核酸等温扩增杨银辉 ppt课件
五种出血热病毒重组酶聚合酶等温扩增方法的建立
五种出血热病毒重组酶聚合酶等温扩增方法的建立曹雪锋;康晓平;李裕昌;张森;户义;李靖;吴晓燕;杨银辉【摘要】目的建立五种出血热相关病毒,即扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒和黄热病毒的一步法重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术,为病原体的确定提供现场快速检测方法.方法通过基因组序列分析,选择每种病毒的特异核酸片段作为检测靶基因,针对靶基因序列设计RPA检测的引物和探针;取系列稀释的模板基因进行RPA检测,确定其灵敏性;取出血热相关病毒核酸为模板进行RPA检测,确定其特异性;验证不同温度反应条件(37~42℃)对检测结果的影响.结果五种出血热病毒的RPA反应体系均可有效扩增靶基因,灵敏性为1.5×102~1.5×103copies/反应,与其他出血热相关病毒的核酸无交叉反应;RPA实验在37~42℃均可实现靶基因的有效扩增.结论建立了五种出血热病毒的RPA等温扩增体系,该体系反应快速,温度范围宽,适用于现场快速检测.%Objective To establish a one-step recombinase polymerase amplification (RPA) method for pathogen screening and rapid detection in the field targeting for five hemorrhagic fever related viruses (Zaire ebola virus, Sudan ebola virus, Marburg virus, Lassa virus and Yellow fever virus). Methods The specific nucleic acid (NA) fragments of each virus were selected as target genes by genome sequence analysis, and the primers and probes for RPA assays were designed according to the sequence. A series of diluted template genes were used for RPA detection to determine the sensitivity. The hemorrhagic fever-related viral nucleic acids were used for RPA detection to determine the specificity. The amplification experiments were carried out at di fferent temperature ranging from 37℃ to 42℃ to validate thereaction temperature range. Results The RPA reaction systems of the five hemorrhagic fever viruses could effectively amplify the target genes, the sensitivities were between 1.5×102 and 1.5×103 co pies. No cross reactions existed with the other hemorrhagic fever-related viral genes. Meanwhile, RPA assay could effectively amplify the target genes at 37-42℃. Conclusion The isothermal RPA assays of five hemorrhagic fever viruses are established, which may amply target genes fast and react at a wide temperature range, and be potentially useful for in field pathogens detection.【期刊名称】《解放军医学杂志》【年(卷),期】2017(042)006【总页数】6页(P526-531)【关键词】重组酶聚合酶检测;等温扩增;出血热病毒【作者】曹雪锋;康晓平;李裕昌;张森;户义;李靖;吴晓燕;杨银辉【作者单位】230032 合肥安徽医科大学研究生学院;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室;230032 合肥安徽医科大学研究生学院;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R373.3埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)、马尔堡病毒(Marburg virus，MARV)、拉沙病毒(Lassa virus，LASV)和黄热病毒(yellow fever virus，YFV)均为烈性出血热病毒，主要流行于非洲，均可引起严重的出血热症状，感染率和致死率很高。
第九章 核酸等温扩增技术
品质量安全方面的第一部专门法律，该 法明确提出了转基因农产品标识制度， 对转基因农产品安全问题的重视可见一 斑。
• 早在 2001 年，我国就建立了转基因农产品 的标识制度。当年颁布的《农业转基因生 物安全管理条例》及其 2002 年的两部配套 规章《农业转基因生物标识管理办法》和 《农业转基因生物标识审查认可程序》对 这一制度作出了较为详细的规定。此外， 同年颁布的《进出境转基因产品检验检疫 管理办法》和 2002 年颁布的《转基因食品 卫生管理办法》也对这一制度作出了规定。
• B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由 B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。
扩增原理
• 60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间 温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状 态。因此，DNA在此温度下合成是可能 的。利用4种特异引物依靠一种高活性链 置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成 在不停地自我循环。
中国的转基因标识政策
• 根据《农业转基因生物安全管理条例》 和《农业转基因生物标识管理办法》规定， 中国采用有标识目录的定性强制性标识制 度。2002年公布的标识目录包括5大类17种。 表示方法分3种，包括“转基因xx”、“含 有转基因xx”、“由转基因xx原料加工， 但已不含有转基因成分”。关于阴性标识， 未作相关规定。
• 《进出境转基因产品检验检疫管理办法》 则规定了进出境转基因产品标识制度。
中国转基因标识现状及建议
现状：
我国的转基因标识制度目前还比较粗糙和单薄， 主要见于《农业转基因生物安全管理条例》及其 配套规章《农业转基因生物标识管理办法》和 《农业转基因生物标识审查认可程序》 。另外 《进出境转基因产品检验检疫管理办法》和《转 基因食品卫生管理办法》也对这一制度作出了规 定。这些法律规定仍有很多不足之处，不能适应 规制转基因生物安全的要求，也不能满足消费者 知情权的需要。
核酸检测课件ppt
02
核酸检测流程
样本采集
采集前准备
采集注意事项
确保采集人员经过专业培训，熟悉采 集流程和注意事项，准备好采集所需 物品，如一次性手套、口罩、采集管 等。
采集过程中要遵循无菌操作原则，避 免交叉感染；同时要安抚被采集者的 情绪，减轻其紧张和不适感。
采集方式
根据不同采集对象（如咽拭子、鼻拭 子、肛拭子等）和采集目的（如筛查 、确诊等），采用合适的采集方法， 确保采集到足够的样本。
样本运
运输容器
选择适当的运输容器，如 保温箱或冷藏袋等，确保 样本在运输过程中保持低
温或恒温状态。
运输时间
尽量缩短样本运输时间， 以确保样本的新鲜度和有
效性。
运输流程
核酸检测课件
CONTENTS
• 核酸检测简介 • 核酸检测流程 • 核酸检测的类型和应用 • 核酸检测的准确性和可靠性 • 核酸检测的未来发展
01
核酸检测简介
核酸检测的定义
01
核酸检测：指通过采集人体呼吸 道、血液、粪便等标本，检测其 中的病毒核酸，以确定人体是否 感染病毒。
02
核酸检测是当前检测病毒的主要 方法之一，特别是对于新型冠状 病毒等具有传染性的病毒。
提高核酸检测效率和准确性的方法
标准化操作流程
通过制定和执行标准化的操作流程，可以确保核酸检测结果的准确性和可靠性 。
质量控制
加强核酸检测的质量控制，包括试剂的稳定性、设备的校准和实验室的规范管 理，以提高检测结果的准确性。
谢谢您的聆听
THANKS
准确性的定义
核酸检测的准确性是指在检测过程中，能 够准确地检测出病毒或病原体的能力。
核酸扩增技术 ppt课件
低到48℃，每次降低1℃，每个退火温度循环两个周期，最后在 48℃退火温度下做15个循环。
热启动PCR（hot start PCR）
• PCR反应体系中先不加Taq DNA聚合酶，等PCR扩增仪的温度上
升到80℃以后再加Taq DNA聚合酶。
PCR技术发展简史
• Korana于1971年最早提出核酸
体外扩增的设想。
• 1985年Mullis等发明了具有划
时代意义的聚合酶链反应，使 用的DNA聚合酶是Klenow片段。
(1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR。 • 1988年Saiki 发现Taq DNA聚合酶，从此PCR技术得以
模板（template ）
• DNA
基因组DNA
• RNA：总R质N粒AD、NAmRNA、tRNA、
rRNA、 病毒RNA
引物（primers)
• 引物是人工合成的两段
寡核苷酸序列，一个引 物与感兴趣区域一端的 一条DNA模板链互补， 另一个引物与感兴趣区 域另一端的另一条DNA 模板链互补。
→ Sense primer
• 变性温度与时间 • 复性温度与时间 • 延伸温度与时间 • 循环数和扩增效率 • 降落PCR (Touchdown PCR) • 热启动PCR（hot start PCR）
降落 PCR(Touchdown PCR)
• 根据引物Tm值，选定一个退火温度范围（跨越10-20℃的温度范
围，引物Tm值在这个范围之内）。在设置循环参数时，让退火 温度从选定范围的最高温度开始，逐步降低退火温度（每次降低 1-5℃），最后结束在选定范围的最低温度。在每一个退火温度 上循环2-5次。
核酸扩增技术教学课件ppt
RT-PCR技术
总结词
转录、反转录、灵敏度高。
详细描述
RT-PCR技术是一种将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的方法，具有高 灵敏度、高特异性、简单易行等特点，常用于检测细胞中基因表达水平。
qPCR技术
总结词
定量、高灵敏度、实时监测。
详细描述
qPCR技术即实时荧光定量PCR技术，是一种对特定DNA片段进行实时定量检测 的方法，具有高灵敏度、高特异性、可实时监测等特点，已广泛应用于基因表达 分析、病原体检测等领域。
详细介绍qPCR反应所需的各个组分及其作用，如 模板DNA、引物、dNTPs、DNA聚合酶、荧光染 料或探针等。
qPCR数据分析
介绍qPCR实验数据应该如何进行分析，包括扩增 曲线和熔解曲线的绘制和分析，以及Ct值的计算 和应用。
04
核酸扩增技术的数据分析与解读
数据分析方法与技巧
描述性统计分析
对实验数据进行描述性统计，如均 值、标准差等，以了解数据的集中 趋势和离散程度。
通过检测特定基因的扩增或缺失，对疾病进 行诊断和预测。
生物制药
进化研究
利用核酸扩增技术生产重组蛋白、抗体等生 物药物，用于治疗和预防疾病。
研究物种间的基因序列差异，揭示物种进化 的历史和机制。
误差分析与质量控制
01
误差来源
分析核酸扩增技术的误差来源，如试剂质量、操作流程、仪器设备等
。
02
质量控制
制定质量控制标准，如重复实验、阳性对照等，以确保实验结果的准
2023
《核酸扩增技术教学课件 ppt》
目 录
Байду номын сангаас
• 核酸扩增技术概述 • 核酸扩增技术的种类与特点 • 核酸扩增技术实验方案与步骤 • 核酸扩增技术的数据分析与解读 • 核酸扩增技术的优化与改进建议 • 核酸扩增技术的未来发展趋势与展望
环介导等温扩增技术原理课堂PPT
基 础 结 构
13
LAMP
环介导的等温扩增技术原理
14
环介导等温扩增过程演示
15
反应时间对LAMP的影响
Effect of reaction time on the LAMP nes1,D NA marker(DL2000) with2000,1000,750 ,500,250 and 100bP:lanes2一 5,LAMP amPlification Produets for 15 min,30min,45min,6 0min,respectively :lane6,without DNA template in the reaction. 乔岩梅. 炭疽芽孢杆菌特征基因恒温扩增检测方法的研究[D]. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所） 2007
4
各类等温扩增技术的比较
温度 ℃ 引物
模板
NASBA 42
需要2条 RNA
SPIA 42
1条
RNA
HDA
37/65 需要2条 DNA
SDA LAMP RCA Qβ
37/65 63 37-65 37
不需要 4条 需要 不需要
DNA DNA DNA RNA
其他 反转录酶，RNA酶 H，T7RNA聚合酶 反转录酶，T7RNA 聚合酶 解旋酶，扩增片段 小
F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组 成，并与靶基因的F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C 和B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1C域与 靶基因5’端的Blc区域序列相同。
7
环介导等温扩增原理
详解核酸等温扩增技术
详解核酸等温扩增技术近年新发展起来的核酸等温扩增技术，无论是在实际操作还是仪器要求方面，都比PCR 技术更为简单方便，它摆脱了对精良设备的依赖，在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景。
在众多等温扩增技术中，环介导等温扩增目前已在一定范围内得到了应用，其他一些新发展起来的等温扩增技术，如链替代等温扩增、滚环等温扩增、依赖解旋酶等温扩增、依赖核酸序列等温扩增、单引物等温扩增和核酸快速等温检测放大等技术，也在不断发展与完善之中。
为了更好地有选择地开发利用这方面技术，现就这些等温扩增技术的原理、特点及应用进行简要总结。
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP )环介导等温扩增(LAMP)是Notomi等于2000年首先提出来的一种新的核酸扩增技术，其原理主要是基于靶基因3'和5'端的6个区域设计3对特异性引物，包括1对外引物、1对环状引物和1对内引物，3种特异引物依靠链置换BstDNA聚合酶，使得链置换DNA合成不停地自我循环，从而实现快速扩增。
反应1h后可根据扩增副产物焦磷酸镁沉淀形成的浊度或者荧光染料进行判断扩增情况。
此反应先形成哑铃状模板，进入循环扩增阶段，再进行伸长、循环扩增，共3个阶段。
Loop-mediated isothermal amplification(LAMP，Fig1)依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)依赖核酸序列的扩增技术 (NASBA) 是 1991 年由加拿大 Can －gene 公司首次介绍。
它是一项以核酸序列中RNA为模板，由两个引物介导的、连续均一的特异性体外等温扩增核苷酸序列的酶促过程。
整个反应由非循环相和循环相组成: 首先进行非循环相，在AMV 逆转录酶的作用下，引物I 与模板RNA 退火后合成cDNA，形成RNA/DNA 杂合体，随即RNaseH 降解 RNA，引物Ⅱ与 cDNA 退火，合成第二条 DNA 互补链。
核酸等温扩增ppt课件
• 产物相当复杂，无法进行后续的回收、鉴定、克 隆等基因工程操作。
17
18
19
20
21
22
NASBA的优缺点
NASBA 是种 RNA 扩增法，因此其主要应用 是对 RNA 病毒的检测。
整个反应能在 42℃条件下进行，经过两个 小时的扩增可将模板 RNA放大至 109~1010 倍。
近年来，各国学者陆续利用RPA技术，对于DNA病毒、细菌等 进行核酸检测。
37
RPA的原理
38
四氢呋喃非碱基位点类似物
tetrahydrofuran abasic–site mimic (THF)
39
40
结果观察：
Basic RPA
lateral-flow strip
exo RPA
41
引物、探针设计
10
LAMP的操作过程
11
检测方法
12
LAMP技术在病原体检测中的应 用
13
14
LAMP技术小结
15
LAMP技术的优点
16
存在缺陷
• 所识别的靶位序列长度不得过大，一般在300 bp 以内。因此，无法进行长片段 DNA 的扩增；
• LAMP 技术具备高灵敏度，对操作要求严格分区， 否则极易受到污染而产生假阳性结果；
26
SAT技术的原理
SAT技术（Simultaneous Amplification and Testing）是基于TMA （Transcription mediated amplification）恒温扩增技术发展起来的一项最新 核酸检测技术，是国内企业自主研发的专利技术
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
LAMP的操作过程
检测方法
LAMP技术在病原体检测中的应用
LAMP技术小结
LAMP技术的优点
存在缺陷
• 所识别的靶位序列长度不得过大，一般在300 bp 以内。因此，无法进行长片段 DNA 的扩增；
• LAMP 技术具备高灵敏度，对操作要求严格分区， 否则极易受到污染而产生假阳性结果；
RPA技术
RPA技术简介
RPA（recombinase polymerase amplification）技术，2006年由剑 桥大学的Olaf Piepenburg等人建立。
该技术利用一种重组酶使单链引物与双链DNA模板中互补片段结 合，启动DNA复制；不需要DNA解链过程。
其具有便携，免去PCR仪等大型实验室设备的使用；快速，20分 钟内得到检测结果；灵敏度高，几个拷贝即可检出；便于保藏， 采用冻干粉末状酶等优点。
• 灵敏度高、特异性强、保真度高。
• 反应成分复杂、需要三种酶导致成本偏高、须重 复加入逆转录酶和 T7 RNA 聚合酶。
滚环放大(rolling circle amplification, RCA)技
术
• 基于滚环只有在单链闭合状态并有相应引物存在下才能同 温滚动复制的原理。
• 基于连接酶连接、引物延伸与链置换扩增反应的一种等温 核酸扩增方法。在恒温的条件下,可以产生大量的与环型 探针互补的重复序列。
• 严格专利保护 • 反应成分复杂 • 对临床标本的检测效果较差
近年来，各国学者陆续利用RPA技术，对于DNA病毒、细菌等进 行核酸检测。
RPA的原理
四氢呋喃非碱基位点类似物
tetrahydrofuran abasic–site mimic (THF)
结果观察：
Basic RPA
lateral-flow strip
exo RPA
引物、探针设计
RPA技术的缺点
• RCA反应体系组成： 噬菌体 φ29DNA 聚合酶、单链环状 DNA 模板和引物
（一条或一对也可多条）。
噬菌体 φ29 DNA 聚合酶具备很强的链置换活性，无需模 板分离，酶性稳定，可连续数小时高效催化合成 DNA。
RCA的扩增原理
SAT技术
• 实时荧光核酸恒温扩增检测技术（Simultaneous Amplification and Testing，简称SAT）是将新一代的核 酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型低污染、 反应稳定等优点。
核酸等温扩增技术在病毒 检测中的应用
军事医学科学院微生物流行病研究所 杨银辉
核酸等温扩增技术
核酸等温扩增的优势
核酸等温扩增的种类
环介导核酸等温扩增技术（LAMP）
LAMP引物设计原则
LAMP扩增引物设计
LAMP扩增过程
环引物在茎环结构环状结构处识别并不断延伸， 使双链过早打开，有利于复杂茎环结构的成环和 外引物置换作用。这一定程度上加速了整个 LAMP 扩增循环阶段的反应。
• 同一温度下，首先通过M-MLV反转录酶产生靶标核酸（RNA ）的一个双链DNA拷贝，然后利用T7 RNA多聚酶从该DNA拷 贝上产生多个（100～1000个）RNA拷贝；每一个RNA拷贝 再从反转录开始进入下一个扩增循环；同时，带有荧光标 记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信 号可由荧光检测仪器实时捕获，实时反映扩增循环情况。
• LAMP 的反应结果只有两种即扩增与不扩增，故在 产生非特异性扩增时是难以进行后续鉴定的；
• 产物相当复杂，无法进行后续的回收、鉴定、克隆 等基因工程操作。
NASBA的优缺点
• NASBA 是种 RNA 扩增法，因此其主要应用是对 RNA 病毒的检测。
• 整个反应能在 42℃条件下进行，经过两个小时的 扩增可将模板 RNA放大至 109~1010倍。
SAT技术的原理
SAT技术（Simultaneous Amplification and Testing）是基于TMA （Transcription mediated amplification）恒温扩增技术发展起来的一项最新 核酸检测技术，是国内企业自主研发的专利技术
SAT技术的优势
• 针对靶标核酸特异设计的引物和分子信标，实现特异性的 扩增和检测，有效防止假阴性结果。
• • SAT检测的靶标核酸是RNA，而RNA在病原体外的环境中易
降解，检测结果可作为区分死菌、活菌的依据，因此更利 于用药之后疗效的监测和判愈。
• • SAT技术的高灵敏度、高特异性则可以最大程度地确保检
测结果的高度准确，高度可靠，有效避免假阳性、假阴性 结果。
IMSA扩增
IMSA扩增的原理
IMSA扩增的原理
IMSA扩增的优点
• IMSA 不仅拥有 LAMP 检测技术类似的应用优点， 在引物设计和扩增原理上还具有其独有的特点， 使得其具备比 LAMP 更高检测灵敏度的潜力。
• 该技术一定程度上能打破日本 LAMP 专利在我国 的应用限制，使其更好地服务于我国的传染病防 控、食品安全检测和环境物种保护等各个领域。