核酸测序技术
核酸检测有哪些检测方法
核酸检测有哪些检测方法
核酸检测是一种常用的病原体检测方法，用于检测某个生物体内的特定DNA或RNA序列。
常见的核酸检测方法包括以下几种：
1. PCR（聚合酶链式反应）：PCR是一种常用的核酸扩增技术，通过多次循环进行DNA序列的扩增，以检测特定的DNA或RNA序列。
2. RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）：RT-PCR结合了逆转录和PCR技术，可以将RNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，用于检测RNA病原体的存在。
3. qPCR（实时荧光定量PCR）：qPCR是一种PCR的变体，可以在扩增过程中实时检测PCR反应产生的荧光信号，以定量检测目标核酸的数量。
4. LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）：LAMP是一种在等温条件下进行核酸扩增的方法，可以快速、简便地检测特定序列的DNA或RNA。
5. 点杂交检测：通过固相杂交的方式，将特定的DNA或RNA序列与荧光标记或放射性标记结合，形成杂交产物后进行检测。
6. 基因芯片技术：利用基因芯片上的数千、数百万个特定探针，检测目标核酸序列的存在与否。
7. 测序技术：通过DNA或RNA的测序来检测其中的碱基序列，了解特定序列的存在与否。
以上是常见的核酸检测方法，每种方法都有其适用的场景和优缺点，医学实验室和疾病防控部门会根据具体需求选择适合的方法进行核酸检测。
三种核酸检测方法
三种核酸检测方法
目前常用的三种核酸检测方法为：
1. PCR（聚合酶链式反应）：PCR 是一种常用的核酸检测方法，通过引物与目标序列的互补配对，利用酶的作用在体外复制目标DNA 或RNA 片段，进行扩增后，通过荧光探针或凝胶电泳等方法进行检测。
PCR 方法具有高灵敏度和特异性，可以检测极微量的目标核酸。
2. LAMP（等温扩增法）：LAMP 是一种基于异构酶的等温扩增技术，可以在恒温条件下，通过多个特异性引物和DNA 聚合酶，实现核酸片段的高倍增。
LAMP 技术不需要特殊设备和高精度温控，成本较低，操作方便，适用于一些基层医疗机构进行疫情监测。
3. NGS（高通量测序）：NGS 是一种高通量测序技术，可以同时测定数百万条DNA 或RNA 片段的序列，广泛应用于基因组学和转录组学研究。
在核酸检测领域，NGS 技术可以通过对样本进行高通量测序，快速检测和鉴定病原体的基因组序列，对于新型病毒的检测和变异分析具有较高的灵敏度和准确性。
然而，NGS 技术需要专业的设备和分析软件，成本较高，操作复杂，一般用于重大疫情的溯源和研究。
传染病的病原体检测技术与方法
传染病的病原体检测技术与方法近年来，传染病的爆发频繁，对人类生命和安全造成了严重威胁。
为了及早发现和控制传染病，科学家们致力于研究和发展各种病原体检测技术和方法。
本文将重点介绍一些常用且颇具前景的传染病病原体检测技术与方法。
一、聚合酶链式反应（PCR）PCR是一种广泛应用于DNA分子扩增的技术，其原理是通过连续性的DNA链延伸来产生大量与目标DNA序列相同的DNA片段。
PCR 技术可以迅速、高效地检测多种传染病病原体，如流感病毒、艾滋病病毒等，具有高度的敏感性和特异性，成为了病原体检测领域的重要手段。
二、核酸测序技术核酸测序技术通过测定DNA或RNA序列信息来确定病原体的种类和亚型。
它可以帮助研究人员了解病原体演化和变异，为传染病防控提供重要信息。
以高通量测序技术为代表的新一代测序技术，使得大规模、高速测序成为可能，极大地推动了传染病病原体检测的发展。
三、免疫学检测方法免疫学检测方法是利用抗体与病原体的特定抗原结合来实现其检测的一种方法。
目前广泛应用的免疫学检测技术包括酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫荧光法、免疫印迹法等。
这些方法操作简便、灵敏度高，对于一些常见的病原体，如肺结核杆菌、流感病毒等，免疫学检测方法仍然是一种可靠的选择。
四、质谱技术质谱技术是一种通过测量分子离子的质量和质荷比来鉴定和分析物质的方法。
质谱技术具有高灵敏度、高分辨率和高特异性的优点，可以实现对病原体共有特征的鉴定和分析。
质谱技术在传染病病原体检测中的应用越来越广泛，如食源性病菌、艾滋病病毒等的检测均有所突破。
五、快速诊断技术为了快速诊断传染病，科学家们研发了一系列快速诊断技术。
其中，免疫层析检测技术、电化学和纳米技术等都可以实现快速、灵敏的检测结果，并且具备携带方便、操作简单的特点。
这些技术适用于一些资源匮乏或临床急需的环境，有助于快速筛查和确诊传染病。
在传染病病原体检测技术与方法的发展中，还存在一些挑战和问题亟待解决。
三代测序技术的原理
三代测序技术的原理三代测序技术是指通过直接测序DNA或RNA分子，而不需要进行PCR扩增，从而能够更快地获取基因组或转录组的信息。
三代测序技术的原理主要有以下几种：1. 单分子测序原理：这种技术通过将DNA或RNA分子固定在测序平台上，利用荧光信号的变化来识别核酸碱基的顺序。
具体而言，这种技术一般使用一种特殊的引物，将DNA或RNA单分子连接到测序平台上。
接着，通过向样本中供应一种特定的核酸碱基，当该碱基与目标分子的下一个碱基匹配时，就会释放一种荧光信号，可以通过检测这种信号来确定核酸序列。
2. 实时测序原理：这种技术通过监测DNA合成的过程中释放的荧光信号来测序。
具体而言，这种技术使用一种特殊的合成DNA酶，它能够在DNA合成过程中释放荧光信号。
在测序的过程中，使用一个特定的引物和荧光信号强度监测系统，当该引物与待测DNA的下一个碱基匹配时，会释放出荧光信号。
通过监测这种信号的变化，可以获得核酸序列信息。
3. 液相法测序原理：这种技术通过在一种特殊的反应体系中进行DNA合成和检测。
具体来说，这种技术一般使用一种特殊的酶（如聚合酶），它能够在特定的反应条件下使用脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）作为合成DNA的底物。
在反应的过程中，每添加一个核苷酸，就会释放出一种特定的荧光信号。
通过监测这种信号的强度变化，可以获得核酸的序列信息。
总的来说，三代测序技术的原理主要是通过不同的方法来区分和检测DNA或RNA分子的碱基序列，从而实现基因组或转录组的测序。
这些技术相较于传统的第二代测序技术拥有更高的测序速度和更低的成本，已被广泛应用于生物学和医学领域。
生物化学中的核酸测序技术
生物化学中的核酸测序技术生物化学是探究生物分子之间相互作用、转化及其机制的学科。
而核酸测序技术则是生物化学领域中最具有挑战性和创造性的领域之一。
核酸测序技术使我们可以在生物体内找到并理解基因信息，这对于我们深入探究生物学的本质和解决许多生物学问题都有着至关重要的作用。
一、核酸测序技术的发展历程核酸测序技术自20世纪60年代开始起步，经历了多次技术革新，从最初的Sanger测序到现在的高通量测序。
Sanger测序技术虽然已经过时，但是它为测序技术的发展奠定了基础。
其后，Maxam-Gilbert测序技术迅速起扬，并且在90年代初期，由于Dye terminator测序技术的出现，被高通量测序接引而完成了质的飞跃。
近年来，第三代测序技术的崛起，给人们带来了让人眼花缭乱的技术新特性。
她们有ICF测序，pyrosequencing, single molecule sequencing, Nanopore测序等。
二、高通量测序技术的优势传统的Sanger测序技术的局限性主要在于速度和通量的问题。
而高通量测序技术的推出，对于测序时间和测序深度的提高很有意义。
同时，高通量的数据产生需要了解大数据的统计分析方法也被逐渐的实现，从而初步完成了数据处理的流程。
与传统的测序技术相比，高通量测序具有多样化、快速、准确，而且适用于不同类型的测序，如参考基因组和非参考基因组测序等。
通过高通量测序技术，我们可以在生物组织、DNA、RNA属于细胞物质内进行高灵敏度且高效率的序列分析，获得大量的信息。
这种方法广泛应用于基因解码、生物多样性研究、复杂性研究和医学研究等领域。
三、高通量测序技术的应用目前，高通量测序技术已经广泛应用于生物学领域，如个体基因组分析、全基因组测序、转录组测序、表观遗传学、代谢组学、多重组学等研究项目。
尤其在癌症、肿瘤、医学方面取得了重要进展。
借助这些技术，我们可以快速准确地识别显性或隐性的疾病风险，帮助判断肿瘤类型及治疗方案等，以实现精准用药。
PCR技术及测序
pcr技术的发展历程
1983年
Kary Mullis首次提出PCR技术的基本 原理。
1985年
Mullis和Cetus公司合作，实现了第一 次成功的PCR实验。
1987年
美国PE-Cetus公司推出了商业化PCR 仪，使PCR技术开始广泛应用于生命 科学研究领域。
1990年
美国PE-Cetus公司推出第一台自动 PCR仪。
测序分析
对PCR产物进行测序，获得目标基因的序列信息。
结果解读
对测序结果进行解读，分析基因变异、表达水平等信息。
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测序分析
对纯化的产物进行测序分析，以确定其序列。
结果解读
对测序结果进行解读，分析其与已知序列的 相似性和差异性。
04 测序技术概述
测序技术的定义
测序技术是指通过一定的方法测定生 物体内核酸的碱基排列顺序，从而分 析其基因型的过程。
测序技术是基因组学、遗传学和生物 信息学等领域的重要工具，对于生命 科学研究、医学诊断和治疗等方面具 有重要意义。
pcr技术及测序
目录
• pcr技术概述 • pcr技术的基本原理 • pcr技术的操作流程 • 测序技术概述 • 测序技术的基本原理 • 测序技术的操作流程
01 pcr技术概述
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
pcr技术的定义
• 聚合酶链式反应（PCR）：一种在生物体外复制特定DNA片段 的核酸扩增技术，通过DNA聚合酶的催化，将模板DNA在一定 温度下进行变性、退火和延伸，完成DNA的扩增。
测序技术的反应过程
模板准备
提取待测DNA，进行纯化处理，获得高质量的模板。
引物设计
核酸检测篇-2-二代DNA测序技术
编号：2-2主题：第二代DNA测序技术概述：第一代测序（缺点：通量低1000个核苷酸/反应，费用高）•化学降解法•双脱氧链终止法（Sanger法）•荧光自动测序技术•杂交测序技术高通量测序：第二代测序（next-generation sequencing，NGS）第二代测序技术的核心思想是边合成边测序(Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。
这三个技术平台各有优点，454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长(read)能达到400bp；Solexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的1/10；SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前第二代测序技术中准确度最高的。
虽然第二代测序技术的工作一般都由专业的商业公司来完成，但是了解测序原理、操作流程等会对后续的数据分析有很重要的作用，下文将以Illumina/Solexa Genome Analyzer 测序为例，简述第二代测序技术的基本原理、操作流程等方面。
原理：Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。
在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。
Illumina Solexa测序仪特点：•桥式PCR•边合成边测序•可逆终止物Illumina Solexa 测序流程：操作步骤：1)测序文库的构建(Library Construction)首先准备基因组DNA(虽然测序公司要求样品量要达到200ng，但是Gnome Analyzer系统所需的样品量可低至100ng，能应用在很多样品有限的实验中)，然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接头(Adaptor)。
测序技术原理和流程
测序技术原理和流程测序技术是指对生物样本中的DNA或RNA分子进行高通量、高效率的测序的技术手段。
它的应用覆盖了生物研究、医学诊断、基因组学和生物信息学等领域。
测序技术的原理是基于DNA合成或RNA合成的反应，利用不同的标记或信号来鉴别不同的碱基或核酸分子。
常见的测序技术包括经典的链终止法（Sanger测序法）和新兴的高通量测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）。
链终止法的原理是以DNA聚合酶合成DNA链的特殊性质为基础。
在反应体系中，加入了放射性标记的dNTP（如32P-dATP）和一小分量的ddNTP（如ddATP），DNA聚合酶能够在ddNTP发生连接时停止链的延伸。
通过在反应体系中同步加入4种不同的ddNTP，可以得到4个含有所有可能数据的同分子体系。
将延伸完的DNA片段经过电泳分离，就可以得到DNA序列。
这种方法的优点是精确度高，可靠性好，但是速度慢，成本较高。
相对于链终止法，高通量测序技术具有更高的测序速度、更低的测序成本和更高的数据产出量。
其中最常用的有Illumina测序技术和Ion Torrent测序技术。
Illumina测序技术是一种基于DNA桥式扩增的技术。
首先，通过随机打断DNA样本，得到短的DNA片段；然后，将这些DNA片段固定在流动细胞集群上，形成DNA桥；接着，通过依次加入dNTP和DNA聚合酶，进行循环延伸，将DNA片段一碱基一碱基地合成；在每一轮延伸结束后，通过激光照射来检测已加入的dNTP的标记，之后，使用酸来剥离已合成的碱基和带有荧光标记的dNTP。
最后，通过影像捕捉，得到含有已加入的碱基信息的图像。
这个过程可以反复进行多次，以获得更长的DNA序列。
Illumina测序技术的特点是高通量、高准确度，但是会产生较多的测序错误。
Ion Torrent测序技术则是基于核苷酸的释放和测量。
当dNTP在DNA 链生长过程中连接到正在生长的DNA链上时，会释放出一个氢离子（H+）被检测器测量。
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测序的发展
• 1965年 Holley用7年完成酵母丙氨酸转运 RNA序列测定
• 同年Sanger发明RNA小片段序列测定法 • 1975年Sanger和Coulson建立DNA序列测
定加减法
• 20世纪80年代出现双脱氧链终止法+荧光标 记的自动测序技术
➢ 反复30 轮扩增，每个单分子得到了1000 倍扩增，成为 单克隆DNA 簇。
➢ DNA 簇产生之后，扩增子被线性化。
3. 测序—边合成边测序
加入DNA 聚合酶、带有4 种荧光标记的dNTP。
这些核苷酸是“可逆终止子”，3’端带有可化学切割的部分，只容许 每个循环掺入1个碱基。
用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所 聚合上去的核苷酸种类。
鸟枪法测序
• DNA的提取与纯化 • 构建随机亚克隆：将DNA用超声切成小片段，
小片段与载体结合，转化入细菌进行培养 • 从细菌中提取质粒 • 进行测序反应 • 上测序仪测序 • 数据分析：发现重叠区域，
对大片段的DNA定序
一代测序的临床应用
• 病原微生物鉴定 细菌核糖体基因结构特征
rRNA基因存在于细菌、衣原体、立克次体、 支原体、螺旋体、放线菌等原核生物染色体 基因中。
• 2003年，人类基因组计划完成，人体基因 密码被解读
第一代测序技术
• 双脱氧核苷酸末端终止测序法 • 化学降解法 • 荧光自动测序技术 • 焦磷酸测序技术 • 杂交测序技术 • 单分子测序技术
第二代测序技术
454 测序技术 Solexa测序技术 SOLiD测序技术
第三代测序技术
Heliscope单分子测序技术 单分子实时测序技术 纳米孔单分子测序技术
核酸测序技术
教学大纲
• 【掌握】 双脱氧核苷酸末端终止测序法的 基本原理；第一代测序技术在临床上的应 用
• 【熟悉】 二代测序技术的基本原理和分类 • 【了解】 三代测序技术的的基本原理
测序的生物学意义
• DNA的一级结构决定了基因的功能，欲 想解释基因的生物学意义，首先必须知道 其DNA序列。
将这些基团化学切割，恢复3 ’端粘性，继续聚合第二个核 苷酸。
如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。 统计每轮收集到的荧光信号结果，就可得知每个模板
DNA 片段的序断成300－800 bp的
片段；对于小分子的非编码RNA 或者PCR 扩增 产物，则不需要。 ➢ 将A 和B 接头（3’和5’端具有特异性）连接到 DNA 片段上。接头也将用于后续的纯化，扩增和 测序步骤。
信号
C TAC GA C T A
一代测序的临床应用
• 人类基因组计划
• 与曼哈顿原子弹计划和阿波罗计划并称为三大科学计划， 被誉为生命科学的“登月计划”。
• 测定组成人类染色体(指单倍体)中所包含的30亿个碱基对 组成的核苷酸序列
• 绘制人类基因组图谱 • 辨识其载有的基因及其序列
• 破译人类遗传信息的最终目的。
↓
乙醇/NaAc→测序PCR产物纯化←离心机等
↓
胶、buffer→测序←ABI3130XL测序仪
↓
数据分析←Chromas 2
测序反应原理
DNA分子 许多脱氧核苷酸相连构成
一分子含氮碱基+一分子脱氧核糖+一分子磷酸根
dNTP
• 脱氧核苷三磷酸 • 在生物DNA、RNA合成中，及PCR中起原
料作用 • 含有3’ -羟基
Solexa测序技术1. 制备 将基因组DNA 打成几百个碱基（或更短） 的小片段，在片段的两个末端加上通用接 头。
2. 产生DNA簇－芯片表面进行
➢ 芯片表面连接有一层单链引物，DNA 片段与芯片表面的 引物碱基互补，被一端“固定”在芯片上。
➢ 另外一端随机和附近的另外一个引物互补，也被“固定” 住，形成“桥 “。
B3: C/TCATCCACTCACCTTATTGGGTAAAA
C: 96% T: 4%
250
200
150
100
50
0
E
S
G
T
C
A
T
C
A
C
5
3’ A G G A T C T G A T T G T G G G A T5’ 5’T C C T A G A C T A A C A C C C T A3’
细菌16s rRNA具有多拷贝、多信息的特点
16S rRNA编码基因长度约1500 bp，包含大约50个功能域。 16S rRNA基因由可变区和保守区组成。保守区为所有细菌所共有，可
变区具有属或种的特异性。 几乎所有病原菌16S rRNA基因测序均已完成，已成为细菌分类的金标
准。 可根据保守区设计各种细菌的通用引物，也可根据可变区设计特定细
人类基因组计划与第二代测序技术
• 人类基因组计划的实施，大量的基因通过基因组 测序被识别。
• 接下来要对这些基因的结构、功能、表达和分布 进行深入的研究。
• 急需高通量、大规模的分析手段和方法来解决这 些需求。
• 第二代 DNA 测序技术是高通量研究基因的结构 和功能的重要的技术。
第二代测序技术
双脱氧核苷酸末端终止测序法 荧光自动测序技术
• 操作流程
• 测序反应原理
• 测序数据分析
基因测序操作流程
采用试剂盒→核酸提取与纯化←离心机等
↓
引物、PCR反应条件设计→目的片段PCR←PCR仪
↓
SAP酶消化、柱纯化→ PCR产物纯化←PCR仪
↓பைடு நூலகம்
BigDye、buffer、引物、水→测序PCR←PCR仪
ddNTP
双脱氧核苷三磷酸
测序反应
测序反应
荧光标记的测序反应产物
测序反应的延伸阶段，ddNTP在不同位置掺 入，产生一系列不同长度的新的DNA片段。
基因分析仪的基本构造
突变图例
焦磷酸测序原理
▪ 每次向反应体系中加入一种dNTP ▪ 相应位置的峰代表该种dNTP的掺入情况 ▪ 峰高与掺入的核苷酸数量成正比 ▪ 多余的dNTP在加入下一种dNTP前就被降解
菌的特异引物或探针。 16S rRNA基因可变区所含信息的种间差异，使检测具有特异性。
实验步骤
合成细菌通用引物序列 提取细菌DNA PCR反应,产物电泳 一代测序 序列结果分析（NCBI BLASTn比对流程）
比对细菌的16S rRNA基因，相同性百分比大于99%可以定义到种的水 平，97%～99%可以定义到属的水平，小于97%有可能是一个新种。