具备多种 分析功能，提高仪器的综合性能
和应用范围。
谢谢您的聆听
THANKS
常见试剂
常见的吸光光度法试剂有显色剂、还原剂、氧化剂等。
使用注意事项
吸光光度法
(1)棱镜的色散
棱镜有玻璃和石英两种材料．它们的色散原理是依 据不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率而将不 同波长的光分开． 由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱镜只能用于 350 ~ 3200 nm的波长范围，即只能用于可见光域 内．石英棱镜可使用的波长范围较宽，可从185 ~ 4000nm，即可用于紫外、可见和近红外三 个光 域．
目视比色法特点： 目视比色法的主要缺点是准确度不高，如 果待测液中存在第二种有色物质，甚至会 无法进行测定。 由于许多有色溶液颜色不稳定，标准系列 不能久存，经常需在测定时配制，比较麻 烦。 但设备简单，操作简便，比色管内液层厚 使观察颜色的灵敏度较高，且不要求有色 溶液严格服从比耳定律，因而它广泛应用 于准确度要求不高的常规分析中。
（2）光栅的色散
光栅是利用光的衍射与干涉作用制成的，它可用 于紫外、可见及红外光域，而且在整个波长区具有 良好的、几乎均匀一致的分辨能力．它具有色散波
1. 光色的互补关系
单色光； 复合光； 人眼能感觉到的光称为可见光（其波长范围大约 在400~750nm之间）。 日光、白炽灯光等可见光都是复合光。
如果把两种适当颜色的单色光按一定强度比例混 合后，就能得到白光。我们便称这两种单色光为 互补色光。
2. 物质对光的选择吸收
7.5目视比色与分光光度计
定义：用眼睛观察，比较待测 物质溶液颜色深浅以测定其含 量的方法 标准系列 应用： 准确度要求不高的中间 控制 限界分析：要求确定样品 中待测组分含量是否在规定的 最高含量限界以下 特点： 未知样品 1. 优点：仪器简单、操作方 便、适于大批样品的分析 2.缺点： 主观性大、准确度差
当一束白光（强度为I0 ）通过下列几种溶液，溶 液呈现的颜色和吸收光的关系如下图：
第七章 吸光光度法
三、吸光度范围的选择 研究表明，当T=0.368，即A=0.434，测量 的相对误差为最小。当T=15%-65%时，即 A=0.2-0.8时测量的相对误差≤±2%，能满 足分析测定的要求，故吸光度在0.2-0.8为 测量的适宜范围。
2、化学因素： ①、Beer定律要求在稀溶液的情况下才适用，当待测液浓度过
高（M>10-2mol.l-1）时，则会引起误差。
②溶液的吸光物质常因解离、综合或互变影响或产生副反应而 改变其浓度，导致偏离。 3、其它因素：如待测试样是胶体溶液，新溶液或有悬浮物质时， 使得吸光物质不均匀，当λ射光透过溶液时，除了部分被吸收
第七章 吸光光度法
内容提要 概述（理解） 吸光光度法的基本原理（掌握） 显色反应及显色条件的选择（了解） 测量条件的选择（掌握） 目视比色与分光光度计（了解） 吸光光度法的应用（掌握）
§7-1 概 述
前面所学滴定分析和质量分析都属于化学分析法，适用于含
量高于1%常量组分的测定，测定结果的相对误差可控制
物质吸光能力大小的量度，它表示浓度为1mol.l-1的溶液，在1cm的比
色皿中，在一定温度和一定波长下的吸光度。
在吸光光度法中，有时也用透射比T来表示物质吸收 I 光的能力： T
I0
因此引出A与T之间存在以下关系： A lg I 0
I
lg
1 T
lg T
即：
A lg
1 T
KbC
综合考虑液层厚度与浓度对光吸收的影响，即得到朗伯-比尔的 数学表达式：
A lg
I0 I
KbC
它的物理意义是：当一束单色光平行照射到均匀，非散射性的吸光物质的
溶液时，溶液的吸光度A与溶液浓度C和液层厚度b的乘积成正比。
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'
c(1 ) (1 ) K 2 2 c c 2
A1
x A 1
x
y A1
y A 2
x y bc bcy 1 x 1
A 2 A 2
bcx bcy
x 2 y 2
κ为物质的特征参数，
可通过配制标准溶液测得。
解联立方程，可求得Cx，Cy
例：以分光光度法测定某合金钢中的锰和铬。称取 1.000g钢样，溶解后稀释至50.00mL。将其中的Cr氧化 成Cr2O72-，Mn氧化成MnO4-。然后在440nm和545nm 用1.0cm吸收池测量吸光度列于下表。求此合金钢中锰 和铬的质量分数。(MMn=54.94，MCr=52.00) A 440nm 545nm 0.204 0.860 КMn 95.0 2.35×103 КCr 369.0 11.0
二、物理化学常数的测定
1、弱酸弱碱解离常数的测定
2、络合物组成及稳定常数的测定
1.弱酸弱碱离解常数的测定
A HB B
HB
HB
H＋＋B
B HB B
Ka＝[H+][B]/[HB]
配制三种pH不同, c相同的溶液,测A(b=1). 1、 pH1≈pKa
A AHB AB HB [HB ] B [B ]
没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量生成有 色化合物再测定－－ 显色反应
【类型】 氧化还原和络合反应 （M + nR = MRn ） 影响显色反应的因素
酸度的影响 显色剂的用量 温度的选择 时间的选择 有机溶剂和表面活性剂 共存离子的干扰
§11.4 吸光度的测量及误差控制
一、测量波长和参比溶液的选择
2.络合物的组成及稳定常数的测定 摩尔比法测络合比
M + nR = MRn
CM固定； CMRn CR从 0 开始增大 A
CR
n
CR/CM
适用于解离度较小、络合比高的络合物组 成的测定
等摩尔连续变化法测络合比
M + nR = MRn CM+ CR = 常数 CM / C 从 0 →1
在特定波长测定：R不吸收 A CM / C =0.5 ，n = 1 CM / C =0.33 ，n = 2 0
20
0.7
60
0.2
80
0.1
T% A
吸光光度法的测量误差
当dT = 1%时，为了使测量误差 < 5%，控制溶液的 透光率 T = 15 ~ 70 % T = 15 ~ 70 % A = 0.15 ~ 0.80
10
dc/c 8 (%)
6 4 2 0 0 20
dT=2% dT=1%
dT=0.1%
40 60 80 100
d cx cx
dT Tx ln Tx
示差法
Ac bc x lg Tr
Ix Tr Is
∴ Tr > Tx
有
∵ I 0 > Is
d c x cx
dcx cx
结论：示差法提高了准确度
示差法提高准确度的实质
常规法（以水作参比）：溶液s和溶液x的T为0.05和0.10。 T
0 5 10 50 100
单色器
吸收池
检测器
显示
未考虑吸收池和溶剂对光子的作用
样品
It
注意 比较
入射光 I0
透射光 It
分光光度计的构成
光源 单色器
氢灯，氘灯，185 ~ 350 nm； 卤钨灯，250 ~ 2000 nm.
基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定 作用：将复合光色散成单色光 棱镜 玻璃， 350 ~ 2500 nm, 石英，185 ~ 4500 nm 光栅 平面透射光栅， 反射光栅
③ 选择适当的参比溶液
作用： 消除由于比色皿壁或试剂对入射光的反射或 吸收而带来的误差。
§11.5 吸光光度分析方法
一、经典光度分析方法
1、校准曲线法
单组分的测定
纯物质或共存物质不干扰 A
Lambert-Beer定律
A Kbc
Cx C
一、经典光度分析方法 2、示差光度法
常规法
示差法 A A′ 单组分的测定
吸光物质对光的吸收具有加和性
A A1 A2 An
§11.2 吸光光度法的仪器
目视比色法—比色管
光电比色法—光电比色计 分光光度法与分光光度计
可见光分光光度计
紫外分光光度计 红外分光光度计
目视比色法
观察方向 特点 利用自然光 比较吸收光的互补色光 准确度低（半定量） 不可分辨多组分 标准系列
T(%)
测量条件的选择
① 测量波长的选择： “最大吸收，最小干扰” 即无干扰，选λmax作为入射光波长；有干扰，选灵 敏度较低但能避免干扰的入射光波长。 ② 吸光度范围的选择 ： A = 0.15 ~ 0.80
A = kbc ，k定，只有通过改变b或c来改变A：对已显 色的待测液，可改变b；未显色的，可改变c。
dT-透光率读数误差
dT dT dc2 c dc3
dT dc Er c T lnT
三、吸光光度法的测量误差
Er 10 8 6 T = 0.368 = 36.8 % A = 0.434 误差最小 2 0 4 (36.8) 40 0.4 0.434
c 0.434T Er c T lg T ( T 0.01)
二、双波长分光光度法
存在问题： 1、共存组分与被测组分的吸收谱带重叠 2、溶剂、胶体、悬浮体等散射或吸收辐射 引起的背景干扰 解决方法：双波长分光光度法
双波长分光光度法
原理：双波长分光光度法只用一个试样池。检测器显示的是 试液对两束波长光的吸光度差值△A。
单色器
光 源
1
检测器
单色器
2
切 光 器
I 参比 I0 A lg lg I I 试液
一、测量波长和参比溶液的选择
2、参比液的选择
以显色反应为例进行讨论 M + R 若欲测 M-R 的吸收 max
待测物质的试液 显色剂 溶剂 吸光物质
= M-R max
参比液组成
无吸收 基质吸收 无吸收 基质吸收
无吸收 无吸收 吸收 吸收
光 学 透 明
Y 的存在不干扰 X 的测定
波长组合的选择
1、等吸收点选择参比波长和测量波长。
等吸收点：干扰组分在所选的两波长处具有相同的吸光度
2、选择参比波长和测量波长应使被测组分在这两波 长处具有较大的吸光度差。
§11.6 吸光光度法的应用
一、定量分析
无机离子分析 金属离子的测定— 邻二氮菲光度法测定铁含量 生化物质分析 测定人体的生化指标— 人血清中总蛋白质的测定
It T I0
Lambert-Beer定律物理意义：当一束平行单色光垂直通过某一均 匀非散射的吸收物质，其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸光介 质厚度b成正比。
c= mol· L-1 K→ κ 摩尔吸光系数
A bc
mol–1 · cm-1 单位为：L ·
物理意义：当吸光物质摩尔浓度为1 mol· L-1 ，吸光介质 为1cm时，吸光物质度在某波长的吸光度。
吸收 吸收 吸收 吸收
溶剂 不加显色剂的试液 显色剂 显色剂 + 试液 + 待测组分的掩蔽剂
二、比尔定律的偏离
标准曲线法测定未知溶液的浓度时发现：标准曲线常发生弯曲（尤其 当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯—比耳定律的偏离。
引起偏离朗伯-比耳定律的因素：
物理因素 化学因素 介 质 不 均 匀 引 起 的 偏 离 溶 液 浓 度 过 高 引 起 的 偏 离 化 学 反 应 引 起 的 偏 离
A
2、 pH2﹤pKa -2 3、 pH3 ﹥ pKa+2 将(2), (3)代入(1) 得：
[ H ]c HB [ H ] K a
B
kac
[ H ] K a
(1) (2) (3)
AHB＝κHB· c； AB- ＝κB-· c
pKa pH lg
A AB AHB A
样品池 检测器
作用：用于盛待测及参比溶液 玻璃，光学玻璃，石英 厚度（光程）：0.5、1、2、3cm
作用：利用光电效应，将光能转换成电流讯号并放大
光电管，光电倍增管，光导摄像管
信号显示系统
作用：把放大的信号以适当方式显示或记录下来 表头、记录仪、屏幕、数字显示
§11.3 显色反应及其影响因素
显色反应
未知样品
方法简便
光电比色法
利用光电池或光电管等光电转换元件作检测器，来测量通过有 色溶液后透射光的强度，从而求出被测物质含量的方法叫做 光电比色法。
通过滤光片得一窄范围的光(20～50nm) 光电比色计结构示意图
一、分光光度计的组成
分光光度计的组成部件及 其各部分的作用？
0.575
光源 参比 I0
Tx Ts 示差法 T
0 5 10 50 100
（以溶液s作参比）：溶液x的T为0.50
Tr
Ts
落在测量误差较小的范围
结论：示差法通过提高测量的准确度提高了方法的准确度
例：某有色溶液以试剂空白做参比，用1cm吸收池于最大 吸收波长处测得A=1.120，已知有色溶液的λ=2.5×104 L· mol-1· cm-1。若用示差法测定上述溶液时，使其测量 误差最小，则参比溶液的浓度为多少？ （示差法使用吸收池亦为1cm厚）
吸收曲线（吸收光谱）
以不同波长的单色光一次照射某一吸光物质，并测量该物质在每一 波长处对光吸收程度的大小（吸光度），以波长（λ）为横坐标，吸光度 （A）为纵坐标，可以得到一条吸光度随波长变化的曲线，称之为吸光曲线。
c(1 ) (1 ) K 2 2 c c 2
A1
x A 1
x
y A1
y A 2
x y bc bcy 1 x 1
A 2 A 2
bcx bcy
x 2 y 2
κ为物质的特征参数，
可通过配制标准溶液测得。
解联立方程，可求得Cx，Cy
例：以分光光度法测定某合金钢中的锰和铬。称取 1.000g钢样，溶解后稀释至50.00mL。将其中的Cr氧化 成Cr2O72-，Mn氧化成MnO4-。然后在440nm和545nm 用1.0cm吸收池测量吸光度列于下表。求此合金钢中锰 和铬的质量分数。(MMn=54.94，MCr=52.00) A 440nm 545nm 0.204 0.860 КMn 95.0 2.35×103 КCr 369.0 11.0
二、物理化学常数的测定
1、弱酸弱碱解离常数的测定
2、络合物组成及稳定常数的测定
1.弱酸弱碱离解常数的测定
A HB B
HB
HB
H＋＋B
B HB B
Ka＝[H+][B]/[HB]
配制三种pH不同, c相同的溶液,测A(b=1). 1、 pH1≈pKa
A AHB AB HB [HB ] B [B ]
没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量生成有 色化合物再测定－－ 显色反应
【类型】 氧化还原和络合反应 （M + nR = MRn ） 影响显色反应的因素
酸度的影响 显色剂的用量 温度的选择 时间的选择 有机溶剂和表面活性剂 共存离子的干扰
§11.4 吸光度的测量及误差控制
一、测量波长和参比溶液的选择
2.络合物的组成及稳定常数的测定 摩尔比法测络合比
M + nR = MRn
CM固定； CMRn CR从 0 开始增大 A
CR
n
CR/CM
适用于解离度较小、络合比高的络合物组 成的测定
等摩尔连续变化法测络合比
M + nR = MRn CM+ CR = 常数 CM / C 从 0 →1
在特定波长测定：R不吸收 A CM / C =0.5 ，n = 1 CM / C =0.33 ，n = 2 0
20
0.7
60
0.2
80
0.1
T% A
吸光光度法的测量误差
当dT = 1%时，为了使测量误差 < 5%，控制溶液的 透光率 T = 15 ~ 70 % T = 15 ~ 70 % A = 0.15 ~ 0.80
10
dc/c 8 (%)
6 4 2 0 0 20
dT=2% dT=1%
dT=0.1%
40 60 80 100
d cx cx
dT Tx ln Tx
示差法
Ac bc x lg Tr
Ix Tr Is
∴ Tr > Tx
有
∵ I 0 > Is
d c x cx
dcx cx
结论：示差法提高了准确度
示差法提高准确度的实质
常规法（以水作参比）：溶液s和溶液x的T为0.05和0.10。 T
0 5 10 50 100
单色器
吸收池
检测器
显示
未考虑吸收池和溶剂对光子的作用
样品
It
注意 比较
入射光 I0
透射光 It
分光光度计的构成
光源 单色器
氢灯，氘灯，185 ~ 350 nm； 卤钨灯，250 ~ 2000 nm.
基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定 作用：将复合光色散成单色光 棱镜 玻璃， 350 ~ 2500 nm, 石英，185 ~ 4500 nm 光栅 平面透射光栅， 反射光栅
③ 选择适当的参比溶液
作用： 消除由于比色皿壁或试剂对入射光的反射或 吸收而带来的误差。
§11.5 吸光光度分析方法
一、经典光度分析方法
1、校准曲线法
单组分的测定
纯物质或共存物质不干扰 A
Lambert-Beer定律
A Kbc
Cx C
一、经典光度分析方法 2、示差光度法
常规法
示差法 A A′ 单组分的测定
吸光物质对光的吸收具有加和性
A A1 A2 An
§11.2 吸光光度法的仪器
目视比色法—比色管
光电比色法—光电比色计 分光光度法与分光光度计
可见光分光光度计
紫外分光光度计 红外分光光度计
目视比色法
观察方向 特点 利用自然光 比较吸收光的互补色光 准确度低（半定量） 不可分辨多组分 标准系列
T(%)
测量条件的选择
① 测量波长的选择： “最大吸收，最小干扰” 即无干扰，选λmax作为入射光波长；有干扰，选灵 敏度较低但能避免干扰的入射光波长。 ② 吸光度范围的选择 ： A = 0.15 ~ 0.80
A = kbc ，k定，只有通过改变b或c来改变A：对已显 色的待测液，可改变b；未显色的，可改变c。
dT-透光率读数误差
dT dT dc2 c dc3
dT dc Er c T lnT
三、吸光光度法的测量误差
Er 10 8 6 T = 0.368 = 36.8 % A = 0.434 误差最小 2 0 4 (36.8) 40 0.4 0.434
c 0.434T Er c T lg T ( T 0.01)
二、双波长分光光度法
存在问题： 1、共存组分与被测组分的吸收谱带重叠 2、溶剂、胶体、悬浮体等散射或吸收辐射 引起的背景干扰 解决方法：双波长分光光度法
双波长分光光度法
原理：双波长分光光度法只用一个试样池。检测器显示的是 试液对两束波长光的吸光度差值△A。
单色器
光 源
1
检测器
单色器
2
切 光 器
I 参比 I0 A lg lg I I 试液
一、测量波长和参比溶液的选择
2、参比液的选择
以显色反应为例进行讨论 M + R 若欲测 M-R 的吸收 max
待测物质的试液 显色剂 溶剂 吸光物质
= M-R max
参比液组成
无吸收 基质吸收 无吸收 基质吸收
无吸收 无吸收 吸收 吸收
光 学 透 明
Y 的存在不干扰 X 的测定
波长组合的选择
1、等吸收点选择参比波长和测量波长。
等吸收点：干扰组分在所选的两波长处具有相同的吸光度
2、选择参比波长和测量波长应使被测组分在这两波 长处具有较大的吸光度差。
§11.6 吸光光度法的应用
一、定量分析
无机离子分析 金属离子的测定— 邻二氮菲光度法测定铁含量 生化物质分析 测定人体的生化指标— 人血清中总蛋白质的测定
It T I0
Lambert-Beer定律物理意义：当一束平行单色光垂直通过某一均 匀非散射的吸收物质，其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸光介 质厚度b成正比。
c= mol· L-1 K→ κ 摩尔吸光系数
A bc
mol–1 · cm-1 单位为：L ·
物理意义：当吸光物质摩尔浓度为1 mol· L-1 ，吸光介质 为1cm时，吸光物质度在某波长的吸光度。
吸收 吸收 吸收 吸收
溶剂 不加显色剂的试液 显色剂 显色剂 + 试液 + 待测组分的掩蔽剂
二、比尔定律的偏离
标准曲线法测定未知溶液的浓度时发现：标准曲线常发生弯曲（尤其 当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯—比耳定律的偏离。
引起偏离朗伯-比耳定律的因素：
物理因素 化学因素 介 质 不 均 匀 引 起 的 偏 离 溶 液 浓 度 过 高 引 起 的 偏 离 化 学 反 应 引 起 的 偏 离
A
2、 pH2﹤pKa -2 3、 pH3 ﹥ pKa+2 将(2), (3)代入(1) 得：
[ H ]c HB [ H ] K a
B
kac
[ H ] K a
(1) (2) (3)
AHB＝κHB· c； AB- ＝κB-· c
pKa pH lg
A AB AHB A
样品池 检测器
作用：用于盛待测及参比溶液 玻璃，光学玻璃，石英 厚度（光程）：0.5、1、2、3cm
作用：利用光电效应，将光能转换成电流讯号并放大
光电管，光电倍增管，光导摄像管
信号显示系统
作用：把放大的信号以适当方式显示或记录下来 表头、记录仪、屏幕、数字显示
§11.3 显色反应及其影响因素
显色反应
未知样品
方法简便
光电比色法
利用光电池或光电管等光电转换元件作检测器，来测量通过有 色溶液后透射光的强度，从而求出被测物质含量的方法叫做 光电比色法。
通过滤光片得一窄范围的光(20～50nm) 光电比色计结构示意图
一、分光光度计的组成
分光光度计的组成部件及 其各部分的作用？
0.575
光源 参比 I0
Tx Ts 示差法 T
0 5 10 50 100
（以溶液s作参比）：溶液x的T为0.50
Tr
Ts
落在测量误差较小的范围
结论：示差法通过提高测量的准确度提高了方法的准确度
例：某有色溶液以试剂空白做参比，用1cm吸收池于最大 吸收波长处测得A=1.120，已知有色溶液的λ=2.5×104 L· mol-1· cm-1。若用示差法测定上述溶液时，使其测量 误差最小，则参比溶液的浓度为多少？ （示差法使用吸收池亦为1cm厚）
吸收曲线（吸收光谱）
以不同波长的单色光一次照射某一吸光物质，并测量该物质在每一 波长处对光吸收程度的大小（吸光度），以波长（λ）为横坐标，吸光度 （A）为纵坐标，可以得到一条吸光度随波长变化的曲线，称之为吸光曲线。