蛋白质的研究方法PPT课件

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蛋白质的性质分类及研究方法

蛋白质的性质分类及研究方法
酸序列,推导出其决定的氨基酸序列。
(术语:推定/推测蛋白质 putative protein)
优点:快速、无需纯化蛋白质、基因易分离测序 缺点:无法确定经后加工的蛋白质的最终序列、
被修饰的氨基酸和二硫键的位置
二、直接测定法(9大步)
(一)测定蛋白质一级结构 (测序) 的策略
(1)测定蛋白质分子中多肽链的数目 (2)拆分蛋白质分子的多肽链 (3)断开多肽链内的二硫键 (4)分析每一多肽链的氨基酸组成 √ (5)鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基 √ (6)裂解多肽链成较小的肽段(用2种或几种不
◆蛋白质在等电点时,易沉淀析出;同时,其粘 度、渗透压、膨胀性及导电能力均为最小。
二、蛋白质的胶体性质
◆蛋白质由于分子量很大,在水溶液中形成 1~100nm的颗粒,因而具有胶体溶液的特征;
◆可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基 酸残基,对水有很高的亲和性,通过水合作用在 颗粒外面形成一层水化层;
串联质谱技术; • 重建多肽链一级序列的重叠肽拼凑法 • 用于二硫桥定位的对角线电泳等。
第三节、蛋白质的分离、纯化和分析
一、蛋白质纯化的准备工作
准备工作要解决三个问题:
(一)明确纯化蛋白质的目的; (二)建立目标蛋白的测活方法; (三)选择富含目标蛋白的原材料。
二、蛋白质纯化的一般注意事项
1.操作尽可能在低温条件下进行。2.待纯化的材料不要太稀.3. 合适的PH。4.使用蛋白酶抑制剂,防止蛋白酶对目标的降解。 5.避免样品反复冷冻盒剧烈搅动,防止蛋白质变性。6.缓冲溶 液成分尽量模拟细胞内环境。7.加入防止蛋白质氧化及对目标 蛋白破坏的DTT和EDTA。8.使用灭菌溶液防止微生物生长。
(二)沉淀 根据不同蛋白质在特定条件下溶解性不同,而 对他们进行选择性沉降从而达到分离目的一 种粗纯化方法。它通常用于目的蛋白从大体 积的粗抽提物中游离出来。这种方法既能除 去许多杂质,又有浓缩之效。 方法包括:改变PH或改变离子强度(盐析)

第四章 蛋白质的性质、分类及研究方法

第四章 蛋白质的性质、分类及研究方法
OUS PS EOVE RLA HOWT SEO WTOU VERL APS HO
多肽序列分析实例
蛋白质研究方法
假定你发现一种新的蛋白质:蛋白质X 1. 如何得到这种蛋白质?
蛋白质的分离、纯化技术 2. 这种蛋白质的大小?
(SDS-PAGE) 3.它的pI是多少?
(等电聚焦) 4. 其他细胞或其他生物体内是否存在? (Western印迹) 5. 其一级结构如何?
`
• N末端:
• Sanger法(FDNB)
• C端:
肼解法
此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加 热,C-端氨基酸即从肽链上解离出来,其余的氨基酸则变成 肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-
端氨基酸分离。
RO H2N CH C
R n-1O
Rn O
HN CH C HN CH C OH
几种蛋白酶特异性的比较
蛋白质的各种 间接测定法。
先得到某一种蛋白质基因的核苷酸序列,然后根据通用的 遗传密码表间接推导出由其决定的氨基酸序列。(DNA测定 序列简单,无法确定最终加工后蛋白质序列、修饰后蛋白 质序列、二硫键信息)
蛋白质一级结构直接测定法的主要步骤
沉降系数S:
大分子沉降速度的量度,等于每单位离心场 的速度。 或S=v/ω^2‧r。s是沉降系数,ω是离心转子 的角速度(弧度/秒),r是到旋转中心的距 离,v是沉降速度。 沉降系数以每单位重力的沉降速度表示, (the velocity per unit force)并且生物大分 子通常为1~500×10^-13秒范围 如令1×10^-13=S 那么生物大分子沉降系数 通常为1~500S S=(p-m)V/f
第四章 蛋白质的性 质分类及研究方法

蛋白质研究方法

蛋白质研究方法

基因工程表 达重组蛋白
捕获相应蛋白质
二、经典的细胞蛋白质分离纯化流程:
清洗组织或细胞 裂解细胞
离心除去膜组分等获得可溶性蛋白质 离心、层析、电泳等进一步纯化 获取产物蛋白
1. 细胞的破碎
各种组织和细胞的常用破碎方法
细胞破碎方法
旋刀式匀浆 手动式匀浆 高压匀浆 研磨 高速珠磨 酶溶 去垢剂渗透 有机溶剂渗透 超声破碎 低渗裂解 冻融裂解
蛋白质的研究方法
• 第一节 蛋白质提取
目的蛋白研究基本流程
分离纯化蛋白质 测定蛋白质分子质量
蛋白质结构分析 蛋白质生物学活性分析
探索结构与功能的关系
一、蛋白质样品的提取
目的蛋白的获取
直接从生物 体内获取
基因组测序 基因组测序进行推导
获取部分肽段氨基酸序列 获取蛋白质的编 码序列 (cDNA) 采用免疫学方法获取相关抗体
动态弹性光散射 孔径梯度电泳 质谱
氨基酸序列测定 用抗体检测蛋白质 蛋白质免疫印迹
免疫共沉淀
第二节 蛋白质的定性定量分析
➢ 蛋白质定性分析 (qualitative analysis)
确定样品中是否有蛋白质存在,以及存在 的是何种蛋白质
➢ 蛋白质定量分析 (quantitative analysis)
确定样品中总蛋白含量,或者某种单一蛋 白成分的含量
一、蛋白质的含量测定
蛋白质的含量测定
基于蛋白质的 基于蛋白质的 基于蛋白质的 元素组成特点 化学显色反应 光吸收特性
➢ 蛋白质元素组成的特点
各种蛋白质的含氮量很接近,平均为16% 由于体内的含氮物质以蛋白质为主,因此 只要测定生物样品中的含氮量,就可以根据 以下公式推算出蛋白质的大致含量: 100克样品中蛋白质的含量 ( g % )

《蛋白质组研究技术》课件

《蛋白质组研究技术》课件
纯化得到相互作用蛋白。
酵母双杂交技术
利用酵母细胞表达的蛋白与待测蛋白 进行相互作用,筛选出与待测蛋白相 互作用的蛋白。
串联亲和纯化技术
将待测蛋白与其相互作用蛋白一起纯 化下来,再通过分离纯化得到相互作 用蛋白。
03 蛋白质组学在生物医学中 的应用
疾病标志物发现
疾病诊断
通过蛋白质组学技术,发现与疾病相关的特异性蛋白质标志物,有助于疾病的早 期诊断和预后评估。
电泳技术
利用蛋白质在电场中的迁移率不同,将蛋白质分 离成不同的条带。
蛋白质芯片技术
将蛋白质固定在芯片上,通过与待测蛋白质的相 互作用,实现对蛋白质的筛选和检测。
蛋白质鉴定技术
蛋白质鉴定技术
利用各种技术手段对分离得到的蛋白 质进行鉴定,确定其氨基酸序列和分 子量等信息。
氨基酸序列分析
通过测定蛋白质中氨基酸的排列顺序 ,确定蛋白质的种类和来源。
未来发展趋势与展望
技术创新
未来蛋白质组学技术将继续创新 ,如高通量、高灵敏度、高分辨 率的蛋白质检测技术。
跨学科融合
蛋白质组学将与生物信息学、计 算生物学等学科进一步融合,实 现多维度、多层次的数据分析。
临床应用拓展
随着技术的进步和应用研究的深 入,蛋白质组学将在临床诊断、 治疗和药物研发等方面发挥更大 的作用。
分子量测定
利用质谱等技术手段测定蛋白质的分 子量,以验证蛋白质鉴定的准确性。
免疫学检测
利用特异性抗体对蛋白质进行检测和 识别,具有高灵敏度和特异性。
蛋白质功能研究技术
蛋白质功能研究技术
通过各种手段研究蛋白质在生物体内的功能 和作用机制。
细胞生物学技术
通过观察蛋白质在细胞内的定位、分布和动 态变化,研究其功能和作用机制。

蛋白质的研究方法优秀课件.ppt

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就是利用SDS的这种结合在整个蛋白分子上,并使蛋白 完全变性的特性。
这样经过SDS变性的蛋白质在电场中完全按大小分离开。
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非离子去污剂:
相对温和,一般不会使蛋白质变性。只是将蛋白质 分子从膜上溶解下来而已。
➢当[去污剂]<其CMC值的时候,去污剂分子与膜蛋 白表面的疏水区域结合,使蛋白质在水溶液中溶解 而不聚集。 ➢当[去污剂]≧其CMC值的时候,去污剂分子将与膜 磷脂一起形成混合微团,膜蛋白以整合在微团中的 形式存在。
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细胞碎片的去除——离心( centrifugation)
原理:悬浮在溶液中的两个或多个不同质量或密度 的颗粒(如细胞、细胞器、大分子复合体、或分子 等)沉降到试管的底部的速度是不一样的,质 量越大、或密度越高沉降的速度越快。
沉淀:固体性的细胞碎片和细胞器沉降到离心管的 底部形成;
蛋白质颗粒表面有一层水膜,也称水化层。水化层 的存在使蛋白质颗粒相互隔开,不会聚集成大颗粒 而沉淀。
蛋白质有两性解离性质。如果溶液的PH值偏离了PI, 所有分子都带相同电荷,又会进一步增进它们的分 散能力。
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#
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等电点(PI):
1.能破坏蛋白质分子水化作用 2.是减弱分子间同性相斥作用的因子
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5
制备过程中注意事项:
要求自始至终保持在天然状态
• 避免一切过激因素如:过酸或过碱,高温, 重金属等的影响。
2. 通常都在低温条件下操作。
3. 尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高
水平。
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蛋白组学定量蛋白质组学.ppt

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但是仅仅进行鉴定并不能提供用以阐明蛋白质的功 能的全部信息,监控蛋白质的表达水平对阐明细胞 体内存在的各种生物进程是非常重要的。因此,定 量蛋白质组学作为蛋白质组学研究的重要一部分被 提出来。
2
常用研究方法
以质谱技术为基础的化学标记定量方法 荧 光 差 示 双 向 凝 胶 电 泳 技 术 ( F-2D-
质量变化依赖于氮原子数目,因此对未 知的蛋白质难以进行定量。
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(二)稳定同位素标记的必需氨基酸体 内标记(SILAC法)
高等动物细胞的生长中需要一些必需氨基酸的摄入,如赖氨酸 (Lys)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)等,这些氨基酸细胞自身 无法合成,需要从外界摄入补充。
在培养细胞时,可以在培养介质中特异的加入用稳定同位素标 记的某一种必需氨基酸,在经过适当的培养时间后,细胞中合 成的含有这类氨基酸的蛋白质几乎都掺入了标记的氨基酸 。
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MCAT策略流程:定性
Lys只在Trypsin酶切后的末端,所以产生的b离子都没有被修饰;所有的y 离子带Lys,因此被修饰。
在MS/MS图谱上,所有的b离子是单一条带出现,所有的y离子是成对出现, 丰度比例一样,且相差同样的m/z。
容易区分b离子和y离子,容易读出氨基酸序列。
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MCAT策略流程:定量
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–COOH羧基标记
通过对羧基酯化进行 标记
用H和D标记的甲醇酯 化标记,来定量研究 蛋白质表达量的差异
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羧基酯化标记进行蛋白定量研究
比例=2 : 1
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缺点:
特异性不是很好,在C末端和Asp和 Glu残基上都有标记,且效率不均
采用的标记条件容易引起天冬酰胺 (Asn)和谷氨酰胺(Gln)的去酰胺

蛋白质的研究方法

蛋白质的研究方法



对动物组织,必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为 原材料,先进行绞碎、脱脂等处理。
6
另外,对预处理好的材料,若不立即进行实验,应冷冻保存,对于易 分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。
组织细胞破碎的方法:
1. 机械破碎法:
利用机械力的搅切作用,使细胞研碎
高速搅切器、玻璃匀浆器、家用搅肉器、研钵、 玻璃珠高速匀浆器以及静压器(高压破碎)。
亲和层析法(Affinity Chromatography AC)
1.原理: 填料上的配基与生物大分子特异结合,用特殊的 洗脱条件把被吸附的生物分子洗脱下来。一种亲和 色谱填料只能用于一种或有限的一类生物分子。
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流动相:
洗脱剂--柠檬酸盐
作用:柠檬酸离子因与Ca2+有更强的相互作用, 它能大大降低蛋白质和凝胶的吸附能力。 NaCl,KCI甚至浓度高达3M时,也不影响Pr负电荷
的吸附,相反这些盐可以大大降低Pr正电荷的吸附。因 可以专门吸附酸性蛋白质及中性蛋白质而排除碱性蛋白
质。
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此在高浓度的这些盐溶液中应用羟基磷灰石进行层析时,
21
2、离子交换层析法 离子交换剂有阳离子交换剂(如:羧甲基纤维
素;CM-纤维素)和阴离子交换剂(二乙氨基乙基纤
维素;DEAE?FONT FACE="宋体" LANG="ZH-CN">纤维
素),当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱
时,带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在 离子交换剂上,随后用改变pH或离子强度办法将吸
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2. 有机溶剂法
分辨力比盐析方法高,提纯效果好
1.基本原理
(1)在PI附近,Pr主要以中性离子形式存在。此时若添加 有机溶剂,由于有机溶剂可使溶液电离常数减小,增强了 中性离子间静电引力,从而使分集合而沉淀出来。

蛋白质组学-PPT课件

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iTRAQ 结构
iTRAQ包括三部分:报告部分、肽反应部分、平 衡部分。 1、报告部分:有八种,因此iTRAQ可同时标记8 组样品。 2、肽反应部分:能与肽N端及赖氨酸侧链发生共 价连接而标记上肽段,几乎可以标记所有蛋白质。 3、平衡部分:保证iTRAQ标记的同一肽段的质荷 比相同。
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2:蛋白质组学研究内容
2.1:蛋白质的表达模式 (1)生理、病理或不同发育状态下蛋白质组表达差异蛋白质信息库。 (2)蛋白质及其组成质点的分离、分析、鉴定。 2.2:蛋白质的功能模式 (1)蛋白质结构分析。 (2)蛋白之间相互作用,翻译后修饰,细胞定位等。
3: 化学标记法—iTRAQ
简介:
iTRAQ试剂是可与氨基酸末端氨基及赖氨酸侧链氨基连接的胺标记同重元素。在质谱图 中,任何一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。 在串联质谱 中,信号离子表现为不同质荷比(113-119,121)的峰,因此根据波峰的高度及面积,可以 鉴定出蛋白质和分析出同一蛋白质不同处理的定量信息。

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1:双向电泳
基于2D-PAGE 的经典定量分 析方法。 1、样品准备 和定量:抽提 对照组和各种 不同实验组的 蛋白质。 2、蛋白质分 离:蛋白质经 过2D-PAGE分离 后染色(银染、 考染等)。 3、蛋白质的 定性与定量分 析:通过与对 照组相Image Master 7.0分 析出实验组中 差异点,质谱 鉴定差异点蛋 白质,同时应用 软件分析出其 表达量的变化。
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应用各种分辨效果好的化学及物理化学 方法
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直接从生物组织中提纯蛋白—— 蛋白质的分离纯化包括以下过程:
1.破碎生物组织,并用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来; 2.将有关的蛋白质分级沉淀下来; (盐析法或有机溶剂
法) 3.应用层析法或电泳法使它们各自分开; 4.蛋白质结晶; 5.蛋白质纯度鉴定和含量测定。
利用低渗条件,使细胞溶胀破碎。
红血球放于水中,便发生自溶。
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*抽提作用:
生物材料在破碎的过程中,通常被浸在 适当的缓冲液中,使细胞中的蛋白质等内容 物释放到这种溶液中去。
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3.交替冻融法:
生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀 而使细胞胀破。
4.超声波法:
利用超声波震荡,使细胞膜上所受张力不均而解 体。
有的去污剂不能解离,所以分子中缺少带电基团, 如:
Triton X-100, 辛基葡萄糖苷( octylglucoside)
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临界微团浓度(critical micelle concentration,CMC): 每一种去污剂都具有一特征性的CMC。
CMC值与其分子中疏水部分与亲水部分的结构有 关。
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非离子去污剂:
相对温和,一般不会使蛋白质变性。只是将蛋白质 分子从膜上溶解下来而已。
➢当[去污剂]<其CMC值的时候,去污剂分子与膜蛋 白表面的疏水区域结合,使蛋白质在水溶液中溶解 而不聚集。 ➢当[去污剂]≧其CMC值的时候,去污剂分子将与膜 磷脂一起形成混合微团,膜蛋白以整合在微团中的 形式存在。
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去污剂:
一类具有 亲水性头部 疏性尾巴 的双亲性(amphipathic)脂类分

作用: 既可以破坏细胞的磷脂双层结构,又可以与具有疏
水性表面的膜蛋白结合,从而阻止释放出来的膜蛋白 通过疏水相互作用形成大的、可沉淀的聚集体。
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有的去污剂的亲水性头部可离子化(即含有一带电 基团) 如:
脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate) 十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate,SDS)
一般选择非离子去污剂来保持膜蛋白生物活性 24
25
26
四、蛋白分子的稳定
防止蛋白质分子可能被同时释放的蛋白质水解酶降 解、Pr空间结构可能被温度或化学试剂等环境因素 破坏而丧失生物学活性等。
处理:需要在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂; 在低温下操作; 加入稳定剂(如甘油等).
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五、细胞碎片的去除——离心( centrifugation)
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膜蛋白的处理:复杂
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细胞膜的结构
按其所在位置大体可分为:
两种类型 外周蛋白(通过次级键和外膜脂质的
极性头螯合在一起)
固有蛋白
外周蛋白---选择适当离子强度及PH的含有EDTA的
缓冲液抽提(高盐溶液)
固有蛋白---嵌合在膜双层中,它通过疏水作用与
膜内部脂质层的疏水性尾部相结合,
具有α螺旋结构。
5.酶消化法:
利用蛋白酶、溶菌酶、蜗牛复合酶等对 细胞膜或细胞壁的分解作用,使它们解体
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三、去污剂处理溶解膜蛋白
膜蛋白的提取与细胞质蛋白,核蛋白提取不同之 处在于它是嵌在膜中的,水溶性不好,基本方法 就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等,最后用 去污剂把蛋白从膜中释放出来。膜蛋白分离纯化 的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂
一般固形生物材料首先都必须加以破碎,以释放出细
胞内的蛋白质组分。
生物材料 必须新鲜
要求:
1. 材料 -80℃
2. 或者制成干粉(丙酮)
3. 低温存放
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破碎的方法:
1. 机械破碎法:
利用机械力的搅切作用,使细胞研碎
高速搅切器、玻璃匀浆器、家用搅肉器、研钵、
玻璃珠高速匀浆器以及静压器(高压破碎)。
2.渗透破碎法:
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根据基因组测序获得的信息 (1)可以获得所要研究的特定蛋白质的AA序列。
先根据推出的AA序列合成对象蛋白中的一段肽,用它 去获 得有关的抗体,然后用抗体去探测蛋白质的存在, 甚至可以用抗体通过亲和层析纯化对象蛋白
9
(2)去获得有关基因的cDNA全序列,然 后通过重组DNA技术去表达重组蛋白。
有偏差,甚至完全是假象。 即使推测得到的蛋白质编码信息是对的,在细胞 内还存在转录后的RNA加工,翻译后的蛋白质的 修饰和加工等基因序列上目前还无法反映的信息。
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制备过程中注意事项:
要求自始至终保持在天然状态
1. 避免一切过激因素--如过酸或过碱,高温, 2. 重金属等的影响。 2. 通常都在低温条件下操作。 3. 尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高
水平。
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二、细胞的破碎
少数蛋白质---存在于细胞外面(如血液和体液中) 大多数蛋白质---都存在于细胞的里面。
4
选择研究蛋白的原则:
➢ 在组织中含量比较高
➢ 相对比较稳定的蛋白质(如血液中的Hb;肌肉中的 肌球蛋白和肌动蛋白等)
从模式生物基因组测序结果来看,每一种生物有机体 内都还有大量的蛋白质(50%左右)从来没有被研究 过。
5
获取蛋白样品的方法: 直接从生物组织中提纯蛋白—为主 根据基因组测序获得的信息
蛋白质的研究方法
2010-10
1
主要内容
❖蛋白质对象的选择和样品的获取 ❖蛋白质的检测和鉴定 ❖蛋白质的结构分析 ❖蛋白质生物功能检测
2
蛋白质对象的选择和样品的 获取
3
一、研究对象的选择
无论何种来源的生物材料一般都含有成千上万种不同 的蛋白质分子; 在一种生物组织中,同时又存在着多种蛋白质组分。 虽然它们都具有肽链结构,但在分子大小、极性以 及电荷上会有所差异。
在部分情况下,当去污剂被透析掉后,蛋白质可 以复性并恢复生物活性。
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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSpolyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE):
就是利用SDS的这种结合在整个蛋白分子上,并 使蛋白完全变性的特性。
这样经过SDS变性的蛋白质在电场中完全按大小 分离开。
当[去污剂]低于此值的时候,去污剂分子在水溶液中 将不形成微团,达到此值的时候,微团开始形成。
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离子化去污剂(SDS):
其“疏水尾巴”破坏蛋白质分子的疏水性部分的 结构,其带电的“头部”破坏蛋白质分子中的氢 键和离子键。
作用的结果是: 使任何蛋白(不管是膜蛋白还是水溶性蛋白)
都发生完全变性,并溶解在水溶液中,同时失去 生物活性。
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