酶的定向进化方法
酶定向进化技术
酶定向进化技术1. 酶定向进化技术是一种通过人工控制酶的进化，使其在某些特定条件下表现出更高的催化活性和特异性的方法。
2. 在酶定向进化技术中，通过利用基因突变、重组等方法构建大量突变体库，然后在特定条件下筛选具有更高催化活性的突变体。
3. 酶定向进化技术的优点在于可以迅速地获得高效的酶催化体系，从而为化学制造和生命科学研究提供了强有力的工具。
4. 酶定向进化技术主要分为三个步骤：突变体库构建、筛选特异性突变体和进一步优化突变体。
5. 突变体库构建是酶定向进化技术的第一步，它通常通过基因突变或重组等方法构建，目的是产生大量具有不同变异的突变体。
6. 筛选特异性突变体是酶定向进化技术的第二步，它通常通过高通量筛选等方法，鉴定突变体的催化效率和特异性。
7. 进一步优化突变体是酶定向进化技术的最后一步，在此步骤中，通过多轮筛选和优化，获得具有更高活性和更好特异性的突变体。
8. 酶定向进化技术的应用非常广泛，可以用于生命科学研究和工业应用，如药物合成、环保和食品加工等。
9. 酶定向进化技术的成功需要一个高质量的突变体库，包括突变类型的多样性，覆盖面积的广度和深度以及可操作性的高效性。
10. 在酶定向进化技术中，通过融合多个酶的结构域，可以产生具有更高催化效率和特异性的新型酶。
11. 酶定向进化技术是一种可持续的策略，能够减少化学过程中的有害废物生成并提高反应选择性。
12. 在酶定向进化技术中，可以通过分析突变位点的二级结构和空间位阻来预测突变体的稳定性和催化效率。
13. 酶定向进化技术的关键是筛选合适的突变体，并对其结构进行深入的理解，从而在优化突变体的过程中提高筛选效率和提高酶的活性和特异性。
14. 酶定向进化技术的优化和改进取决于序列、结构和动力学等因素的综合作用，需要深入理解酶的结构和催化机制。
15. 酶定向进化技术的突变体需要在反应活性和稳定性之间寻求平衡，因此需要进行多轮的优化和筛选。
16. 酶定向进化技术可以应用于合成酶、流体催化、控制酶功能和抗体结构工程等方面。
酶定向进化 诺贝尔
酶定向进化与诺贝尔奖引言酶定向进化是一种通过人工选择和改造酶的方法，以达到特定的催化活性和特异性。
这一领域的研究为生物技术和医药领域带来了巨大的突破，因其重要性而获得了2018年度诺贝尔化学奖。
本文将详细介绍酶定向进化的原理、应用以及相关的诺贝尔奖背景。
酶定向进化原理酶是一类生物催化剂，能够加速特定化学反应的速率。
然而，自然界存在的酶并不能满足所有工业和医药领域对催化活性和特异性的要求。
因此，科学家开始尝试通过人工选择和改造酶来达到所需目标。
1. 随机突变随机突变是酶定向进化中最常用的方法之一。
科学家通过引入随机突变（如错误复制或DNA损伤）来产生大量具有不同特征的变异体。
2. 活性筛选在获得了大量变异体后，科学家需要进行筛选以找到具有所需催化活性的酶。
通常，这是通过将变异体与目标底物反应，并使用高通量筛选技术来检测产生的产物。
3. 逐步优化在第一轮筛选后，科学家通常会选择具有较高活性的变异体进行进一步改进。
这可以通过随机突变和筛选的多轮循环来实现，以逐步提高酶的催化效率和特异性。
酶定向进化的应用1. 生物燃料生产酶定向进化在生物燃料生产中发挥着重要作用。
通过改造酶，科学家们能够提高生物燃料的产量和质量。
例如，利用酶定向进化技术可以改良木质纤维素降解酶，从而提高生物质能源转化效率。
2. 药物合成药物合成过程中需要复杂的催化反应。
酶定向进化可以帮助科学家设计出更有效、特异性更好的催化剂，从而加速药物合成过程并提高产品纯度。
3. 环境保护酶定向进化还可以应用于环境保护领域。
通过改变酶的特异性，科学家们可以开发出对特定有害物质具有高效降解能力的酶。
这为环境污染物的清除提供了新的解决方案。
诺贝尔奖背景2018年度诺贝尔化学奖授予了三位科学家弗朗西斯·阿诺德、乔治·史密斯和格雷戈里·温特尔，以表彰他们在酶定向进化领域的杰出贡献。
弗朗西斯·阿诺德是第五位获得诺贝尔化学奖的女性科学家，她通过引入DNA重组技术来改造酶，并成功应用于生物燃料生产和药物合成等领域。
酶的定向进化
谢谢！
酶定向进化的基本过程 随机突变、构建突变基因、定向选择常用的随机突变方法
1 易错PCR技术（error-prone PCR ）
2 DNA重排技术（DNA shuffling）
交错延伸PCR技术(StEP)
随机引物体外重组技术(RPR)
3 基因家族重排技术(DNA family shuffling）
常用的高通量筛选技术 1 平板筛选法 2 荧光筛选法 3 噬菌体表面展示法 4 细胞表面展示法 5 核糖体表面展示法
实验 基于易错PCR的黄曲霉毒素解毒酶体外分子 定向进化 结果 突变酶A1773：耐高温70℃ 突变酶A1476：pH4.0稳定性 突变酶A2863：pH4.0和pH7.5稳定性
易错PCR技术
易错PCR反应体系（20 μL）: 10×PCR 缓冲液2μL dATP (10 mmol/L) 和dGTP (10 mmol/L) 各0.4 μ L ，dCTP (10 mmol/L) 和dTTP (10 mmol/L) 各2 μL 模板pKLAC1- adtz 0.2 μ L 上下游引物 (10 μmol/L) 各0.6 μ L MgCl2 (25 mmol/L) 4.4 μ L MnCl2 (2 mmol/L) 0 、0.8、2 、4 、6 、8 μ L Taq DNA 聚合酶0.2 μ L ddH2O 8、6 、4 、2 、NotⅠ 载体：大肠杆菌-酿酒酵母穿梭分泌表达载体 pYES2∕CT∕α-factor(简写为pYCα) 连接酶：T4DNA连接酶 宿主菌：大肠杆菌DH5α感受态细胞 酿酒酵母S.cerevis过氧化物酶（HRP）-隐性亮绿 （RBG）系统
酶的定向进化的方法
酶的定向进化的方法酶是生物体内一类重要的催化剂，可加速生物体内化学反应的速率。
然而，自然界中存在的酶并不能完全满足人类的需求，因此科学家研究出了一种方法，即酶的定向进化，通过改变酶的结构和功能，使其具有更广泛的应用价值。
酶的定向进化是一种通过人工手段，模拟自然界的进化过程，从而改变酶的特性和功能的方法。
这种方法通过遗传学和分子生物学的手段，使酶在短时间内经历大量的变异和选择，从而获得新的性状和功能。
酶的定向进化主要包括以下几个步骤。
首先，选择一个目标酶，确定欲改变的特性和功能。
然后，通过基因工程的手段，产生一系列具有随机变异的酶库。
接下来，利用高通量筛选技术，对酶库进行筛选，选择出具有目标特性和功能的酶。
最后，对筛选出的酶进行进一步的优化和改良，以获得更理想的酶。
酶的定向进化的关键在于变异和选择。
变异是指通过基因工程手段，对酶的基因进行随机的改变，从而改变酶的结构和功能。
变异可以通过多种方法实现，如DNA重组、突变和错配PCR等。
选择是指通过对酶的筛选和评价，选择具有目标特性和功能的酶。
选择可以通过高通量筛选技术和活性测定等方法实现。
酶的定向进化可以用于改变酶的催化活性、底物特异性、热稳定性、耐酸碱性等特性。
例如，科学家可以通过酶的定向进化，使其在高温环境下仍能保持稳定的催化活性，从而应用于工业生产中。
此外，酶的定向进化还可以改变酶的底物特异性，使其能催化更多种类的化学反应，从而实现新药物的合成和有机合成的高效转化。
酶的定向进化在生物技术和工业生产中具有广泛的应用前景。
通过酶的定向进化，科学家可以设计和合成出具有特定功能和特性的酶，用于生物催化、药物合成、环境修复等领域。
此外，酶的定向进化还可以用于改良已有酶的性能，提高其催化效率和稳定性。
然而，酶的定向进化也存在一些挑战和限制。
首先，酶的定向进化是一项复杂而耗时的过程，需要经过多个步骤和多轮筛选。
其次，酶的定向进化的成功率并不高，往往需要大量的实验和尝试。
酶体外定向进化技术及其发展
酶体外定向进化技术及其发展酶的定向进化是20世纪90年代初兴起的一种蛋白质工程的新策略，近年来发展迅速。
酶能催化各种各样的化学反应，可使需要几天几个月甚至几年时间完成的转化在几分钟甚至几秒钟内完成，能催化化学方法难以完成的反应，如构象的改变等。
同时，它无毒无害，对环境没有污染，在环境问题日益严重的今天，酶的应用显得至关重要。
1 概述酶的体外定向进化又称蛋白质分子定向进化，是蛋白质工程的新策略。
简单来说，就是在事先不了解酶的空间结构和催化机制的情况下，在实验室中通过模拟达尔文自然进化过程，让目标酶分子在预先设计好的道路上快速进化，获得有价值的非天然酶。
定向进化是随机突变和选择的结合，随机突变是人为控制某些条件改变而引发的。
后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起选择预期方向的突变、排除其他方向突变的作用，整个进化过程是在人为控制下进行的。
定向突变使在自然选择条件下需几百万年乃至上亿年才能完成的进化过程，缩短到几年、几个月，甚至更短的时间，加速了酶的进化过程。
目前，该方法主要应用于提高酶的稳定性、酶活性、对有机溶剂的耐受性，扩大底物的选择性，改变光学异构体的选择性等方面。
在目前已发现的8 000多种酶中，真正能够进行大规模生产和应用的商品酶并不多，主要原因是天然酶的性质与生产环境，例如高温、高压、有机溶剂、极端pH等的要求相差甚远。
天然酶的底物选择性等性质难以满足对蛋白酶的需求。
酶的定向进化技术是酶工程学研究的有效工具，该技术的发展使酶应用于工业生产成为可能。
2 酶体外定向进化的常用方法2.1 易错（error-prone）PCR易错PCR技术是指采用Taq酶进行PCR扩增目的基因时，通过调整反应条件，比如提高镁离子浓度、加入锰离子等方式改变体系中4种dNTP的浓度等，改变Taq酶的突变频率，从而向目的基因中引入随机突变构建出突变体库，并从中选择或筛选出所需要的突变体。
由于在实验中仅经过一次易错PCR扩增，所以往往很难得到所需的突变，由此而产生了连续易错PCR扩增技术，即一次PCR获得的扩增基因作为下一次的目的基因进行操作，连续多次进行上述PCR过程，直至获得突变显著的结果基因。
酶工程5 第八章_酶定向进化
Stemmer将DNA改组方法引用到酶分子定向进化中，
他用β内酰胺酶作为模型分子，对其正向突变库进行DNA改组，以逐 渐增加头孢氨00倍的突变体。
酶工程5 第八章_酶定向进化
主要内容
第一节 酶定向进化介绍 第二节 酶基因体外随机突变 第三节 酶突变基因的定向选择 第四节 酶分子定向进化的应用
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第一节 酶定向进化介绍
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获得具有新功能和特性的酶的途径 (1) 从大量未知的生物种系中寻找
(2) 改造现有已知的酶。
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定向进化研究的历史
1 萌芽阶段
首先在分子水平上进行改造单一分子的是Sol Spiegelman。在20世纪60年代,利用RNA噬菌体 Q进行的试验, 证明达尔文的自然选择也可在非细 胞体进行.
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2 奠基阶段
1981年，Hall B G等报道了他们定向改变了大肠杆 菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专一性，开发出对 几种糖苷键有水解能力的酶。
天然酶的作用
生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中， 并维持其独立性和生命的延续性，都是因为生物体内 的一系列酶在发挥着作用。
酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应得 以按照预定的方向有序、精确而顺利地进行，几乎所 有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关，可以这样 说，没有酶的存在，就没有生物体的一切生命活动。
HallB G等利用lacz缺陷型的菌株为宿主菌，分别在含有某种碳源的培养 基上培养．从酶的自发突变库中筛选出分别可以水解半乳糖、乳果糖、乳 糖酸的突变酶，而野生型的酶不能水解这些底物。
酶定向进化的原理和步骤
酶定向进化的原理和步骤
酶定向进化（enzyme directed evolution）是一种通过人为引
导的、基于自然选择原则的酶改造方法，可以用于提高酶的活性、稳
定性、底物范围等性质，以满足特定需要。
其原理和步骤如下：原理：
1. 酶定向进化是基于自然选择的原理。
通过引入随机突变和筛选操作，筛选出具有所需性质的变体酶，再通过重复这一过程，逐步改进和优
化酶的性能。
步骤：
1. 随机突变：通过诱发突变（例如随机突变、DNA Shuffling等）引
入酶的突变，得到一组具有多样性的突变体酶库。
2. 筛选/选优：通过选择性试剂、高通量筛选系统等手段，筛选
出表现出所需性质的突变体酶。
这一步骤需要对酶的目标特性进行准
确的定量、定性检测。
3. 特异突变体筛选：从筛选中得到的酶变体中，选出表现最佳
的数个突变体。
4. 突变组合：根据选出的突变体酶，通过多种方式（例如DNA Shuffling等）进行突变位点的组合，产生更多的突变体酶。
5. 筛选与优化：通过筛选和优化，选出具有更好性质的突变体酶。
6. 反馈循环：重复上述步骤，逐步优化酶的性质，直到满足所需。
总体来说，酶定向进化是通过不断引入突变和选择操作来改良酶
的性能，然后通过逐步筛选和优化的方式，在突变体酶库中逐渐筛选
出具有所需特性的酶。
第八章酶的定向进化
结果对单基因进化得到的突变酶中，对头孢羟羧氧胺的抗性最高的增加了8倍，而用家族同源重组进化的方法使抗性比其中两种微生物 来源的天然酶提高270倍，比段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱因与载体重组，再转入 适宜的细胞或包装成重组λ黏粒载体
➢ 转化 ➢ 噬菌粒载体
➢ 转导
2、突变基因的筛选 （1）定向选择环境条件的设定 （2）高通量筛选技术
定向进化的特点 ➢ 适应面广； ➢ 目的性强； ➢ 效果显著。
定向进化的原理 ➢ 以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突
变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化 酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。 ➢ 定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 ➢ 定向进化=随机突变+定向选择。
2、DNA重排技术为代表的有性进化 DNA重排技术：又称DNA改组技术，有性PCR片段，经过不加引物的 多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引 起基因突变的技术突变频率高，进化速度快。 ➢段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起 突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变 体。
定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。
改变四种底物浓度比等。
2、DNA重排技术为代表的有性进化 定义：将各种不同突变基因与载体重组，再转入适宜的细胞或包装成重组λ噬菌体的技术过程。 1、突变基因的构建 适用：较小基因的定向进化。
属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制。
酶分子的定向进化（directed evolution）：模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起
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摘要酶的体外定向进化是蛋白质工程的新策略. 不需事先了解酶的空间结构和催化机制, 而是通过模拟自然进化机制，以改进的诱变技术结合确定进化方向的选择方法，在体外改造酶基因，定向选择有价值的非天然酶. 短期内可以在试管中完成自然界需要几百万年的进化过程，因此可能是发现新型酶和新的生理生化反应的重要途径.关键词蛋白质工程模拟定向进化-------------------------------------------------------------理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件. 所谓酶的体外定向进化（directed evolution of enzyme in vitro）, 又称实验分子进化（experimentally molecular evolution）, 属于蛋白质的非合理设计（irrational design），它不需事先了解酶的空间结构和催化机制〔1〕，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制（随机突变、重组和自然选择），在体外改造酶基因, 并定向选择出所需性质的突变酶. 酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力.------------------------------------------------------------- 1 定向进化的原理在待进化酶基因的PCR扩增反应中, 利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的性质, 配合适当条件, 以很低的比率向目的基因中随机引入突变, 构建突变库, 凭借定向的选择方法, 选出所需性质的优化酶（或蛋白质）, 从而排除其他突变体. 定向进化的基本规则是,“获取你所筛选的突变体”〔2〕. 简言之, 定向进化=随机突变+选择. 与自然进化不同, 前者是人为引发的, 后者虽相当于环境, 但只作用于突变后的分子群, 起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的.------------------------------------------------------------- 2 随机突变的策略2.1 易错PCR易错PCR（error-prone PCR）〔3，4〕是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配, 导致目的基因随机突变. 然而，经一次突变的基因很难获得满意的结果，由此发展出连续易错PCR（sequential error-prone PCR ）策略. 即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板, 连续反复地进行随机诱变,使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变. Chen等人〔5，6〕用此策略使在非水相（二甲基甲酰铵, DMF）溶液中定向进化枯草杆菌蛋白酶E的活性获得成功，所得突变体PC3在60%和85%的DMF中, 催化效率kcat /Km分别是野生酶的256和131倍, 比活性提高了157倍. 将PC3再进行两个循环的定向进化〔2〕, 产生的突变体13M的kcat /Km比PC3高3倍(在60%DMF中), 比野生酶高471倍.在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部, 故属于无性进化（asexual evolution）. 它较为费力、耗时，一般适用于较小的基因片段（<800 bp）. 此外, 使用该方法易出现同型碱基转换.2.2 DNA改组和外显子改组DNA改组（DNA shuffling）〔7，8〕又称有性PCR(sexual PCR)，原理如图1所示. 该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会, 导致更大的变异, 最终获取最佳突变组合的酶. 在理论和实践上, 它都优于“重复寡核苷酸引导的诱变”和“连续易错PCR”. 通过DNA改组, 不仅可加速积累有益突变〔9〕, 而且可使酶的2个或更多的已优化性质合为一体〔10～15〕.外显子改组（exon shuffling）〔16，17〕类似于DNA改组，两者都是在各自含突变的片段间进行交换，前者尤其适用于真核生物. 在自然界中, 不同分子的内含子间发生同源重组, 导致不同外显子的结合, 是产生新蛋白质的有效途径之一. 与DNA改组不同,外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动, 而DNA改组不受任何限制, 发生在整个基因片段上. 外显子改组可用于获得各种大小的随机肽库.2.3 杂合酶杂合酶（hybrid enzyme）〔18〕是把来自不同酶分子中的结构单元（二级结构、三级结构、功能域）或整个酶分子进行组合或交换, 以产生具有所需性质的优化酶杂合体. 有许多途径可以产生杂合酶，如定位诱变、DNA改组、不同分子间交换功能域，甚至整个分子融合. 杂合酶可用于改变酶学或非酶学性质, 是了解酶的结构-功能关系、以及相关酶的结构特征的有力工具，不仅如此，它还可以扩大天然酶的潜在应用，甚至可以产生催化自然界不存在的反应的新酶分子. 杂合酶方法的有效性和实用性已得到了实验的证实〔19～25〕.2.4 体外随机引发重组体外随机引发重组（random\|priming \%in vitro\% recombination, RPR）〔26〕以单链DNA为模板, 配合一套随机序列引物, 先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段, 由于碱基的错配和错误引发, 这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中, 它们互为引物进行合成, 伴随组合, 再组装成完整的基因长度. 如果需要, 可反复进行上述过程,直到获得满意的进化酶性质（图2）.该法优于DNA改组法的特点在于：（1） RPR可以利用单链DNA为模板, 故可10～20倍地降低亲本DNA量; （2）在DNA改组中, 片段重新组装前必须彻底除去DNase Ⅰ, 故RPR方法更简单; （3）合成的随机引物具有同样长度, 无顺序倾向性. 在理论上，PCR扩增时模板上每个碱基都应被复制或以相似的频率发生突变; （4）随机引发的DNA合成不受DNA 模板长度的限制.2.5 交错延伸交错延伸（stagger extension process, StEP）〔27〕原理的核心是, 在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步, 并大大缩短其反应时间(55℃, 5 s), 从而只能合成出非常短的新生链, 经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸. 此过程反复进行, 直到产生完整的基因长度, 结果产生间隔的含不同模板序列的新生DNA 分子(图3).StEP法重组发生在单一试管中, 不需分离亲本DNA和产生的重组DNA. 它采用的是变换模板机制, 这正是逆转录病毒所采用的进化过程〔28〕. 该法简便且有效, 为酶的体外定向进化提供了又一强有力的工具.2.6 酶法体外随机-定位诱变为解决空间结构未知酶的蛋白质工程问题, 我们曾以类胰岛素样人参多肽基因和天冬氨酸酶基因为模型, 探索了一种酶体外诱变的新途径, 即酶法体外随机-定位诱变(random-site-directed mutagenesis)〔29～32〕. 该方法的内涵与酶的体外定向进化类似, 对目的基因既采用随机突变增加突变位点, 以快速产生优质酶,又让其突变受到一定限制, 以减少筛选突变体的工作量. 实际上, 该法也是体外模拟自然进化. 不同点在于，通过控制DNA合成的底物种类和浓度比例实现碱基对的错配.从上述策略不难看出,随着分子生物学技术的发展, 可以更灵活、快速和简便地改造目的基因. 从功能出发, 先获得某优化的突变体, 一方面可快速将其推向应用, 另一方面将对蛋白质的理论研究起到更大的推动作用.-------------------------------------------------------------图1 DNA改组原理图2 体外随机引发重组原理图3 交错延伸原理------------------------------------------------------------- 3 定向进化的选择策略尽管用上述方法可向人类提供新的有价值酶,但酶的功能突变常常被埋没在众多的中性突变和不利突变群中. 采用回交（back-crossing）法，将已进化的子代突变酶基因与野生酶基因重组〔33〕, 可排除这种干扰. 这样, 出现中性突变的频率只是50%, 可全部去除不利突变. 在定向进化中, 尽管突变具有随机性, 但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势, 加之控制实验条件, 限定突变种类, 降低突变率, 缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量, 更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度.通常, 筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关〔34，35〕. Venekei等人〔36〕报道了快速、有效地筛选蛋白水解酶突变体的方法和最佳筛选条件, 主要是利用蛋白酶选择平板初选, 再配合活性染色（activity staining）和X-光片消化分析（X-ray film digestion assay）加以验证, 并检测其活力, 快速筛选了44 000个突变株.Roberts等人〔37〕用嗜菌体表面呈现技术筛选与嗜中性酯酶结合力更强的抑制剂. 从含有4 900个突变体的基因库中，获得与该酶的结合能力高于野生蛋白质3.6×106倍的突变体, 比已报道的任何一个相应的抑制剂高50倍〔38〕.另有一些其他的筛选方法〔39，40〕, 如加入能产生可见光信号的底物〔17〕或利用绿色荧光蛋白的荧光性质〔41〕等. 总之, 选择在酶的体外定向进化中至关重要,直接关系到其成败.------------------------------------------------------------- 4 定向进化的优势、现状和未来较之蛋白质分子的合理设计, 酶的体外定向进化属于非合理设计（irrational design）. 其突出的优点是, 不需事先了解酶的空间结构和催化机制. 它适宜于任何蛋白质分子, 大大地拓宽了蛋白质工程学的研究和应用范围. 特别是它能够解决合理设计所不能解决的问题〔11，42～44〕，使我们能较快、较多地了解蛋白质结构与功能之间的关系，为指导应用（如药物设计等）奠定理论基础.此外,该技术简便、快速、耗资低且有实效. 总之, 酶的体外定向进化是非常有效的更接近于自然进化的蛋白质工程研究的新策略. 它不仅能使酶进化出非天然特性, 还能定向进化某一代谢途径; 不仅能进化出具有单一优良特性的酶, 还可能使已分别优化的酶的两个或多个特性叠加, 产生具有多项优化功能的酶，进而发展和丰富酶类资源; 完全在试管中进行的酶（或蛋白质）的体外定向进化使在自然界需要几百万年的进化过程缩短至几年〔10〕，这无疑是蛋白质工程技术发展的一大飞跃. 目前，对一些酶（或蛋白质）(表1）、砷酸盐解毒途径〔45〕、抗辐射性〔46〕、生物合成途径〔47〕、对映体选择性〔48〕、抗体库〔49〕以及DNA结合位点定向进化〔50〕的可喜成果令众多的相关科学家为之振奋. 可见, 进化能发生在自然界, 也能发生在试管中，它与合理设计互补, 将会使分子生物学家更加得心应手地设计和剪裁酶（或蛋白质）分子, 将使蛋白质工程学更加显示出强大的威力和诱人的前景.表1 酶的体外定向进化应用实例应强调的是, 为了提高酶体外定向进化的成功率, 需注意以下几个关键问题:（1）确定目的酶在所需功能方面的进化程度和潜力; （2）选择一个最接近人们需要的酶分子作为起点（包括用作下一循环的起始突变体），这涉及将酶引入单一的进化途径，如果选择失误, 便可能中途“夭折”; （3）若用于理论研究, 应控制较低的突变率，只有选择最佳进化策略，保证库中所有克隆只含有单一氨基酸取代(每代只有一个氨基酸变化), 那么从一代到另一代的功能变化便能与突变表型一一对应起来; （4）建立有效且灵敏的选择方法, 确保检测出由单一氨基酸取代而引起的功能变化.目前, 已建立了一些酶（或蛋白质）的体外定向进化的有效方法, 但还应探索扩展定向进化潜力的最佳途径和提高对突变的控制能力. 选择方法尚待开发与完善, 有必要发展小型化分析和高度自动化的大规模选择模式, 特别是对那些无明显可借鉴表型的突变体的选择, 可能是今后该领域科学家切实努力的目标.-------------------------------------------------------------。