中性蛋白酶活性测定试剂盒使用说明
中性木聚糖酶(NEX)活性检测试剂盒说明书__微量法UPLC-MS-4235
中性木聚糖酶（NEX）活性检测试剂盒说明书UPLC-MS-4235100T/48S试剂名称规格保存条件缓冲液液体60mL×1瓶2-8℃保存试剂一液体5mL×1瓶2-8℃保存试剂二液体8mL×1瓶2-8℃保存标准品粉剂×1支2-8℃保存溶液的配制：标准品：10mg木糖。
临用前加入667μL蒸馏水配成100μmol/mL的标准品溶液，2-8℃保存两周。
微量法木聚糖酶(EC3.2.1.8)主要由微生物产生，能催化水解木聚糖，也被称为戊聚糖酶或半纤维素酶，可分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及β-葡聚糖，降低酿造中物料的粘度，促进有效物质的释放，以及降低饲料中的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用，因而广泛的应用于酿造和饲料工业中，中性木聚糖酶（NEX）一般分离自最适生长pH为6-8的微生物。
NEX在中性环境中催化木聚糖降解成还原性寡糖和单糖，在沸水浴条件下进一步与3,5-二硝基水杨酸发生显色反应，在540nm处有特征吸收峰，反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，通过测定反应液在540nm 吸光值增加速率，可计算NEX活力。
Xylan NEX Reducing SugarReducing Sugar+3,5-Dinitrosalicylic Acid3-Amino-5-Nitrosalicylate（540nm）注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、细胞或微生物样本发酵液的制备：发酵液于8000rpm，4℃，离心15min，取上清，置于冰上待测。
2、组织：称取约0.1g组织，加入1mL缓冲液，冰上充分研磨。
8000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。
土壤中性蛋白酶活性检测试剂盒说明书 可见分光光度法
土壤中性蛋白酶活性检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。
货号：BC0270规格：50T/24S产品内容：试剂一：液体20mL×1瓶，4℃保存；试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入10mL试剂一，沸水浴搅拌溶解后待用；试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水充分溶解待用；试剂四：液体40mL×1瓶，4℃保存；试剂五：液体10mL×1瓶，4℃保存；标准品：液体2mL×1支，0.2μmol/mL酪氨酸溶液，4℃保存。
产品说明：土壤蛋白酶参与土壤中存在的氨基酸、蛋白质以及其他含蛋白质氮的有机化合物的转化，其水解产物是高等植物的氮源之一。
土壤中性蛋白酶在中性环境下催化蛋白质水解，与土壤有机质含量、氮素及其他土壤性质有关。
中性条件下，土壤中性蛋白酶可将酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝，在680nm有特征吸收峰。
实验中所需仪器及设备：可见分光光度计、水浴锅、可调式移液枪、1mL比色皿、蒸馏水、50目筛（或更小）。
样品处理：新鲜土样自然风干或37℃烘箱风干，过30~50目筛。
操作步驟：1、分光光度计预热30min以上，调节波长至680nm，蒸馏水调零。
2、样本测定：第1页，共2页试剂名称测定管对照管标准管空白管风干土样（g）0.10.1--试剂一（μL）100100--试剂二（μL）200----混匀后，37℃反应24h，期间振荡5-6次，使土样与反应液充分接触。
试剂三（μL）200200--试剂二（μL）-200--混匀，10000rpm室温离心10min，取上清液--上清液（μL）220220--标准液（μL）--220-蒸馏水（μL）---220试剂四（μL）650650650650试剂五（μL）130130130130混匀，40℃水浴10min，10000rpm室温离心10min，取上清液于680nm下读取各管吸光值A，分别记为A测定管、A对照管、A标准管、A空白管，计算ΔA测定=A测定管-A对照管，ΔA标准=A标准管-A空白管。
蛋白(S-100B)酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书
人S100B蛋白（S-100B）酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用预期应用ELISA法定量测定人血清、血浆、脑脊液或其它相关液体中S-100B含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中S-100B水平。
用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入S-100B、生物素化的抗人S-100B抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。
TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的S-100B呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制1.酶联板：一块（96孔）2.标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为1000nmol/L，做系列倍比稀释后，分别稀释成1000nmol/L，500nmol/L，250nmol/L，125nmol/L，62.5nmol/L，31.2nmol/L，15.6nmol/L，其原液直接作为最高标准浓度，样品稀释液直接作为标准浓度0nmol/L，临用前15分钟内配制。
如配制500nmol/L标准品：取0.5ml1000nmol/L的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf 管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
3.样品稀释液：1×20ml/瓶。
4.检测稀释液A：1×10ml/瓶。
5.检测稀释液B：1×10ml/瓶。
6.检测溶液A：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液A1：100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。
如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
7.检测溶液B：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液B1：100稀释。
AS中性蛋白酶生产条件的优化及活力的测定
实验四AS1.398中性蛋白酶生产条件的优化及其活力的测定一、目的1、熟悉微生物酶制剂的生产过程2、掌握酶活力的检测方法3、掌握确定最佳培养条件的方法二、原理中性蛋白酶为水解酶的一种，可以将蛋白质水解成为氨基酸，是我国蛋白酶产量最大的酶制剂品种，主要应用于皮革加工工业和食品工业。
本实验使用枯草杆菌AS1.398在实验室中模拟发酵生产中性蛋白酶酶制剂过程，确定以玉米粉、豆饼粉等为碳源氮源的培养基配方等最佳产酶条件。
三、主要仪器和材料(1)摇床、培养箱、冰箱、灭菌锅、超净工作台、低速离心机、722-2000分光光度计、1/100天平、水浴锅、电热炉。
(2)枯草杆菌AS1.398、葡萄糖、玉米粉、豆浆、牛肉膏、蛋白胨、稀盐酸、氢氧化钠、酪氨酸标准液（100μg/mL，0.2 mol/L盐酸配制）、2%酪素（用pH=7.5磷酸缓冲液溶解）、0.4mol/L三氯乙酸、碳酸钠溶液（0.4mol/L）、folin-酚试剂（1N）。
四、操作步骤（一）培养基的制备及灭菌1、液体细菌培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，调节pH7.2-7.4灭菌：115℃，30分钟。
2、摇瓶培养基基础培养基：KH2PO4 1.0g , Na2HPO4 2.0 g , MgSO4·7H2O 0.8g , 牛肉膏0.7g （每1000ml）。
碳源：玉米粉4%，葡萄糖2%，氮源：豆浆3%，4%（二）培养1、菌种活化：取保存枯草杆菌斜面，转接于空白斜面上，37℃培养36h。
2、菌种一级扩大培养：取一环菌种接于装有100ml液体牛肉膏蛋白胨培养基的250ml的三角瓶中，37℃培养48小时。
3、摇瓶发酵培养：取1ml菌液分别接于A（牛肉膏蛋白胨）、B（葡萄糖2%，豆浆3%）、C（葡萄糖2%，豆浆4%）、D（玉米粉4% ，豆浆3%）、E（玉米粉4% ，豆浆4%）液体培养基中，调节培养基的pH值为7.4，37℃、240r/min培养36h。
小鼠中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)ELISA试剂盒使用说明书本
小鼠中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)ELISA试剂盒使用说明书本本试剂仅供研究使用标本：血清或血浆本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)的含量。
试验原理：NE试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知NE浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。
先将NE和生物素标记的抗体同时温育。
小鼠中性粒细胞弹性蛋白酶ELISA试剂盒洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。
再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。
产生颜色。
颜色的深浅和样品中NE的浓度呈比例关系。
试剂盒组成：自备材料蒸馏水。
加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。
振荡器及磁力搅拌器等。
安全性避免直接接触终止液和底物A、B。
一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。
实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。
操作注意事项试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。
稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
不用的其它试剂应包装好或盖好。
不同批号的试剂不要混用。
保质前使用。
使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。
使用干净的塑料容器配置洗涤液。
使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
底物A应挥发，避免长时间打开盖子。
底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。
避免用手接触，有毒。
实验完成后应立即读取OD值。
加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。
按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
样品收集、处理及保存方法血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。
使用不含热原和内毒素的试管。
收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
BCA蛋白定量试剂盒使用说明书
BCA蛋白定量试剂盒使用说明书一、产品简介BCA 蛋白定量试剂盒是一种常用的蛋白质浓度测定方法，具有操作简便、灵敏度高、准确性好等优点。
本试剂盒适用于细胞裂解液、组织匀浆、血清、血浆等多种样品中总蛋白浓度的定量测定。
二、试剂盒组成1、 BCA 工作液：A 液与 B 液按 50:1 的比例混合而成，现配现用。
2、蛋白标准品（2mg/ml）：牛血清白蛋白（BSA）溶液。
3、 96 孔板三、所需设备1、酶标仪（波长 562nm）2、移液器（量程分别为20μl、200μl、1000μl）3、涡旋振荡器4、离心机四、操作步骤1、标准曲线的绘制（1）将蛋白标准品（2mg/ml）用 PBS 或生理盐水稀释成一系列浓度梯度，如0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml、1500μg/ml、2000μg/ml。
（2）在 96 孔板中，每个浓度梯度设置 2 个复孔。
分别向孔中加入25μl 不同浓度的标准品溶液。
（3）向每个孔中加入200μl BCA 工作液，轻轻振荡混匀，37℃孵育 30 分钟。
（4）使用酶标仪在 562nm 波长下测定吸光度值（OD 值）。
（5）以蛋白浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，绘制标准曲线。
2、样品测定（1）将待测样品用 PBS 或生理盐水适当稀释（若样品浓度过高，可能会超出标准曲线范围）。
（2）在 96 孔板中，设置样品孔和空白孔（仅加25μl 稀释液和200μl BCA 工作液）。
向样品孔中加入25μl 稀释后的样品。
（3）向每个孔中加入200μl BCA 工作液，轻轻振荡混匀，37℃孵育 30 分钟。
（4）使用酶标仪在 562nm 波长下测定样品孔和空白孔的吸光度值（OD 值）。
（5）样品的蛋白浓度可根据标准曲线计算得出。
五、注意事项1、 BCA 工作液应现配现用，避免长时间放置导致失效。
Ca++Mg++-ATP 酶活性检测试剂盒说明书
BC0960 -- 第 1 页，共 4 页Ca Mg -ATP 酶活性检测试剂盒说明书可见分光光度法货号：BC0960 规格：50T/24S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 规格 保存条件 试剂一 液体30 mL×1瓶 2-8℃保存 试剂二 液体4 mL×1 瓶 2-8℃保存 试剂三 粉剂×2支 -20℃保存 试剂四 液体2 mL×1瓶 2-8℃保存 试剂五 液体3 mL×1瓶 2-8℃保存 试剂六 粉剂×1瓶 2-8℃保存 试剂七 粉剂×1瓶 2-8℃保存 试剂八 液体15 mL×1 瓶 常温保存 标准品液体1 mL×1支2-8℃保存溶液的配制：1、 试剂三：临用前取1支加入1 mL 蒸馏水充分混匀待用；现用现配。
用不完的试剂-20℃分装保存一周。
2、 试剂六：临用前加入15 mL 蒸馏水，溶解后2-8℃保存两周。
3、 试剂七：临用前加入15 mL 蒸馏水，溶解后2-8℃保存两周。
4、 标准品：10mmol/L 标准磷贮备液。
将标准品 20倍稀释，即取0.1 mL 标准品加1.9 mL 蒸馏水充分混匀，配成0.5 μmol/mL 标准磷应用液，现用现配。
5、 定磷剂的配制：按H 2O ：试剂六：试剂七：试剂八=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。
若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂根据样本量现用现配。
注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
产品说明：Ca ++Mg ++-ATP 酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中，可催化ATP 水解生成ADP 和无机磷。
根据Ca ++Mg ++-ATP 酶分解ATP 生成ADP 及无机磷，通过测定无机磷的量来确定ATP 酶活性高低。
ATP ADP + Pi注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
C1115 Caspase 3 活性检测试剂盒 说明书
A. 对于悬浮细胞：把没有诱导凋亡的对照样品和诱导凋亡的样品，600g 4℃离心5分钟收集细胞，小心吸除上清，同时
确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次。同前吸尽上清后，按照每200万细胞加入100微升裂解液的比例加入裂解
液，重悬沉淀，冰浴裂解15分钟。下转液，备用。用胰酶消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养液中。600g 4℃离心5分钟
2. Liu C, Yu K, Shi X, Wang J, Lam P, Wu R, Zhou, B. Induction of oxidative stress and apoptosis by PFOS and PFOA in primary cultured hepatocytes of freshwater tilapia (Oreochromis niloticus). Aquatic Toxicology. (2007), doi:10.1016/j.aquatox.2007.02.006.
5. Qian YF, Yao WB, Wang H, Gao XD. The Mechanism of Kaixin San Inhibiting Apoptosis in Hydrogen Peroxide2induced PC12 Cells. Chin J Nat Med. Sep.2007 Vol.5 No.5.
F. 用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度(由于裂解液中含有较高浓度的DTT，不适合采用BCA法进行蛋白浓度测 定)。这样就可以计算出一个样品单位重量蛋白中所含的caspase 3的酶活力单位。
常见问题：
1. 测定出的A405过低： A. 样品中蛋白含量太低，裂解样品时需设法使样品中的蛋白浓度接近1-3mg/ml。 B. 样品中激活的caspase水平很低。首先确认凋亡现象是否明显，如果凋亡比较明显并且确认该caspase是可以被激活 的，可以适当调节诱导细胞凋亡的时间，希望能找到一个caspase激活比较强的时间点，这样就可以检测出该caspase 的激活。可以作一时间曲线，例如诱导凋亡0、2、4、8、16和24小时，或0、1、2、4、8和16小时，或0、1、2、4、 6和8小时等。具体的诱导凋亡时间需根据具体情况而定。 C. 通过上述优化后A405还是比较低，或浓缩样品或做时间曲线比较困难，可以在测定样品时加大样品的用量，最多可 达40µl。 假设每次测定样品的用量为xµl，则： C1. 此时标准品稀释液需按如下方法配制：按照xµl裂解液加入检测缓冲液至最终体积为100µl的比例配制适量的标 准品稀释液。例如样品用量为40µl，则按照40µl裂解液加入60µl检测缓冲液，即0.4ml裂解液加入0.6ml检测缓冲液的 比例配制标准品稀释液。其余标准曲线的测定方法同上面的使用说明所述。
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中性蛋白酶活性测定试剂盒使用说明
分光光度法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号：BC2290
规格：50T/24S
产品内容：
试剂一：液体×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。
临用前加10mL蒸馏水溶解。
试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。
临用前加入10mL试剂一，沸水溶解。
试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。
临用前加50mL蒸馏水溶解。
试剂五：液体×1瓶，4℃保存。
标准品：液体×1支，0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液，4℃保存。
自备仪器和用品：
可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、1.5mL EP管和蒸馏水。
产品说明：
NP在一定的温度和中性pH条件下，催化水解蛋白质。
由于其安全无毒、水解能力强、作用范围广等特点，中性蛋白酶常用于食品、饲料、化妆品和营养保健品生产。
中性条件下，NP催化酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；在680nm有特征吸收峰。
操作过程：
一、粗酶液提取：
1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。
2.血清或培养液：直接测定。
3.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
二、测定操作：
1.分光光度计预热30min，调节波长到680nm，蒸馏水调零。
2.试剂二、试剂三和试剂四置于30℃水浴保温30min。
3.对照管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，200μL试剂二，混匀后置于30℃水浴保温10min；加入200μL试剂三，混匀后8000g，4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm 测定光吸收，记为A对照管。
4.测定管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，200μL试剂三，混匀后置于30℃水浴保温10min；加入200μL试剂二，混匀后8000g，4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm 测定光吸收，记为A测定管。
（注意与空白管不同，先加试剂三，后加试剂二）
5.空白管：取EP管，加入200μL蒸馏水，1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A空白管。
6.标准管：取EP管，加入200μL标准品，1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A标准管。
注意：空白管和标准管只需要测定一次。
三、计算公式：
1.按照样本蛋白浓度计算
NP活性单位定义：30℃每毫克蛋白每分钟水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
NP活性（nmol/min/mg prot）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷（Cpr×V1）÷T=625×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷Cpr C标准品：0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液；稀释倍数：（100+200+200）÷200=2.5；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），注意该粗酶液不能直接用于蛋白质含量测定，需要另外测定；建议称取同样质量的样品，加入1mL蒸馏水匀浆提取离心后，用本公司蛋白质含量测定试剂盒测定；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），100μL=0.1mL；T：催化反应时间（min），10min。
2.按照样本质量计算
NP活性单位定义：30℃每克样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
NP活性（nmol/min/g）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷（W×V1÷V2）÷T=625×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷W C 标准品：0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液；稀释倍数：（100+200+200）÷200=2.5；W：样品质量（g）；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），100μL=0.1mL；V2：粗酶液总体积（mL），1mL；T：催化反应时间（min），10min。
3.按照液体体积计算
NP活性单位定义：30℃每毫升样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
NP活性（nmol/min/mL）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷V1÷T=625×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）C标准品：0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液；稀释倍数：（100+200+200）÷200=2.5；V1：加入反应体系中血清或培养液体积，100μL=0.1mL；T：催化反应时间，10min。
4.按照细胞数量计算
NP活性单位定义：30℃每104个细胞每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
NP活性（nmol/min/104cell）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷（细胞数量×V1÷V2）÷T=625×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷细胞数量C标准品：0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液；稀释倍数：（100+200+200）÷200=2.5；V1：加入反应体系中粗酶液体积，100μL=0.1mL；V2：粗酶
液总体积，1mL；T：催化反应时间，10min。
注意事项：
临用前配制的试剂配制好后4℃保存，并且3天内使用完毕。