生物工程下游技术
生物工程下游技术
d. 对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应 加入还原剂（如DTT、GSH、β-ME）打开蛋 白质中所有二硫键，对于没有二硫键的目 标蛋白有时也应使用还原剂，因为含二硫 键的杂蛋白会影响包涵体的溶解。 e. 同时还应加入金属螯合剂，如EDTA或 EGTA，用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子以 防止其与还原状态的巯基发生氧化反应。
优点： ① 一定的选择性； ② 细胞外形完整，核酸释放少，有利于进一 步分离过程 缺点：（只能用于实验室） ① 产物抑制造成效率低下； ② 溶酶价格高； ③ 通用性差， 不易确定最佳条件；
6、微波加热法
• 机理：微波加热导致细胞内极
性物质，尤其是水分子吸收微波 能，产生大量热量，使胞内温度 迅速上升，液态水汽化产生的压 力将细胞膜和细胞壁冲裂，形成 微小孔洞，进一步加热可导致细 胞内部和细胞壁水分减少，细胞 收缩，表面出现裂纹。
缺点：复性活性回收率低，而且难与杂蛋白分
离。稀释法大大增加溶液体积，不利于后续的
分离纯化，且处理量太大，不利于工业放大 ；
透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体； 超滤法在膜上聚集变性，易造成膜污染。
2、高蛋白浓度下的复性方法：
（一个成功的复性过程在于能够在高蛋白浓度下仍
能得到较高的复性率。）
①缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到 复性缓冲液中,使得蛋白质在加入过程中或 加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性。 因为完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠 的蛋白一起聚集。
团状、丝状真菌、 几乎所有的微生物 较小革兰阳性菌不 细胞，包括含有包 宜，包含体不宜 含体的基因工程菌 的破壁
X-Press挤压机，把浓缩的细胞悬液冷却 至-25～-30℃，形成冰晶，用500MPa以上
生物工程下游技术
⽣物⼯程下游技术⽣物⼯程下游技术⽣物⼯程下游技术的定义指从动植物与微⽣物的有机体或器官、⽣物⼯程产物（发酵液、培养液）及其⽣物化学产品中提取、分离、纯化有⽤物质的技术过程。
实质：是研究如何从混合物中把⼀种或⼏种物质分离出来的科学技术。
1.⽣化⼯程分离技术预处理结晶⼲燥离⼼法：离⼼过滤、离⼼沉降、超离⼼萃取法：有机溶剂、双⽔相、液膜、反胶团、超临界层析法：凝胶过滤层析、反相层析、亲和、疏⽔相互作⽤、聚焦、离⼦交换膜分离：微滤、超滤、反渗透、透析、电渗透2.⽣物物质常⽤的分离技术氨基酸：结晶和离⼦交换法蛋⽩质和多肽：离⼦交换层析、电泳糖类：吸附层析脂质：有机溶剂萃取、超临界流体萃取和层析抗⽣素：有机溶剂萃取、离⼦交换、结晶和吸附层析3. ⽣物分离⽅法的选择与评价原则：步聚少，次序合理，产品规格（注射，⾮注射），⽣产规模，物料组成，产品形式，产品稳定性，危害性，物性：溶解度、电荷、分⼦⼤⼩、功能团、稳定性、挥发性，废⽔处理4.浓缩率：浓缩程度⼀般⽤浓缩率(concentration factor)表达，是⼀个以浓缩为⽬的的分离过程的最重要指标。
浓缩率为m，mt=mx则⽬标产物未得到任何程度的分离纯化。
5.分离因⼦：分离因⼦⼜称分离系数。
产品中⽬标产物浓度越⾼，杂质浓度越低，则分离因⼦越⼤，分离效率越⾼。
6. 回收率：⽆论是以浓缩还是以分离为⽬的操作过程，⽬标产物均应以较⼤的⽐例回收, 回收率R：⽣物分离操作多为间歇过程（分批操作），若原料液和产品溶液的体积分别为VC和VP。
1 ⽣物产品与普通化⼯产品分离过程有何不同？2 设计⽣物产品的分离⼯艺应考虑哪些因素？3 分离纯化的回收率与浓缩率如何计算？4 现代⽣物分离⼯程研究⽅向有哪些特点？5 分离纯化指标有哪些?简述pH对发酵液过滤特性的影响，并举例说明。
答：（1） pH直接影响发酵液中某些物质的电离程度和电荷性质，因此适当调节pH值可以改善发酵液的过滤特性。
生物工程下游技术 PPT课件
/science/journal/1369703X
• Separation and Purification Technology
/science/journal/13835866
• Journal of Membrane Science
/science/journal/03767388
References-SCI journals
• Enzyme and Microbial Technology
/science/journal/01410229
• Journal of Chemical Technology and Biotechnology
/jpages/0268-2575
References-SCI journals
• Separation and Purification Reviews
• P. A. Belter, E. L. Cussler, W. Hu. Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology. New York: John Wiley & Sons, 1988
• D. Forciniti. Industrial Bioseparations: Principles and Practice. Iowa: WileyBlackwell, 2008
考核方式
• 根据课程基本要求，结合平时成绩、课程论文及 笔试（期末考试）三方面进行综合评定。
• 平时成绩20％ • 课程论文20％ • 期末考试60％
主要内容
1. 绪论 2. 下游技术理论基础 3. 发酵液预处理与细胞破碎 4. 沉淀 5. 萃取分离 6. 膜分离 7. 吸附与离子交换 8. 色谱分离 9. 亲和色谱
生物工程下游技术
生物工程下游技术生物工程下游技术生物工程下游技术的定义指从动植物与微生物的有机体或器官、生物工程产物（发酵液、培养液）及其生物化学产品中提取、分离、纯化有用物质的技术过程。
实质：是研究如何从混合物中把一种或几种物质分离出来的科学技术。
1.生化工程分离技术预处理结晶干燥离心法：离心过滤、离心沉降、超离心萃取法：有机溶剂、双水相、液膜、反胶团、超临界层析法：凝胶过滤层析、反相层析、亲和、疏水相互作用、聚焦、离子交换膜分离：微滤、超滤、反渗透、透析、电渗透2.生物物质常用的分离技术氨基酸：结晶和离子交换法蛋白质和多肽：离子交换层析、电泳糖类：吸附层析脂质：有机溶剂萃取、超临界流体萃取和层析抗生素：有机溶剂萃取、离子交换、结晶和吸附层析3. 生物分离方法的选择与评价原则：步聚少，次序合理，产品规格（注射，非注射），生产规模，物料组成，产品形式，产品稳定性，危害性，物性：溶解度、电荷、分子大小、功能团、稳定性、挥发性，废水处理4.浓缩率：浓缩程度一般用浓缩率(concentration factor)表达，是一个以浓缩为目的的分离过程的最重要指标。
浓缩率为m，mt=mx则目标产物未得到任何程度的分离纯化。
5.分离因子：分离因子又称分离系数。
产品中目标产物浓度越高，杂质浓度越低，则分离因子越大，分离效率越高。
6. 回收率：无论是以浓缩还是以分离为目的操作过程，目标产物均应以较大的比例回收, 回收率R：生物分离操作多为间歇过程（分批操作），若原料液和产品溶液的体积分别为VC和VP。
1 生物产品与普通化工产品分离过程有何不同？2 设计生物产品的分离工艺应考虑哪些因素？3 分离纯化的回收率与浓缩率如何计算？4 现代生物分离工程研究方向有哪些特点？5 分离纯化指标有哪些?简述pH对发酵液过滤特性的影响，并举例说明。
答：（1） pH直接影响发酵液中某些物质的电离程度和电荷性质，因此适当调节pH值可以改善发酵液的过滤特性。
生物工程下游知识点总结
生物工程下游知识点总结一.名词解释1.清洁生产（cleaner production）：是指将综合预防的环境保护策略持续应用于生产过程和产品中，以期减少对人类和环境的风险。
它包括三个方面的内容，即清洁生产工艺（技术）、清洁产品、清洁能源。
2.凝聚作用：向胶体悬浮液中加入某种电解质，在电解质中异电离子作用下，胶粒的双电层电位降低，使胶体体系不稳定，胶体粒子间因相互碰撞而产生凝集的现象。
3.絮凝作用：絮凝剂通过静电引力范德华力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。
当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架联接时，就形成了较大的絮团。
4.下游工程（下游技术，下游加工过程，downstream processing）:对于由自然界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术5.协萃:两种或两种以上的萃取剂同时萃取某一溶质或其它化合物时，萃取性能优于它们各自萃取性能之和的效应。
6.萃取因数:萃取平衡后，溶质在萃取相与萃余相中数量（质量或物质的量）的比值。
（E=DR）7.带溶剂：在纯气体溶剂中，加入被萃取物亲和力强的组分以提高其对被萃取组分的选择性和溶解度的一类物质。
8.离子交换带:溶液的组成和树脂的组成达到平衡时所对应的树脂层的高度。
9.反胶团（reversed micelles）:两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水基团自发地向内聚集而成，内含微小水滴的，空间尺度仅为纳米级的集合性胶体。
10.浓差极化:当溶剂透过膜而溶质留在膜上因而使膜面浓度增大，并高于主体浓度的现象。
（指在分离过程中，料液中的溶剂在压力驱动下透过膜，溶质被截留，于是在膜表面与临近膜面区域浓度越来越高。
在浓度梯度作用下，溶质由膜面向本体溶液扩散，形成边界层，使流体阻力与局部渗透压增加，从而导致溶剂透过量下降。
生物工程下游技术
生物工程下游技术第五章1、目标产物分离基本的两个阶段：产物的初级分离和产物的纯化精制阶段。
（1）初级分离：位于生物反应之后，其任务是分离细胞和培养液，破碎细胞释放产物，溶解包涵体，复原蛋白质，浓缩产物和去除大部分杂物等。
（2）纯化精制：在初级分离的基础上，用各种高选择手段（主要是各种色谱层析）将目标产物和干扰杂物尽可能的分离开，达到产物的高纯度，最后储藏运输和使用产品。
（1）机械破碎（高压匀浆、高速研磨）—离心法提取包含体—加变性剂溶解—除变性剂复性特点：利用了包含体与细胞碎片的密度差，离心法可获得干净的包含体，再对其复性。
这样首先摆脱了大量的杂质，使后面的分离纯化简单了，缺点是需要经过几次离心，加工时间较长（2）机械破碎—膜分离除可溶性蛋白—变性剂溶解包含体—除变性剂复性特点：应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质，但细胞碎片与包含体一起被膜挡住，难以分开，其次膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白的滞留，优点是封闭式操作，不污染环境也不受污染，能量也消耗少（3）化学破碎（加变性剂）—离心除细胞碎片—除变性剂复性特点：化学法破菌，试剂既可以破菌又可以溶解包含体，这样节约了时间和设备，缺点是所有的可溶性杂质都没有被除去，混杂在产物中间，给后面的分离带来困难。
第六章1、膜分离技术：是用半透膜作为选择障碍层，允许某些组分透过而保留混合物中其他组分从而达到分离目的技术。
优点：1）处理效率高，设备易于放大2)可在室温或低温下操作，适宜于热敏感物质分离浓缩3）化学与机械强度小，减少失活4）无相转变，省能5）有相当好选择性，可在分离、浓缩的同时达到部分纯化目的6）选择合适膜与操作参数，可得到较高回收率7）系统封闭循环，防止外来污染8）不外加化学物，减少了成本，也减少了对环境的污染2、膜的清洗：物理方法和化学方法。
物理方法一般是指用高速水冲洗，海绵球机械擦洗和反洗等，他们的特点是简单易行。
化学清洗通常是用化学清洗剂，如碱、酸、酶表面活性剂、络合剂和氧化剂等。
生物工程下游技术作业及答案[终稿]
生物工程下游技术作业及答案第三章1 凝聚:是指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象。
2 絮凝：是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成絮凝团的过程。
3 为有利于发酵液过滤可采用哪些方法来改变发酵液过滤特性？其简要机理如何？答：可通过以下几个方式：（1）降低液体粘度(加水稀释法和加热法)；（2）调节pH；（3）凝聚与絮凝；（4）加入助滤剂；（5）加入反应剂。
4 杂蛋白是发酵液中主要杂质，常用的除去方法有哪些？答：沉淀法；变性法；吸附法。
第四章1 细胞破碎：是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。
2 细胞破碎有哪些方法？简述他们的基本原理。
答：固体剪切法；液体剪切法；超声波法；其他方法。
3 高压匀浆法与球磨法比较？答：1、高压匀浆法操作参数少，易于确定，适于大规模操作，而球磨法操作参数多，一般凭经验估计，在大规模操作中，夹套冷却控温难度较大。
2、球磨机连续操作时兼具破碎和冷却双重功能，减少了产物失活的可能性，而高压匀浆机需配备换热器进行级间冷却。
3、球磨法破碎在适当条件下一次操作即可达到较高的破损率，而高压匀浆法往往需循环2-4次才行。
4、球磨机适合于各种微生物细胞的破碎，而高压匀浆机不适合丝状真菌及含有包含体的基因工程菌。
第六章1浓差极化：是指当溶剂透过膜，而溶质留在膜上，因而使膜面浓度增大，并高于主体中浓度的现象。
2 膜的污染：随着操作时间的增加，膜透过流速的迅速下降，溶质的截留率也明显下降，这一现象被称为膜的污染。
3 简要说明各种膜（超滤膜、微孔过滤膜和纳米过滤膜）的特点及用途？答：超滤膜：能截留相对分子质量500以上的高分子的膜，应用于大分子产品，主要是酶及蛋白类产品。
微孔过滤膜：主要用于分离流体中尺寸为0.1-10µm的微生物和微粒子，以达到净化、分离和浓缩的目的。
主要用于无菌液体的生产，反渗透及超过滤的前处理。
生物工程下游技术简答题
答案仅供参考1.从生物工程概念及学科分支着手，分析生物工程下游技术的概念。
生物工程是分子遗传学、微生物学、细胞生物学、生物化学、化学工程和能源学等各学科的结合，应用于医药、食品、农林、园艺、化工、冶金、采油、发酵罐新技术和新底物的环保等方面的工程技术；生物工程下游技术就是研究，应用和设计生物产品的提取、分离、纯化、精制及加工工艺，使其变为产品的一门学科。
2.谈谈生物工程下游技术课程主要研究哪些问题？在整个生物工程技术领域的地位如何？有何作用？研究生物工程产品的提取、分离、纯化、精制加工等技术的基本原理和方法。
下游技术是生物制品产业化的必经之路和关键所在，直接影响产品的质量和成本。
作用是可以培养对生物产品的分离，纯化技术的掌控和应用能力，以及对生物物质提纯最佳方案的设计能力。
3.生物工程下游技术处理对象有哪些特点？目标物质浓度低、组分复杂、产物稳定性差、质量要求高（纯度、卫生和生物活性）4.原料中目的物的浓度与产品价格是否有关联？目的物浓度越低，产品的价格就越高5.提取步骤数及各步收率对总收率有何影响？提取步骤数越多，最终的总收率就越低6.通过查阅资料，介绍生物工程发展史。
第一阶段：古代酿造业，不存在下游技术一说，主要产品是酒、酱油、醋之类的发酵产品。
第二阶段：近代酿造业，可以进行过滤、蒸馏、精馏等简单的单元操作，主要产品是丙酮、丁醇等无活性的小分子物质。
第三阶段：可以进行目前大部分的化工单元操作，主要产品是抗生素、多糖、蛋白质等具有一定生物活性的大分子物质。
第四阶段：现代生物工业，可以进行各种新型分离技术（色谱、萃取等），主要产品是基因工程的高附加值产品。
7.介绍生物下游技术的一般流程，划分依据是什么？1.预处理（固体细胞与液体发酵液）2.提取（初步分离）3.精制（高度纯化）4.成品制作（最后加工，层析、电泳等）划分依据一般是分离产物的物相，分离物的大小，难度，方法等。
8.生物下游分离与化工分离有何区别？生物下游分离常无固定操作方法可循，生物材料组成非常复杂，分离操作步骤多，不易获得高收率，培养液（或发酵液）中所含目的物浓度很低，而杂质含量却很高，分离进程必须保护化合物的生理活性，生物活性成分离开生物体后，易变性、破坏，基因工程产品，一般要求在密封环境下操作。
生物工程下游技术
5.
基因工程产品，生物安全(biosafety)问题
即要停止菌体扩散。
10
13· 4 生物技术下游加工过程的一般 流程和单元操作
13.4.1 —般工艺流程
1. 2. 3. 4.
培养液(发酵液)预
处理和固液分离
初步纯化(提取)； 高度纯化(精制); 成品加工。 工艺过程决定于产
品的性质和要求达
到的纯度。
生物工艺学
第十三 章
生物工艺下游加工过程概论
1
主要内容
下游加工过程在生物技术中的地位
传统生化产品和基因工程产品回收方法的比较
生物技术下游加工过程的特点
生物技术下游加工过程的一般流程和单元操作 生物技术下游加工过程的发展趋向
2
13.1 下游加工过程在生物技术中的地位
下游加工过程：生物化工产品系通过微生物发酵
过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得。 从上述发酵液、反应液或培养液中分离、精制有 关产品的过程称为下游加工过程(Down stream processing)。
化学工程的单元操作，但生物物质的特性有其特 殊要求
3
下游加工过程在生物技术中的地位
发酵生产中，分离和精制过程所需费用占成本很大部分。
杂质：当进行转移时，杂质不能或较少地随着转移，因而 能达到浓缩和提纯的目的。 二次萃取：有时一次转移并不能将杂质充分除去，例如红 霉素提炼采用二次萃取。
22
反应萃取法(Reactive extraction)
溶剂萃取法常遇到困难是分 配系数较低。
一种解决的方法是利用反应 萃取法(Reactive extraction) ， 即利用一种溶剂(通常是有机 磷化合物或脂肪胺)，能按一 定化学计量关系与生物物质 形成特异性的溶剂化键或离 子对化合物。
生物工程下游技术 重点
一、绪论1.生物下游加工过程的几个阶段：①预处理和固液分离；主要技术：过滤和离心②提取（初步分离）；目的：除去与产物性质差异较大的杂质，为后道精制工序创造有利条件；技术：盐析法、有机溶剂沉淀、化学沉淀、大孔吸附树剂、膜分离技术③精制（高度纯化）；目的：除去与产物性质差异较小的杂质；技术：色谱分离技术、结晶、重结晶④成品制作；喷雾干燥，气流干燥，沸腾干燥，冷冻干燥，结晶2.评价分离效果的重要参数浓缩率（m）；回收率；纯度二、发酵液预处理和固液分离名解：凝聚：指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象。
絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。
1.改变发酵液过滤特征的方法物理化学方法：调酸（等电点）、热处理、电解质处理、添加絮凝剂、添加表面活性物质、添加反应剂、冷冻—解冻、添加助滤剂（——降低液体粘度（加热法、加水稀释法），调整PH，凝聚与絮凝，加入助滤剂，加入反应剂）2.发酵液的相对纯化⑴高价无机离子的除去方法①Ca2+—草酸、草酸钠，形成草酸钙沉淀（回收草酸）②Mg2+—三聚磷酸钠，形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物③Fe2+—黄血盐，普鲁士兰沉淀⑵杂蛋白的去除方法①沉淀法：酸碱调节，使蛋白质与盐或离子形成沉淀。
②变性法：加热；大幅度调节PH值；加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。
③吸附法：吸附剂或沉淀剂吸附除去杂蛋白—活性炭、硅胶、氧化铝3．常用固液分离的方法⑴离心：在液相非均一系统中，利用离心力达到液－液、液－固、液－液－固分离的方法，统称为离心分离。
离心机种类：碟片式离心机、管式离心机、倾析式离心机⑵过滤：根据过滤机理，过滤操作可分为澄清过滤和滤饼过滤。
过滤机种类：板框压滤机、真空转鼓过滤机、硅藻土过滤机三、细细胞破碎的主要方法和适用对象，了解基本机理。
（见P65图）细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。
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名词解释
1.生物分离工程：在工业规模上，通过适当的分离纯化技术与装备并消耗一定的能量和分离介质来实现的生物物质制备的过程。
2.膜分离：利用膜的选择性，以膜两侧存在的能量差为推动力，由于溶液中各组分使其膜的迁移率不同，而实现分离的一种技术。
3.穿透曲线：吸附过程中吸附柱出口的溶质浓度变化的曲线。
4.乳化：水或有机溶剂以微小液滴形式分散于有机相或水相中的现象。
5.絮凝：使用絮凝剂将将胶体粒子胶连成网，形成10mm大小絮凝块的过程。
填空
1.色谱展开技术可以分
为（加试样）、（展开）
和（分部收集）三个操
作部分。
2.电泳按分离原理和操
作的不同可分为（区带
电泳）、（等电点电泳）
和(等速电泳)。
3.常用的沉淀操作技术
有盐析法（等电点沉淀
法）和（有机溶剂沉淀
法）三种方法。
4.离心机按功能和用途
的不同可以分为（制备
型离心机）和（分析型
离心机）。
简答
1.膜分离技术的优点？
答：1）处理效率高，设
备易于放大2）可在适
湿或低温下操作3）化
学强度和机械损害最小
4）无相的转变，节能5）
有相当好的选择性，可
在分离浓缩时，可达到
部分纯化的目的6）选
择合适的膜与操作参
数，可获得较高的回收
率7）处理系统可密闭
循环，防止外来污染8）
不外加化学物质，从而
降低成本
2.膨胀床吸附介质应满
足的条件？
答：1）吸附剂的尺寸和
密度应保持其于料液中
需除去的固型颗粒间有
明显的差异2）吸附剂
具有良好的孔道结构，
不易被料液中的大分子
所污染3）吸附剂应具
有活性基团，且对目标
产物具有较高的吸附能
量4）应具有较高的化
学稳定性和良好的机械
程度。
3.细胞破碎方法选择的
依据？
答：1）根据细胞处理量
2）根据细胞壁的强度和
结构3）根据目标产物
对破坏方法的敏感度
4）破坏程度5)目标产物
的选择性释放
计算
三级萃取计算题
利用乙酸乙酯萃取发酵
液中的防线菌素D，当
pH为3.5时分配系数为
57，采用三级错流萃取，
料液的流量H=450L/h，
三级萃取剂的流量之和
为39 L/h，分别计算：1）
L1=L2=L3时和L1=20，
L2=10,L3=9时的萃取
率。
解：（１）当L1=L2=L3
时，萃取因子E=ｍｌ
/H=［57*(39/3)］／４５
０＝１．６５萃取率１
－φ＝１－［１／（１
＋Ｅ）3］＝１－［１／
（１＋１．６５）3］＝
９４．６２％（２）当
L1=20，L2=10,L3=9时：
E１=ｍｌ１
/H=(57*20)/450=2.53;E2
=ｍｌ
2
/H=(57*10)/450=1.27;E
3
=ｍｌ
3
/H=(57*9)/450=1.14萃
取率１－φ＝１－［１
／（１＋E１）*（１＋
E2）*（１＋E3）］=１－
［１／（１＋2.53）*（１
＋1.27）*（１＋1.14）］
=87.41%
论述
比较吸附操作过程与萃。