实验二+蛋白质及氨基酸的显色反应

7.浓硝酸和浓硫酸(A.R.) 8.0.1%茚三酮水溶液 9.0.3%精氨酸、0.3%组氨酸、0.5%甘氨酸 10.纯鸡蛋清 11.1%α-萘酚乙醇溶液，临用时配制 12.冰乙酸 13.次氯酸钠溶液 14.Ehrlich氏重氮试剂： 溶液 A：溶解5g亚硝酸钠于1 000mL水中。 溶液 B：溶解5g对氨基苯磺酸于1 000mL水中。 溶解后，再加入5mL浓硫酸。 A、B溶液分别保存于密闭瓶内。需用时，以1：1 的比例混合。
偶氮反应
试剂 （滴） 管号 0.3％ ％ 组氨酸 （滴） 鸡蛋清 （滴） 偶氮试 剂 20％ ％ NaOH溶 溶 液 现象记 录
1
4
8
2
2
4
8
2
反应名称 1、双缩脲反应 、
反应基团 肽键
反应产物及现 象 Cu–Cu—双缩 双缩 脲络合物（ 脲络合物（兰 紫色） 紫色） 兰紫色 黄色硝醌酸生 成 玫瑰红色产物 生成 中间生成兰紫 色环 有橙色和鲜红 色产物生成
２
0
5
0
5
3
6
３
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0
0
5
3
6
Ⅴ、乙醛酸反应 (Adamkiewica-HopkinsCole reaction)
原理 在浓硫酸存在下，色氨酸与乙醛酸反应生 成紫色物质，色氨酸在浓硫酸中与一些醛类 反应也形成有色物质。很多人用含有少量醛 杂质的冰醋酸或芳香醛等进行此反应。硝酸 根、亚硝酸根、氯酸根及过多的氯离子均能 妨碍此反应，有微量硫酸铜或 Fe３＋ 离子存 在时，可以加强色氨酸的阳性反应。
Ⅲ、黄色反应 (Xanthoproteic reaction)
原理 凡是含有苯环的化合物都能与浓硝酸作用产 生黄色的硝基苯衍生物。该化合物在碱性溶液 中进一步转化成深橙色的硝醌酸钠。 在蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基易发生 上述反应，而苯丙氨酸不易硝化，需加少量浓 硫酸催化才能呈明显的正反应。皮肤、指甲、 头发等遇浓硝酸变黄即为这一反应的结果。
Ⅳ、坂口反应 (Sakaguchi reaction)
生成的氨被次溴酸钠或次氯酸钠氧化生成氮。 该反应中过量的次溴酸钠或次氯酸钠是不利的，因 其能进一步缓慢氧化，使产物破裂分解，引起颜色 消失。但加入适量尿素可破坏过量的次溴酸钠。酪 氨酸、色氨酸和组氨酸也能降低产生颜色的强度。 甚至会阻止颜色的生成。 该反应灵敏度达 1：250 000。因此常用于定量 测定精氨酸的含量和定性鉴定含有精氨酸的蛋白质。
α-氨基酸 氨基酸 苯环、Trp、 苯环、 、 Tyr 胍基 吲哚环 酚核、 酚核、咪唑基
试剂和器材
一、试剂 1.蛋白质溶液：取5mL蛋清，用蒸馏水稀释至 100mL，搅拌均匀后，用纱布过滤。 2.0.1%茚三酮乙醇溶液：称取0.1g茚三酮，溶于 2.0.1% 0.1g 100mL95%乙醇。临用前配制。 3.尿素粉末 4.1%硫酸铜溶液 5.10%氢氧化钠溶液和20%氢氧化钠溶液 6.0.5%苯酚溶液
黄色反应
管号 材料 量 （ 滴) 浓硝酸（滴） 浓硝酸（ 现象 加入NaOH后 加入NaOH后 NaOH 现象变化 1 2 0.5％ 0.5％苯酚 鸡蛋清液 4 4 4 2 3 指甲 少许 20 4 头发 少许 20
Ⅳ、坂口反应 (Sakaguchi reaction)
原理
在次溴酸钠或次氯酸钠存在的条件下，许 多含有胍基的化合物 (如胍乙酸、甲胍、胍基 丁胺等)能与α-萘酚发生反应生成红色物质。 在20种氨基酸中唯有精氨酸含有胍基，所以 只有它呈正反应。
二、器材 1.试管及试管架 2.水浴锅 3.酒精灯 4.滤纸片 5.烘箱 6.量筒（10ml）
实验注意事项： 实验注意事项：
1、本次实验内容繁多，请做好实验报告， 并严格按步骤操作。 2、本次实验是定性实验，各种实验的 现象都可能发生，要细心观察。 3、本次实验有的试剂具强腐蚀性和刺 激性，操作时要多加小心。
实验二、 蛋白质及氨基酸 的显色反应
Department of life science
实验二、蛋白质及氨基酸的显色反应
目的和要求 1.学习和了解常用的几种鉴定蛋白质与氨基 酸的方法。 2.进一步认识氨基酸是蛋白质的基本组成 单位。
Ⅰ 、双缩脲反应 (Biurea reaction)
原理: 双缩脲反应:在碱性条件下，双缩脲与二价铜离 子作用，生成紫红色配合物的反应。当加热至 180℃左右时，两分子尿素缩合脱去一分子氨， 生成双缩脲。在肽和蛋白质分子中具有肽键，其 结构与双缩脲类似，也能发生此反应，生成蓝紫 色或紫红色的配合物。该反应常用于蛋白质的定 性或定量测定。此反应所产生颜色的深浅与蛋白 质的浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成 分无关。
用途 测蛋白质含量 鉴定蛋白质水 解 是否完全 测AA含量检验 含量检验 AA及蛋白质 及蛋白质 鉴定Trp、Tyr 、 鉴定 鉴定Arg 鉴定 测定Arg含量 测定 含量 鉴定Trp 鉴定 鉴定His、Tyr 、 鉴定
2、茚三酮反应 、 3、黄色反应 、 4、坂口反应 、 5、乙醛酸反应 、 6、偶氮反应 、
操作步骤 取2支试管，分别加入1mL 0.3%精氨酸 溶液和蛋白溶液，各加20%氢氧化钠溶液5 滴，1%α-萘酚酒精溶液2滴，次氯酸钠溶 液6滴，摇匀，放置片刻，观察出现的颜色。
坂口反应
试 剂 （滴） 管号 １ 0 0 5 5 3 6 H2O 0.3％ 蛋白质 20％ ％ ％ NaOH 精氨 溶液 酸 α －萘 NaClO 现象 酚 记录
Ⅱ 、茚三酮反应 (Ninhydrin reaction)
原理: 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应生成黄色物 质外，所有的α-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三 酮反应生成蓝紫色物质。该反应分两步进行，首 先是氨基酸被氧化，产生 CO ２ 、NH 3 和醛，而 水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所 生成之还原型茚三酮与另一个水合茚三酮分子和 氨缩合生成有色物质。
思考题
1.如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲 反应呈阴性结果，此时可对水解程度作出 什么结论? 2.能否用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的 存在? 3.白明胶对乙醛酸反应呈阴性,为什么?
操作步骤
向试管中加数滴蛋白质溶液，再加冰醋酸 (常含有少量乙醛酸或醛类)约1mL并混匀倾 斜试管，谨慎地沿着管壁加浓硫酸(AR)约 1mL，使其重迭，且勿摇匀。静置后，观察 在两液界面上出现的红紫色环，于水浴中 微热，可加快色环形成。
乙醛酸反应
试剂 （滴） 管号 白明胶 0.3％ ％ 色氨酸 （滴） 蛋白质 溶液 （滴） 冰醋酸 （ml） ） 浓硫酸 （ml） ） 现象记 录
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1
1
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5
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3
5
1
1
Ⅵ、偶氮反应 (Azo reaction)
原理 偶氮化合物 (Ehrlich氏偶氮试剂)与酚核或咪 唑环结合产生有色物质。它与酪氨酸和组氨 酸反应的产物分别为红色和樱桃红色.含有酪 氨酸和组氨酸的蛋白质也有此反应。
操作步骤
取 2支试管，分别加入0.3%组氨酸溶液和纯 鸡蛋清各4滴，再各加入新配制的重氮试剂8 滴摇匀，加入2滴20%氢氧化钠溶液，再摇匀。 过几分钟，观察颜色的形成，一般出现樱桃 红色。
Ⅱ 、茚三酮反应 (Ninhydrin reaction)
此反应的适宜pH为5-7，同一浓度的蛋白质或 氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过 大时甚至不显色。该反应十分灵敏，1：1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能显示反应，因此是一 种常用的氨基酸定量方法。
操作步骤 一、取 2支试管分别加入蛋白质溶液和0.5% 甘氨酸溶液1mL，再加0.5mL 0.1%茚三酮 水溶液混匀，在沸水浴中加热1~2min，观 察颜色由粉色变成紫红色再变蓝。 二、在一小片滤纸上滴上一滴 0.5%的甘氨酸 溶液，风干后，再在原处滴0.1%的茚三酮 乙醇溶液一滴，在微火旁烘干显色，观一支试管加 4滴0.5%苯酚溶液，再加浓 硝酸2滴，观察黄色出现，冷却后逐滴加入 10%氢氧化钠溶液，观察颜色转变为橙。 二、取一支试管加蛋白质溶液4滴及浓硝酸2滴， 由于强酸的作用，开始蛋白质形成白色沉淀， 小火加热，则沉淀变为黄色，冷却之，逐滴加 入10%氢氧化钠溶液，颜色由黄色转变成深橙 黄色。 三、剪少许指甲或头发放入试管中，加入数滴 浓硝酸，观察颜色变化。
紫红色铜双缩脲复合物分子结构为： 紫红色铜双缩脲复合物分子结构为：
操作步骤
一、取少量尿素结晶，放入干燥试管中，用微火加 热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加 热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷却后，加 10%NaOH溶液约1mL，振荡混匀，再加入 1%CuSO４ 溶液1滴，振荡之。观察出现的粉红颜 色。（避免添加过量硫酸铜，生成的蓝色氢氧化 铜能掩盖粉红色）。 二、取另一支试管，加 1mL蛋白质溶液和10%氢氧 化钠溶液2mL，摇匀，再加1%硫酸铜溶液两滴， 随加随摇，观察紫玫瑰色的出现。