蛋白质相互作用研究方法及其应用
CO-IP与Pull Down方法比较：优劣势与应用范围
CO-IP与Pull Down方法比较：优劣势与应用范围生物药物研究领域中，蛋白质相互作用的研究对于了解细胞信号传导、药物研发等方面具有重要意义。
而CO-IP（共免疫沉淀）和Pull Down（下拉法）是常用的蛋白质相互作用研究方法。
本文将对这两种方法进行比较，探讨它们的优劣势和应用范围。
一、CO-IP方法图1。
CO-IP方法是一种通过特异性抗体将目标蛋白与其相互作用的蛋白一起沉淀下来的技术。
其基本步骤包括：1）细胞或组织的裂解，释放蛋白质；2）与目标蛋白特异性抗体结合，形成免疫复合物；3）将免疫复合物与蛋白A/G磁珠等亲和剂结合，使其沉淀下来；4）洗涤去除非特异性结合的蛋白；5）蛋白质的分离和分析。
CO-IP方法的优势在于其高度特异性，可以选择性地富集目标蛋白及其相互作用的蛋白。
此外，CO-IP方法还可以用于研究蛋白质复合物的组成和结构，以及研究蛋白质的修饰状态等。
然而，CO-IP方法也存在一些限制，如需要特异性抗体的可用性和抗体的亲和力等。
二、Pull Down方法图2。
Pull Down方法是一种利用亲和剂（如GST标签、蛋白A/G磁珠等）将目标蛋白及其相互作用的蛋白一起富集的技术。
其基本步骤包括：1）将目标蛋白与亲和剂结合，形成复合物；2）将复合物与亲和剂固定在固相载体上；3）将混合物与固相载体接触，使目标蛋白及其相互作用的蛋白与亲和剂结合；4）洗涤去除非特异性结合的蛋白；5）蛋白质的分离和分析。
Pull Down方法的优势在于其操作简单、快速，并且不需要特异性抗体。
此外，Pull Down方法还可以用于筛选蛋白质相互作用的候选者，以及研究蛋白质的结构和功能等。
然而，Pull Down方法也存在一些限制，如亲和剂的选择和亲和力的影响等。
三、CO-IP与Pull Down方法的比较CO-IP和Pull Down方法在蛋白质相互作用研究中都具有重要的应用价值，但在某些方面存在差异。
1.特异性：CO-IP方法通过特异性抗体选择性地富集目标蛋白及其相互作用的蛋白，具有较高的特异性。
生物信息学研究中的蛋白质相互作用预测方法
生物信息学研究中的蛋白质相互作用预测方法蛋白质是生物体中最基本的结构和功能单位，其相互作用对于维持生物体内的各种生理过程至关重要。
蛋白质相互作用预测方法在生物信息学研究中发挥着重要的作用。
本文将介绍一些常见的蛋白质相互作用预测方法，并讨论它们的原理及应用。
一、亲和性纯化方法亲和性纯化方法通过利用蛋白质与特定配体（例如抗体、亲和素等）之间的非共价相互作用来实现蛋白质的纯化。
这种方法在确定特定蛋白质与其他分子的相互作用时非常有用。
此方法的原理是利用具有高度专一性的亲和素与目标蛋白质结合，然后通过洗脱操作从其它蛋白质中获取目标蛋白质。
这种方法广泛应用于蛋白质互作网络构建、酶底物筛选等领域。
二、酵母双杂交酵母双杂交是目前最常用的蛋白质互作方法之一。
该方法利用了酵母细胞内的转录和活性酶元件，能够使两个蛋白质之间产生可观察的物理交互作用。
酵母双杂交法的基本原理是将两个待测蛋白质的互作结构域分别连接到酵母细胞内的两个半酵母转录激活因子。
蛋白质之间的相互作用将导致酵母细胞内的报告基因表达，从而用于互作的鉴定。
这种方法已被广泛应用于蛋白质互作网络的构建和疾病相关蛋白质的筛选。
三、蛋白质结构预测方法蛋白质结构预测是蛋白质相互作用预测的重要一环。
蛋白质结构预测方法通常基于蛋白质序列信息和已知蛋白质结构之间的关系。
其中，比较常见的方法包括：1. 同源建模：根据目标蛋白质与已知结构相似的蛋白质序列，利用结构比对算法，推测目标蛋白质的结构。
2. 从头建模：根据目标蛋白质的氨基酸序列，利用物理化学原理和计算模拟等方法，预测目标蛋白质的结构。
蛋白质结构预测方法的应用主要在于辅助预测蛋白质相互作用的结构域和界面。
四、机器学习方法随着大数据时代的到来，机器学习方法正在蛋白质相互作用预测中扮演越来越重要的角色。
这些方法利用已知的蛋白质结构、序列和功能信息，通过训练模型并对目标蛋白质进行预测，从而预测蛋白质之间的相互作用。
机器学习方法常用于蛋白质互作预测、酶底物预测和药物设计等领域。
蛋白质复合物相互作用的研究方法和应用
蛋白质复合物相互作用的研究方法和应用随着生物技术的发展，生命科学的研究越来越深入细致，原子级别的科学已经成为2018年诺贝尔化学奖的主题。
而蛋白质作为生命体系中至关重要的一类分子，其相互作用的研究也变得日益重要。
蛋白质复合物是由许多蛋白质分子组成的大分子复合体，其中蛋白质间复杂的相互作用是其发挥生物学功能的本质基础。
研究蛋白质复合物的相互作用不仅能够深入解读生命活动的机理，也在药物研发、生物制药等领域有广泛的应用价值。
研究蛋白质复合物相互作用的手段丰富多样，常用的有X射线晶体学、核磁共振、冷冻电镜、等温滴定、表面等温滴定、生物传感器等多种方法。
X射线晶体学是一种经典的研究蛋白质复合物结构的手段，其基本流程是将蛋白质复合物制成晶体，用X射线在晶体中找到原子排列的规律，进而推断蛋白质复合物的三维结构。
X射线晶体学有一定的局限性，需要得到制备好的高质量结晶样品，并且对于一些大分子复合物结晶难度大，或结晶后分辨率不高的情况，难以得到真实的结构信息。
核磁共振是另一种重要的研究蛋白质复合物的结构方法。
这种方法通过测定蛋白质复合物中原子的共振信号，进而推测蛋白质复合物的结构。
相比X射线晶体学，核磁共振不需要制备结晶，对于某些结晶难度大的蛋白质复合物结构研究有着很好的补充作用。
但是核磁共振的定量精度不高，结构分辨率也比较低。
冷冻电镜（cryo-EM）是一种新兴的技术，它不需要制备高质量晶体样品，相对于传统的电镜技术，冷冻电镜减轻了样品准备的要求，允许直接观察蛋白质复合物的形态和结构。
此外，今天的cryo-EM技术已经实现了原子分辨率的分子结构成像，为生命科学研究提供了新的视角。
除了结构方法外，还有一系列的动力学方法可以测量蛋白质复合物的相互作用。
其中，等温滴定法和表面等温滴定法是比较常见的动力学方法。
等温滴定法通过监测蛋白质复合物中溶质的吸附或者解离过程，反映复合体中的物质之间的互相作用。
表面等温滴定法则是在可测的界面上进行等温滴定。
蛋白质相互作用及其应用
蛋白质相互作用及其应用蛋白质是生命体系中至关重要的分子。
它们在细胞内发挥着相当重要的生理和生化功能，如酶催化、信号传递、调控基因表达、运输和储存等。
蛋白质之间的相互作用对于生物学过程具有至关重要的影响，因为它们控制了蛋白质的结构、功能和位置。
在本文中，我将讨论蛋白质相互作用的种类、分子机理、测量方法以及其中的应用。
1. 蛋白质相互作用的种类蛋白质相互作用可以分为两种类型：非共价性相互作用和共价性相互作用。
非共价性相互作用包括静电相互作用、氢键、范德华力和疏水相互作用。
共价性相互作用包括含硫化合物的化学键和二硫键。
非共价性相互作用是生命过程中最重要的相互作用类型，它们构筑了蛋白质生物大分子的三维结构，并控制着多蛋白质复合物的组装和功能。
2. 蛋白质相互作用的分子机理非共价性相互作用的优势在于它们是可逆的，而这使得它们比共价性相互作用更加可控，因为它们受环境因素的影响而产生的微小变化，如温度、pH值和离子浓度等。
程序性渗透分析（SAXS）和核磁共振（NMR）是测量无标记的生物分子间相互作用的最常用方法之一。
这些方法可以帮助研究蛋白质的构象和动力学，并解释复杂的分子系统。
3. 蛋白质相互作用的测量方法传统的蛋白质相互作用研究方法包括表面等离子共振（SPR）、荧光共振能量转移（FRET）和双重极化干涉（SDI）等技术。
但这些方法在实际应用中存在许多限制。
进一步的研究提出了两个更为先进的技术：核磁共振光谱（NMR）和X射线晶体学。
其中，X射线晶体学得到了广泛应用，因为其可以在高分辨率下解析蛋白质结构。
4. 蛋白质相互作用在药物设计中的应用蛋白质相互作用在药物设计中的重要性不言自明。
在化学分子药物发现方面，蛋白质相互作用的角色越来越受到研究者的重视。
例如，以前的药物设计过程中主要依赖随机药物向化合物库寻找的方式，这种方式虽然可以增加发现纯化合物的机会，但不能保证所有的发现都是有意义的。
相比之下，利用蛋白质结构尝试设计特定化合物，是一种更加精准高效的药物发现方法。
蛋白质与药物相互作用分析的研究与开发
蛋白质与药物相互作用分析的研究与开发1. 引言蛋白质与药物相互作用分析是药物研发领域的重要研究方向之一。
通过研究蛋白质与药物之间的相互作用，可以揭示药物的作用机制、优化药物设计以及评估药物的安全性和疗效。
本文将重点探讨蛋白质与药物相互作用分析的研究方法和应用，以及该领域面临的挑战和未来发展方向。
2. 蛋白质与药物相互作用分析方法2.1 结构生物学方法结构生物学方法是蛋白质与药物相互作用分析中常用且有效的手段之一。
通过X射线晶体学、核磁共振和电子显微镜等技术，可以解析蛋白质和药物复合体的三维结构，揭示其相互作用模式和结合位点。
此外，还可以利用计算机模拟技术对复合体进行动力学模拟，预测其稳定性和动力学特性。
2.2 生化分析方法生化分析方法主要包括表面等离子共振、荧光共振能量转移、核磁共振和质谱等技术。
这些方法可以通过检测药物与蛋白质之间的相互作用引起的信号变化，实时监测和定量分析复合体的形成和解离过程。
此外，还可以利用这些方法研究复合体的亲和力、解离常数以及药物与蛋白质之间的动力学参数。
2.3 细胞生物学方法细胞生物学方法主要包括细胞免疫化学染色、蛋白质组学分析以及细胞信号转导等技术。
通过这些方法，可以研究药物与蛋白质相互作用对细胞功能和信号传导的影响，揭示药物作用机制以及其对细胞生理过程的调控。
3. 蛋白质与药物相互作用分析在药物研发中的应用3.1 药物靶点鉴定蛋白质与药物相互作用分析可以帮助鉴定潜在的靶点蛋白，从而为新药发现提供理论依据。
通过筛选化合物与蛋白质库进行相互作用分析，可以发现与药物相互作用的蛋白质，进而确定药物的作用靶点。
3.2 药物分子设计与优化蛋白质与药物相互作用分析可以揭示药物与靶点之间的结合位点和结合模式，为药物设计和优化提供指导。
通过结构生物学方法和计算机模拟技术，可以预测不同化合物与蛋白质之间的相互作用强度和选择性，从而提高药效和减少副作用。
3.3 药效评估蛋白质与药物相互作用分析可以评估药效，并预测其在体内的代谢、转运和排泄情况。
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结实验步骤
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结实验步骤蛋白质与蛋白质相互作用是生物学领域中的一个重要研究方向，可以揭示生命活动的基本机理以及药物设计和治疗疾病的潜在靶点。
本文将总结蛋白质与蛋白质相互作用的研究方法以及实验步骤。
一、蛋白质与蛋白质相互作用研究方法总结：1.蛋白质-蛋白质亲和层析法：该方法通过利用蛋白质与目标蛋白质之间的亲和力，将目标蛋白质与其他非特异结合的蛋白质分离，可用于筛选靶向蛋白质的抑制剂或开发特定结合位点。
2.酵母双杂交方法：该方法是通过融合目标蛋白质与一组已知蛋白质相互作用的底物，通过检测底物报告基因（比如启动子）的表达来确定两个蛋白质相互作用的情况。
3.免疫共沉淀法：该方法通过利用抗体的特异性，将目标蛋白质和与其相互作用的蛋白质一同从细胞裂解液中沉淀下来，以证明它们之间存在相互作用关系。
4.光学双光子显微镜或荧光共振能量转移法：这些方法可以利用荧光染料标记的蛋白质，通过观察它们之间的相互作用情况来研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。
5.表面等离子体共振（SPR）：该方法通过在金属表面固定一个蛋白质，然后观察黄金膜表面等离子体共振信号的变化来研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用过程。
6.核磁共振（NMR）：该方法利用蛋白质中的^1H、^13C和^15N原子的自旋，通过一系列的波形解析来确定蛋白质与蛋白质之间的相互作用，可以提供高分辨率的结构和动力学信息。
7.体外重组蛋白质表达和结合实验：利用大肠杆菌或霞赤红热单核细胞感染表达载体后表达目标蛋白质，以及通过重组技术制备的其他蛋白质，通过混合这些重组蛋白质来研究它们之间的相互作用。
二、蛋白质与蛋白质相互作用实验步骤：1.实验前准备：根据研究目的选择适当的实验方法和方法，准备相应的试剂和材料。
2.原料处理：获得目标蛋白质样品后，进行必要的纯化或浓缩处理，以去除其他污染物，并保持蛋白质的活性。
3.实验设计：根据研究目的设计实验方案，比如确定实验条件、控制实验和重复实验。
蛋白质相互作用的研究现状及其应用前景
蛋白质相互作用的研究现状及其应用前景蛋白质是生命体中的基本分子，它们负责维持细胞的正常运作、调控细胞的生长和分化、参与细胞信号传导等重要生命过程。
蛋白质相互作用是蛋白质在细胞中发挥作用的重要机制之一。
蛋白质相互作用研究的发展不仅揭示了生命过程的本质，而且为药物研究和发现提供了新的思路和方法。
一、蛋白质相互作用研究的现状蛋白质相互作用的研究是现代生命科学的重要方向之一，涉及蛋白质结构生物学、蛋白质功能化学、细胞生物学等多个学科领域。
目前，蛋白质相互作用的研究主要从以下几个方面进行：（一）蛋白质相互作用的鉴定蛋白质相互作用的鉴定是研究蛋白质相互作用的关键环节之一。
目前，常用的蛋白质相互作用鉴定技术包括双杂交技术、酵母三杂交技术、免疫共沉淀技术、表面等离子共振技术、荧光共振能量转移技术等。
（二）蛋白质相互作用的机制研究蛋白质相互作用的机制研究是揭示蛋白质相互作用本质的关键环节之一。
目前，蛋白质相互作用的机制研究主要从结构和动力学两个方面进行。
从结构方面来说，研究人员采用X射线晶体学、核磁共振等技术揭示了蛋白质相互作用的结构基础，为理解蛋白质相互作用的机制提供了直接证据。
从动力学方面来说，研究人员采用分子动力学模拟等技术研究蛋白质相互作用在时间和空间上的变化规律，揭示蛋白质相互作用的动力学机制。
（三）蛋白质相互作用的生理学功能研究蛋白质相互作用的生理学功能研究是揭示蛋白质相互作用在细胞和生物体内的作用机制和生理学效应的关键环节之一。
目前，研究人员通过对蛋白质相互作用参与的生物过程进行分析和研究，揭示了蛋白质相互作用在细胞生长、分化、凋亡、信号传导等方面的作用机制。
二、蛋白质相互作用应用前景蛋白质相互作用的研究不仅揭示了生命过程的本质，而且为药物研究和发现提供了新的思路和方法。
以下是蛋白质相互作用的应用前景：（一）疾病治疗蛋白质相互作用在疾病治疗中具有重要的作用。
例如，在癌症治疗中，通过干扰肿瘤细胞表面蛋白质相互作用来阻断肿瘤细胞的生长和分化；在感染性疾病治疗中，通过干扰病原菌与宿主相互作用来阻断病原菌感染宿主。
蛋白质相互作用研究方法
蛋白质相互作用研究方法蛋白质相互作用是指两个或多个蛋白质之间的相互作用和相互调节。
研究蛋白质相互作用的方法有很多种，下面将介绍其中一些常用的方法。
1. 酵母双杂交检测（Y2H）：该方法是通过基因转录和细胞生理过程来检测蛋白质相互作用。
该方法的基本原理是将感兴趣的两个蛋白质分别连接到酵母细胞中的转录因子的DNA结合结构域和激活结构域，当这两个蛋白质发生相互作用时，转录因子被激活，从而触发报告基因的表达。
通过检测报告基因的表达水平来确定蛋白质之间的相互作用程度。
2. 免疫共沉淀：该方法是利用两个蛋白质之间的特异性相互作用来检测和分离它们。
首先，在一个蛋白质中引入一个标签，比如His标签。
然后，将该蛋白质在体外与另外一个感兴趣的蛋白质一起孵育，使它们发生相互作用。
最后，利用特定的抗体识别标签，并用亲和树脂或磁珠来沉淀包含这些标签的复合物。
通过酶解、电泳等方法对复合物进行分析，可以确定两个蛋白质之间的相互作用。
3. 光学方法：如可以利用荧光共振能量转移（FRET）技术来研究蛋白质相互作用。
该技术基于两个发射荧光染料的距离变化会改变吸光度的原理，当两个蛋白质相互作用时，可以通过激发一个染料并检测另一个染料发射的荧光信号来确定它们之间的相互作用程度。
4. 质谱法：质谱法是一种广泛应用的蛋白质相互作用研究方法。
其中，串联质谱法（MS/MS）可以用来鉴定蛋白质复合物中的组分。
根据质谱分析的结果，可以确定两个蛋白质之间的相互作用和结合部位等信息。
此外，还有其他一些方法如共结晶、核磁共振、冷冻电镜等，可以对蛋白质相互作用进行研究。
这些方法的选择取决于研究者所关注的蛋白质特性、相互作用类型以及研究目的等因素。
需要注意的是，以上方法在研究蛋白质相互作用时有其局限性。
比如，一些方法需要在体外进行，无法反映细胞内环境；一些方法可能对于某些蛋白质的研究不适用；一些方法可能存在假阳性和假阴性等问题。
因此，在选择研究方法时，需要综合考虑各种因素，并采取多重方法相互印证，以获得准确可靠的结果。
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・技术与方法・生物技术通报B I O TECHNOLO G Y BULL ET I N2006年增刊蛋白质相互作用研究方法及其应用王海波 安学丽 张艳贞 王爱丽 李巧云 晏月明(首都师范大学生命科学学院,北京 100037) 摘 要: 过去10年来,蛋白质组学得到迅速发展,蛋白质间的相互作用作为蛋白质组学的重要内容,更是成为国内外竞相研究的重点,研究方法的快速发展为蛋白质间相互作用的研究奠定了坚实基础。
着重就经典的噬菌体展示、酵母双杂交以及新近发展起来的串联亲和纯化、荧光共振能量转移技术和表面等离子共振等蛋白质相互作用研究方法的原理及应用作一综述并展望其发展前景。
关键词: P DT Y2H T AP FPET SPRApproaches and Appli cati ons of Protei n 2Protei n I nteracti on Studi esW ang Haibo An Xueli Zhang Yanzhen W ang A ili L i Q iaoyun Yan Yue m ing(College of L ife Science,Capital N or m al U niversity,B eijing 100037) Ab s tra c t: W ith the fulfill of HGP (Hu man genom ic p r oject ),the study t op r otein is s p ring up.Pr otein -p r otein in 2teracti on is one of i m portant subjects of Pr oteom ic,it is i m p licated in every cellular p r ocesses .Now many methods have de 2vel oped t o identify and characterize p r otein 2p r otein interacti ons .The main content of this paper is describe both classical and es pecially recent methods t o study p r otein 2p r otein interacti ons such as Yeast t w o 2hybrid syste m (Y2H ),Tande m affinity pur 2ificati on (T AP ),Fluorescence res onance energy transfer (FRET )and Surface p las mon res onance (SPR ),fr om the p rinci p le t o p r ocess of these technol ogies,s ome ne w achieve ment obtained by these methods als o intr oduced .Key wo rd s: P DT Y2H T AP FPET SPR 作者简介:王海波,硕士研究生,首都师范大学生命科学学院608实验室 通讯作者:晏月明,Tel:010*********;E 2mail:yany m2004@ 随着生命现象的研究逐渐由获取基因序列信息转向研究基因功能,一门新的学科———蛋白质组学应运而生。
蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化的整体,其功能往往是通过蛋白质之间或与核酸之间相互作用而表现出来的,这种相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中,相互交叉形成网络,构成细胞中一系列重要生理活动的基础。
因此,对于蛋白质相互作用的研究就成为蛋白质组学中最主要研究内容之一,迄今已发展了包括经典的噬菌体展示技术、酵母双杂交系统以及新近发展并广泛应用的串联亲和纯化和荧光共振能量转移技术、表面等离子共振技术等多种有效的研究蛋白质间相互作用的高通量分析方法,为蛋白质组学的发展奠定了坚实的基础。
1 噬菌体展示技术(P DT )大肠杆菌丝状噬菌体包括f1、fd 和M13,它们只感染含F 因子的大肠杆菌。
1985年,美国M iss ouri 大学S m ith 博士等人[1]将R I 核酸内切酶基因片段连接到丝状噬菌体fd 编码次要外壳蛋白的基因Ⅲ中,成功地得到了在外壳蛋白中融合表达了酶分子的噬菌体颗粒。
后经验证,该噬菌体能被Eco R Ⅰ核酸内切酶抗体有效中和,说明展示在噬菌体外壳表面的酶分子具有与天然酶分子相同或极其相近的构象和活性,这一试验的成功标志着噬菌体展示技术(Phage dis p lay techniques,P DT )的诞生。
噬菌体展示技术是在噬菌体展示肽库建立之后才开始广泛应用到蛋白质相互作用研究的。
1990年Scott 等人[2]利用噬菌体展示技术构建了随机多生物技术通报B iotechnology B u lletin2006年增刊肽文库,该文库由特定长度的随机短肽组成,理论上包含了某一固定长度短肽所有氨基酸的排列组合方式。
由于蛋白质间的识别与结合主要取决于局部肽段中少数几个氨基酸,所以用受体蛋白对随机肽库进行亲和筛选,就能得到之结合的短肽序列,根据此短肽的序列,就可以得到与目的蛋白相互作用所依赖的氨基酸残基[3],从而可以进一步研究蛋白质之间的分子识别,酶与底物的结合等等,突破了传统研究蛋白质相互作用时需对其结构详尽了解的限制。
噬菌体展示技术最大的特点在于被展示在噬菌体表面的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物活性,建立起了基因型和表现型之间的一致性。
到现在已相继成功构建了f1、M13、T4等噬菌体表达载体,为蛋白质组学的发展提供了有利的工具。
Jes pers等[4]利用噬菌体展示技术,通过热变性发展了一种选择抗凝集蛋白的方法,这一方法的建立对于抗凝集蛋白的选择、鉴定;防止或促进蛋白的凝集反应以及诊断由凝集蛋白引起的疾病等方面都意义重大。
2 酵母双杂交系统(Y2H)酵母双杂交系统(Yeast t w o2hybrid syste m, Y2H)是1989年由Fields等[5]提出并初步建立的,主要用于研究真核生物的蛋白质,到现在,双杂交系统已经成为检测和鉴定蛋白质相互作用的标准方法,并且在旨在建立一系列蛋白质相互作用关系的蛋白质组研究中扮演着重要角色[6]。
Y2H的建立是基于人们对酵母半乳糖苷酶基因的转录激活因子G AL4的详细了解。
G AL4包括两个可以独立的结构域:N末端的DNA结合域(DNA2binding domain,DNA2BD)和C末端的转录激活域(Transcri p ti on activating domain,DNA2AD)。
DNA2BD可以与DNA分子的上游激活序列结合, DNA2AD则可以激活下游基因的转录,只有当两者在空间上充分接近时才会共同作用激活转录活性。
双杂交技术正是利用了G AL4的这一特点,将欲研究的两个目标蛋白的编码序列分别与G AL4的结合域和激活域的编码序列融合,构建成两个杂交系统;再将这两个杂交系统共同转化至含有报告基因的酵母细胞株;若两个目标蛋白发生相互作用,则会使DNA-BD和DNA-AD在空间上靠近进而激活报告基因的表达。
酵母双杂交系统简单快速,最常用于鉴定与已知蛋白相互作用的未知蛋白,同时也是发现新的蛋白质相互作用以及确定相互作用结构域的重要研究手段。
T RPC通道是一组Ca2+流量调节通道蛋白,研究证明磷脂酶Cγ1(phos pholi pase Cγ1,P LC2γ1)结合并控制该通道,对降低Ca2+流量是必要的,但一直没有鉴定出它们相互作用的结构域。
Ros2 sum[7]等人应用Y2H系统,构建了pG BKT72BD2T R2 PC3和pG ADT72AD2P LC2γ1两个载体,共同转化到酵母当中,以Lacz为报告基因,发现P LC2γ1只特异的与TRPC3相结合。
实验人员又构建了载有不同氨基酸长度T RPC3与P LC2γ1的双杂交系统,发现TRPC3与P LC2γ1的相互作用只依赖于TRPC3中对应的PH相似结构域中40～46个氨基酸,从而建立了一个广泛的信号转导模型。
3 串联亲和纯化(T AP)近年来质谱技术发展迅速,其功能强大且灵敏度高,常用来鉴定相互作用的蛋白质复合体或复合体亚基,但通常难以获得足够量纯化的蛋白质复合体,成为质谱在这方面应用的一个限速步骤[8]。
1999年R igaut[9]等人共同提出了一套分离复合蛋白的新方法———串联亲和纯化(Tande m affinity puri2 ficati on,T AP),兼具标准亲和纯化和免疫共沉淀两种生化方法的优点,为蛋白质复合体的分离鉴定提供了一条新路径。
串联亲和纯化技术首先需通过基因工程给被分离纯化蛋白的一端加一个T AP标签,该标签由I gG 结合结构域(Pr ot A)及一个钙调蛋白结合多肽(CBP)组成,结构域与多肽之间由一个TE V蛋白酶切位点隔开。
通过基因重组将细胞内源性的目标蛋白基因置换为带有T AP标签的基因,温和裂解细胞,获取细胞抽提物,将抽提物加入I gG亲和柱, T AP标签的Pr ot A端会与I gG形成强结合,在用洗脱液洗脱掉大部分非特异性结合物和杂蛋白后,再用含有TEV蛋白酶的洗脱夜将蛋白质复合体切割下来。
在钙离子参与下,被切割下来带有CBP的蛋白质复合体与钙调蛋白紧密结合,充分洗脱,就可以进一步去除非特异作用的蛋白质杂质,最后纯化出高纯度的目的蛋白复合体。
8612006年增刊王海波等:蛋白质相互作用研究方法及其应用利用串联亲和纯化技术,通过对洗脱后的复合体作质谱分析或电镜观察,可以快速的发现细胞中新的蛋白质复合体或鉴定出复合体中的新组分。
Dzie mbowski等人[10]应用T AP技术,纯化分析了酿酒酵母(Saccharo m yces cerevisie)前体mRNA拼接酶复合体2U2微小核糖核蛋白颗粒(s mall nuclear ribo2 nucleop r otein particle,snRNP)关联拼接因子SF3a和SF3b。
在对SF3b的纯化中分离出了一个新的重要的蛋白亚基Ysf3p。
按照先前的观点,认为在酵母SF3b中存在一个Snu17p亚基,是人类SF3b因子中p14亚基的直系同源物,在此次试验中却发现Snu17p不属于酵母SF3b因子,而是属于本实验中新发现的另一个拼接酶复合体RFS的一个组分。
4 (FRET)采用标签法检测和分离蛋白的方法虽然有效但也存在缺点,比如说分离蛋白标签可以改变蛋白的溶解性并且不能在活体细胞中进行等[11]。