农杆菌介导转化法的概述
1农杆菌转化法的原理是
1农杆菌转化法的原理是农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）转化法是一种重要的基因转化技术，广泛应用于植物基因工程研究和农业生产中。
其原理基于农杆菌与植物细胞间的相互作用，利用农杆菌外源DNA（T-DNA）的引导作用将目标基因嵌入到植物细胞的染色体中。
农杆菌转化法的主要步骤包括农杆菌培养、感染、共培养和筛选。
具体来说，其原理可分为农杆菌感染、T-DNA引导、T-DNA拼接和植物细胞接受等几个阶段。
首先，农杆菌感染是农杆菌与植物细胞发生接触的过程。
农杆菌通过外源的感染素（vir蛋白）介导，诱导植物细胞在感染部位生长出肿瘤组织，为转化提供了良好的环境。
感染素能够识别并结合到植物细胞的切伤部位，进而形成感染结构。
接着，T-DNA引导是农杆菌T-DNA（转座子DNA）与植物细胞染色体DNA 之间的互作过程。
农杆菌T-DNA原先位于质粒中，通过T-DNA上的边缘重复序列（LB和RB）以及其中的转移基因（transgenes）引导将T-DNA插入到植物细胞染色体中。
T-DNA在感染素作用下从质粒中剪切出来，再与植物细胞的染色体DNA发生重组，将T-DNA嵌入到染色体的随机位置。
随后，T-DNA拼接是指T-DNA与植物细胞染色体DNA发生重组并嵌入到染色体的过程。
T-DNA的LB和RB序列能够诱导农杆菌酶系统切割起始位点（nick sites），将T-DNA与染色体DNA连接起来。
然后，T-DNA和染色体DNA之间发生DNA重组，形成补充植物基因组的新构建（chimeric construct）。
这一过程具有较高的随机性，T-DNA可能嵌入到不同的染色体位点，并且还有可能发生多个T-DNA拼接。
最后，植物细胞接受是指植物细胞在T-DNA拼接完成后仍能够正常生长和分化。
当T-DNA成功嵌入植物细胞染色体后，植物细胞会通过自身的修复机制进行DNA修复，恢复正常的遗传信息。
如果T-DNA中存在目标基因，那么该基因就被整合到了植物细胞的染色体中，并能够在细胞分裂和再生的过程中被遗传和表达。
农杆菌介导的T-DNA转化法简介
农杆菌介导的T-DNA转化法简介
农杆菌介导的T-DNA转化法是一种在植物遗传学中常用的技术，利用农杆菌的Ti质粒将特定的DNA片段（T-DNA）转移到植物基因组中，从而实现对植物基因的敲除或功能修改。
T-DNA的整合机制
T-DNA的整合过程通常是随机的，通过非同源末端连接（NHEJ）或微同源介导的末端连接（MMEJ）等DNA修复机制完成。
这种整合可以导致植物基因的表达失活或改变。
敲除植物基因的步骤
1.选择植物材料：选择易于农杆菌转化的植物品种。
2.构建转化载体：将目标基因序列插入T-DNA载体中。
3.农杆菌转化：将载体转化到农杆菌中。
4.植物转化：利用农杆菌感染植物细胞。
5.筛选转化植物：使用选择标记筛选转化的植物。
6.验证转化植物：通过分子生物学方法验证T-DNA整合。
7.表型分析：分析基因敲除的表型效果。
敲除基因的应用意义
敲除特定的植物基因可以帮助科学家研究基因的功能和调控网络，对于理解植物生长发育、病害防治等方面具有重要意义。
实验室操作的注意事项
在进行农杆菌介导的T-DNA转化实验时，需要注意选择合适的植物材料、构建高效的转化载体、严格的筛选过程以及准确的分子验证方法。
同时，确保遵循相关的生物安全规定和指南。
农杆菌介导转化法
它是利用根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌的Ri 质粒上的一段T-DNA区在农杆菌侵染植物形成 肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细胞并 插入到染色体基因中。利用Ti质粒的这一天然的 遗传转化特性,可将外源基因置换T-DNA中的非 必需序列即可使外源基因整合到受体染色体而获 得稳定的表达。
T-DNA区含选择标记基因＋报告基因
农杆菌介导转化法
转基因植物
一、植物转基因技术
• 植物转基因技术是生命科学前沿的重要领域之一。 它是指用人工分离和修饰过的外源基因通过载体、 媒体或其他物理、化学方法导入植物细胞中并得
到整合和表达，并通过对转化植株的鉴定选择，
从而使其遗传性状发生改变的技术。创造出人类
所需要的新品种或新物种。
目的基因的分离和克隆 克隆基因的鉴定与分析
报告基因 选择标记基因
遗传转化预备实验使用载体的T-DNA区
选择标记基因（npt－Ⅱ，hpt）确定选择用抗生素类型，报告基
因（gfp,gus)可以通过快速鉴定，迅速确定材料是否能够表达外源报 告基因，及其统计转化效率，获得最佳诱导因素的梯度，从而优化 目的基因的转化条件，之后进行目的基因转化。 gus基因的表达产物可以与化学试剂发生蓝色反应；gfp基因产物 直接在蓝光下或紫外光下发出绿色荧光。
待改良植物的预处理 受体细胞系统建立
目的基因载体构建
植物细胞的遗传转化 目的基因在受体细胞的整合与表达 转化细胞克隆的筛选 转基因植株的获得与分子鉴定
田间性状鉴定
育成转基因植物新品种
二、植物基因转化方法
（一）外源基因的间接转化法（载体介导法） 农杆菌介导法（双、单子叶植物） （二）外源基因的直接转化法 物理法诱导DNA直接转化： 基因枪法(单子叶植物 )、显微注射 化学诱导DNA直接转化： PEG(原生质体） （三）花粉管通道法介导基因转化（种质系统介导法）
农杆菌转化法原理
农杆菌转化法原理农杆菌转化法是一种常用的植物基因转化技术，其原理是利用农杆菌在植物体内引起植物细胞的转化，使外源基因被导入植物细胞内，从而实现对植物基因的改造。
这项技术在农业生产和基因工程领域有着广泛的应用，为改良作物品种、提高农作物产量、抗病虫害等方面提供了有力的技术支持。
农杆菌转化法的原理主要包括以下几个关键步骤：1. 农杆菌感染植物细胞。
首先，将含有外源基因的质粒DNA导入到农杆菌的Ti质粒中，然后将农杆菌与植物组织接触，使其感染植物细胞。
农杆菌通过其特殊的毛状附着器将Ti质粒转移到植物细胞内。
2. 植物细胞内基因导入。
农杆菌感染植物细胞后，Ti质粒中的外源基因会被转移到植物细胞内。
这些外源基因可以是对抗病虫害、提高产量或改良品质的基因，通过农杆菌的介导，成功导入到植物细胞内。
3. 外源基因整合到植物基因组。
一旦外源基因进入植物细胞内，它们会与植物细胞的染色体发生重组，将外源基因整合到植物基因组中。
这样，外源基因就成为植物细胞的一部分，可以被遗传到后代植物中。
4. 外源基因表达。
一旦外源基因整合到植物基因组中，它们就会开始在植物细胞内进行表达。
外源基因的表达可以使植物获得新的性状，比如抗病虫害、耐逆境等，从而实现对植物性状的改良。
农杆菌转化法的原理简单清晰，通过这种方法可以实现对植物基因的改造，为农业生产提供了重要的技术手段。
在实际应用中，农杆菌转化法已经成功应用于多种作物，如水稻、小麦、玉米、大豆等，为作物的抗病虫害、耐逆境等性状的改良提供了有效途径。
总的来说，农杆菌转化法作为一种重要的植物基因转化技术，其原理清晰，操作简单，成功率高，因此在农业生产和基因工程领域有着广泛的应用前景。
随着技术的不断进步和完善，相信农杆菌转化法将会为农业生产和作物改良带来更多的机遇和挑战。
农杆菌介导法
实验九植物遗传转化——农杆菌介导法一、目的了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化水稻的技术二、原理根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能力。
下列因子与转化过程有关：1. Ti 质粒(tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA)T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的一段DNA序列。
T-DNA含有RB和LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作用元件。
不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。
置于该边界内的任何外源基因均可被转化。
LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能力丧失，这时几乎完全没有T-DNA的转移。
LB（－链）5’GT TTACACCACAA TA TATCCTG CCA 3’RB（＋链）5’TGA CAGGA TA TA TTGGCGGGTAA AC 3’2. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵子转化所必需的基因有vir A、B、C、D、E、G。
其中蛋白VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强子；VirD2在T-DNA底链起内切酶作用造成切刻，并与T－链5’ 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA 结合蛋白，有2个NLS。
该操纵子的表达顺序如下：vir A和vir G组成型表达形成VirA和VirG蛋白→VirA被植物创伤信号分子激活→激活的VirA使VirG激活→激活的VirG 诱导vir C、D、E、B、F、H表达。
3. 农杆菌染色体基因组相关基因：chv A、chv B（农杆菌运动、附着）、chv D、chv E（编码单糖结合蛋白、趋化性）、psc A、att、cel（合成纤维素丝，附着）。
它们与农杆菌的趋化性和识别附着植物细胞有关。
根癌农杆菌介导法原理
根癌农杆菌介导法原理引言根癌农杆菌介导法是一种常用的基因转化技术，广泛应用于植物遗传工程领域。
它利用植物根癌农杆菌接触感染时产生的植物激素和DNA导入技术，将外源基因导入植物细胞，实现对植物基因组的改造。
本文将全面、详细、完整地探讨根癌农杆菌介导法的原理、应用以及优缺点。
根癌农杆菌的特点1. 根癌农杆菌简介根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 是一种通过植物接触感染的土壤细菌，在植物遗传工程研究中具有重要的应用价值。
它能够将其自身的T-DNA（转座子DNA）片段导入植物细胞，并在植物细胞中稳定表达。
2. 根癌农杆菌的感染机制根癌农杆菌感染植物的过程包括以下几个步骤：1.识别和结合：根癌农杆菌通过识别植物伤口释放的酚类化合物，结合到植物细胞表面。
2.感染透入：根癌农杆菌产生的信号分子诱导植物细胞产生细胞壁降解酶，使其自身进入植物细胞。
3.T-DNA转移：根癌农杆菌通过特殊的转移螺旋（vir蛋白）将T-DNA从细菌自身转移到植物细胞中。
4.T-DNA整合：转移的T-DNA片段在植物细胞染色体上整合，并导致植物细胞的遗传改变。
根癌农杆菌介导法原理根癌农杆菌介导法利用根癌农杆菌的感染机制，将外源基因导入植物细胞，从而实现对植物基因组的改造。
1. 构建适合的转化载体在根癌农杆菌介导法中，首先需要构建适合的转化载体。
转化载体通常包括以下几个重要组成部分：•T-DNA：携带待转化的外源基因片段。
•选择标记基因：用于筛选转化成功的植物细胞。
•根癌农杆菌起始核酸序列（ori）：用于在根癌农杆菌中复制转化载体。
2. 根癌农杆菌感染植物将构建好的转化载体导入根癌农杆菌中，然后让根癌农杆菌感染植物组织。
通常可以通过以下步骤实现：•制备根癌农杆菌感染液：将构建好的转化载体导入根癌农杆菌中，培养至菌体达到一定浓度。
•植物组织处理：将待转化的植物组织浸泡在根癌农杆菌感染液中，利用真空处理或共振法促使菌体进入植物细胞。
农杆菌介导的转化方法
第二步 感染植物
农杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的 基部）。
第三步 毒性基因（vir）表达 virA、virG、virD、virB… 第四步 T-DNA转移 T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞 核里，整合到植物基因组中。 第五步 诱导冠瘿瘤 T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和 细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。 第六步 土壤农杆菌代谢冠瘿碱。
① Ti质粒
存在于能引起植物形成冠瘿瘤的农杆菌中，诱导双子 叶冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumor inducing plasmid）。
根瘤
改造后的Ti质粒载体模式
ori
4
② 农杆菌的感染和生存 第一步:植物受伤
植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙酰丁香 酮、羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的 毒性基因表达。
农杆菌介导转化法
农杆菌
(Agrobacterium tumefaciens),是一种革兰氏阴性土壤杆菌,它含 有Ti质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤,即诱发冠瘿瘤.Ti质粒(包 括Ri质粒)上有一段转移DNA,在农杆菌侵染宿主植物时,这段DNA可以 转移进植物细胞,并稳定地保留在植物细胞染色体中,变为植物细胞新增 加的一群基因,最终能通过有性世代遗传给子代 。
④农杆菌转化的方法
1、共培养法
包括原生质体共培养、悬浮细胞共培养和愈伤组织共培养。
2、叶圆盘法 3、活-integration method
2.叶盘转化法
农杆菌共培养侵染
愈伤组织 分化生芽
生根
3. 活 体 接 种 法
农杆菌转化法的原理
农杆菌转化法的原理
农杆菌转化法是一种利用外源DNA和农杆菌介导的在细胞内表达的方法。
该方法最早由美国生物化学家Herbert Boyer于1973年提出，并于1977年被用于创造第一个基因突变植物。
自此，农杆菌转化技术在分子生物学、分子遗传学、细胞生物学等领域取得了巨大成功，成为近十几年来生物技术发展中最重要的技术之一。
农杆菌转化法的原理是将外源DNA片段植入特定的农杆菌中，然后让农杆菌介导将外源DNA片段植入到宿主细胞中，以达到改变宿主基因的目的。
具体而言，首先需要在细胞中引入一种叫做“质粒”的载体，它可以携带外源DNA片段，然后在细胞中的特定位置，利用农杆菌提供的一些促进基因转移的酶将质粒植入细胞中。
农杆菌转化法为研究植物基因组提供了一种灵活、可靠、快速且高效的方法，可以用来改变植物的遗传特性，控制植物的生长发育状态，以及提高植物的产量和质量。
而且，农杆菌转化技术还可以用来为研究人员提供精确的模型，以更好地理解植物的基因表达和调控机制。
此外，农杆菌转化法还可以用于制造生物材料和医药，以及制造其他用途的产品。
因此，农杆菌转化法在生物技术领域具有重要的应用价值，是生物技术发展中最重要的技术之一。
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———————————————————————————————— 作者——————— 日期：
ﻩ
学年第学期
2０１4级硕士生生物化学期末论文
任课老师：
开课学院:
课程名称:
学 院:
专 业:
学 号:
姓 名:
2０15年６月20日
农杆菌介导转化法的概述
2．２vｉr基因表达的产物作用于T－ＤNA产生T－DNA链，进而转化形成T-DＮA复合体，随后在植物及细菌蛋白的共同作用下被摄入细胞核内。
叶植物(尤其是水稻）中也得到了广泛应用。本文对农杆菌介导转化法进行综述。
关键词：农杆菌转化方法转化效率
１关于农杆菌
农杆菌[3－5]是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性的感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。与植物基因转化有关的有根瘤农杆菌和发根农杆菌这两种类型。
摘要：自从1983年转基因植物诞生以来，植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因,通过各种方法转移到植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。[１]
目前，应用于植物转基因较多的方法有基因枪轰击法和农杆菌介导法。由于基因枪轰击的随机性,容易出现突变、丢失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的稳定表达的缺点，而农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化系统，外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定，是最常用的转基因技术[2］。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来,农杆菌介导转化法在一些单子
１.1根癌农杆菌
依据Ti质粒诱导的植物细胞产生的冠瘿碱的种类不同，根癌农杆菌可分为4种类型:章鱼碱型(Octoｐiｎe)、胭脂碱型（Nopaｌine)、农杆碱型(Ａgroｐine）和琥珀碱型（Ｓｕccinamopｉne)。
原始的Ti质粒根据其功能的不同可分为4个区:
1．1．1Ｔ-DNA区(Tｒansｆｅr—DＮA regｉｏn)：不同来源的菌株,T-DNＡ的长度在12~24 kｂ,它是在农杆菌侵染细胞时,从Ｔi质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DＮA,其携带的基因与肿瘤的形成有关,但与T-ＤNＡ本身的转移与整合无关．T-DNA上最重要的是T－DNＡ区两端的边界各为25 bｐ的重复序列.其中14ｂp是完全保守的，分10 bp(CAGGAATATAT)和4 bp(GTAA）不连续的2组.左右２个边界(ＬB和RB)是T—DＮＡ转移所必需的,只要其存在，Ｔ-DＮA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中，转移的方向是从右向左，T－DNA的右边界在T-DNＡ的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用,因此,尤以右边界更为重要。
1.1.3接合转移区(Ｃon区）：该区段存在有与细菌间接合转移有关的基因（tｒa),调控Ti质粒在农杆菌间转移。
1.１．4复制起始区(ｏri区)：该区段调控Ti质粒的自我复制。
在遗传转化过程中除了Ti质粒上的基因参与外,还有农杆菌染色体基因．染色体基因包chvＡ、cｈｖB、atｔ、pscＡ、cｈvD以及chｖＢ.它们大多编码一些膜相关蛋白,负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。
1.１.２毒性区(vir区)：位于T-DＮＡ以外的１个３0－４0kb的区域内,该区段编码的基因虽然并不整合进植物基因组中,但对T-ＤNＡ的转移和整合非常重要。这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因（vir)。目前,对章鱼碱型农杆菌Ｔi质粒pTi15955和胭脂碱型农杆菌Tｉ质粒pTiC5８的ｖir区进行了全序列分析,在章鱼碱型Ti质粒的vir区发现了8个操纵子,分别为vｉｒA-vｊｒＨ,共包括23个基因(vｉｒＡ,virB１－virB11,virＣ1，viｒＣ2，virD１-ｖirD4,viｒE1,virE2,virF,viｒG,virH)．而胭脂碱型Tｉ质粒的vｉr区不含vjｒF和virH操纵子,它含有另一个基因tzs ,也有学者认为有大约35个vir基因成簇排布于ｖir区。
２转化过程
农杆菌介导的T-DNA的转移和整合是细菌和植物细胞相互作用发生生物学效应的过程,兼具原核生物中的细菌结合转移及真核细胞加工修饰的特点。其转化过程[6-８］如下：
２．1细菌在植物伤口处附着,使受伤的植物组织产生酚类化合物，诱导Ti质粒内viｒ基因的表达．
在植物受到创伤后,创伤组织的细胞释放出酚类化合物信号，如乙酰丁香酮（Ａs)。当农杆菌接受到此类信号时，其viｒ区基因可被诱导转录。另一类诱导化合物是组成植物细胞壁的一些特异单糖,As和单糖可协同诱导Ｔｉ质粒上vir区基因的表达。Viｒ区基因的活化首先是从vｉrA基因开始的。VirＡ蛋白是一种结合在膜上的化学受体蛋白,可直接对植物产生的酚类化合物感应,其感应部位可能位于胞质区域。VirA蛋白的胞质区域有自激酶的功能，自身被磷酸化激活后，使ViｒG蛋白活化。ＶirG蛋白是ＤNA结合活化蛋白,可以以二体或多体形式结合到vir启动子的特定区域，从而成为其它ｖir基因转录的激活因子，打开ＶirB、vｉrC、ｖiｒD、virE、virH等几个基因。virC、ｖiｒＤ、ｖirE参与Ｔ-ＤＮＡ复合体的形成和转移．ChvＥ可结合一些单糖,也可直接与VirＡ周质区相互作用，以加强As对Vir基因的诱导。
1.２发根农杆菌
发根农杆菌（Ａｇrobacteriuｍｒhizｏgｅnｅs）含有Ｒi质粒,能够诱导被侵染的植物细胞产生毛发状根。其侵染植物是将其Ｒi质粒上的T－DNA插入到宿主植物基因组中,这一点与Tｉ质粒相类似。转移机制也类似,所不同的是vir区和T－DNＡ区所含基因及其同源性不同。发根农杆菌由于宿主植物损伤部位产生的酚类化合物而附着在植物的细胞壁上,ｖiｒA的产物是一种跨膜蛋白,进一步激活virＧ的产物。T-DNA区的TL区具有较高的稳定性，TＲ区具有与生长素合成有关的基因tmｓl和tmｓ2及农杆碱或甘露碱合成基因。TR区可进行改造，这样Ri通过农杆菌细胞膜特定“孔道”进入宿主植物细胞核，进而使T-DNＡ整合到植物基因组中。