土壤微生物区系的埋片观察法
土壤微生物测定方法
土壤微生物测定土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。
土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。
测定指标：1、土壤微生物量(MierobialBiomass，MB)能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。
它与土壤有机质含量密切相关。
目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。
因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。
此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。
受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。
熏蒸提取-容量分析法操作步骤：（1）土壤前处理和熏蒸（2）提取-1K2SO4（图将熏蒸土壤无损地转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol·L水比为1:4；w：v），振荡30min（300rev·min-1），用中速定量滤纸过滤于125mL塑料瓶中。
熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mlL0.5mol·L -1K2SO4提取；另作3个无土壤空白。
提取液应立即分析。
（3）测定吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管（24mmх295mm）中，准确加入10mL0.018 mol·L -1K2Cr2O7—12mol·L-1H2SO4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃磷酸浴中煮沸10min（放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，放入后温度恰好为175℃）。
土壤中微生物的分离与鉴定实验报告
Sdu微生物大实验土壤微生物的分离纯化与鉴定【实验目的】1、从各地区土壤中筛选含几丁质酶的真菌及含果胶酶的菌株；2、通过从土壤中分离纯化菌株，掌握培养基的制备与灭菌技术、微生物的筛选、分离纯化方法和无菌操作技术。
3、复习以前学过的各种染色方法，掌握生理生化试验的原理与方法。
4、掌握微生物的鉴定技术、菌种保藏技术。
【实验原理】1、微生物的分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
此次实验采取平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：a.选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部分不需要的微生物。
b.微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线法等技术来完成。
微生物的观察可以用显微镜观察其细胞形态，也可以用肉眼观察其菌落形态。
前者是微生物的显微镜观察技术，后者是微生物的肉眼观察技术。
2、霉菌：霉菌可产生复什分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。
霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。
霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约 3-10μm ），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。
观察霉菌的形态有多种方法，常用的有直接制片观察法、载玻片培养观察法和玻璃培养观察法三种方法，本实验采用载玻片培养观察法。
3、果胶酶筛选培养基：配制以果胶为唯一碳源的筛选培养基，在该培养基上，只有能分解利用果胶的菌株才能够生长，依此来从土壤中筛选出能够产果胶酶的菌株。
刚果红（Congo Red,简称CR）是一种染料，它可与果胶形成红色复合物，但并不和果胶水解后的产物发生这种显色反应，在含有果胶的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的果胶形成红色复合物。
观察土壤的方法
观察土壤的方法篇11.引言：介绍土壤观察的重要性2.观察土壤的基本方法2.1 视觉观察2.2 触觉观察2.3 嗅觉观察3.使用工具进行土壤观察3.1 放大镜3.2 显微镜3.3 土壤pH试纸4.土壤的分层观察5.记录观察结果6.结论：总结土壤观察的方法及其意义正文1.引言：介绍土壤观察的重要性土壤是植物生长的基础，它提供了植物所需的养分和水分。
因此，了解土壤的性质和状况对于农业生产和环境保护至关重要。
为了更好地了解土壤，我们需要掌握观察土壤的方法。
2.观察土壤的基本方法2.1 视觉观察：通过观察土壤的颜色、质地和结构，我们可以初步判断土壤的性质。
例如，深色土壤可能含有丰富的有机质，而浅色土壤则可能较为贫瘠。
2.2 触觉观察：通过触摸土壤，我们可以感受其湿度、松紧度和颗粒大小。
这有助于我们了解土壤的透气性和保水性。
2.3 嗅觉观察：通过嗅闻土壤，我们可以判断其是否有异味，如腥味或霉味，这可能暗示着土壤存在某些问题。
3.使用工具进行土壤观察3.1 放大镜：对于细小的土壤结构或生物，我们可以使用放大镜进行更仔细的观察。
3.2 显微镜：如果需要进一步了解土壤中的微生物和微小颗粒，我们可以使用显微镜进行观察。
3.3 土壤pH试纸：通过测试土壤的酸碱性，我们可以了解土壤的pH值，这对于确定适合种植的植物类型非常重要。
4.土壤的分层观察在观察土壤时，我们还需要注意土壤的分层情况。
不同土层的性质和成分可能会有所不同，因此我们需要分别观察并记录各层的情况。
5.记录观察结果在观察土壤的过程中，我们需要及时记录观察到的情况，包括土壤的颜色、质地、结构、湿度、酸碱度等。
这有助于我们分析和比较不同土壤的性质和状况。
6.结论：总结土壤观察的方法及其意义通过观察土壤，我们可以更好地了解土壤的性质和状况，为农业生产和环境保护提供有价值的参考。
篇21.引言：介绍观察土壤的重要性2.材料准备：列出所需的观察工具3.观察步骤：详细阐述观察土壤的方法3.1 土壤颜色3.2 土壤质地3.3 土壤结构3.4 土壤湿度3.5 土壤气味4.观察记录：描述记录观察结果的方法5.结论：总结观察土壤的主要方法和重要性正文1.引言：介绍观察土壤的重要性土壤是植物生长的基础，它对于农业生产和生态环境有着至关重要的作用。
土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏
番红 G-
显微镜下菌体呈红色者为革兰氏染色阴性细菌 (常以G-表示)，呈深蓝紫色者为革兰氏染色阳性 反应细菌(常以G+表示)。
细菌的革兰氏染色
革兰氏染色实验步骤
制片：取菌种培养液常规涂片，干燥，固定。 初染：滴加结晶紫，染色1－2min，水洗； 媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min,
相关理论知识（2）
土壤中的微生物
✓土壤是微生物生长繁殖的天然培养基 ，是 人类最丰富的“菌种资源库”。
✓不同类型的土壤、同一类型土壤的不同深 度或不同水平位置，微生物种类和数量变 化很大。
✓由于表层土壤比较干燥，且接受大量紫外 线照射，所以微生物主要分布在营养条件 良好、氧气含量比较丰富的浅土层
每克耕作层土壤含菌量十倍递减 细菌（~108）
细菌细胞的生理生化反应
目的要求
1、不同微生物对各种有机分子水解能力不同，说明 不同微生物有不同的酶系统。
2、掌握微生物大分子水解实验的原理及方法。 3、了解糖发酵原理及在肠道细菌鉴定中的作用。 4、了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的实验
原理和方法。 5、了解细菌在培养基中的生长现象及其代谢产物
大
中
小
炭疽芽胞杆菌 3-10 μm
大肠埃希菌 2-3 μm
布鲁菌 0.6-1.5 μm
细菌的革兰氏染色
注意事项
1. 涂片务求均匀，切忌过厚。 2．在染色过程中，不可使染液干涸。 火焰固定不
宜过热。 3．脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳
性菌被染成阴性菌；脱色不够，则会使阴性菌被 染成阳性菌。 4．不能选用老龄菌。
在鉴别细菌中的意义。
细菌细胞的生理生化反应
实验原理（1）
各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。不同的细 菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同，所 能发酵的类型和最终产物也不一样。不同细菌对营养的要 求不同也说明了它们有不同的合成能力。所有这些都反映 了它们有不同的酶系统。
土壤微生物的分离和观察
土壤微生物的分离和观察[适用对象]环境科学专业。
[实验学时] 3学时一、实验目的1、通过对周围环境中微生物的观察，理解无菌操作原理，了解微生物的普遍存在性。
2、通过从土壤中分离纯化微生物，掌握无菌操作技术。
二、预习与参考自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体。
人们要研究某种微生物的特性，首先须从混杂的群体中分离得到该微生物的纯培养。
也就是说培养物中说有细胞只是微生物的某一个种或株，它们有着共同的来源，是同一种细胞的后代。
稀释涂布平板法、稀释混合平板法或平板划线法是分离纯化微生物和微生物计数的常规方法。
这几种方法均不需要特殊的仪器设备，一般情况下都能顺利进行，达到好的效果。
三、实验内容1、配制肉汤蛋白胨固体培养基平板（每组15个）（1）牛肉膏5g；（2）蛋白胨10g；（3）NaCl 5g；（4）琼脂20g；（5）自来水1000mL pH 7.5，0.1MPa，121℃来菌20min。
2、无菌生理盐水（1）250mL三角瓶中加入99mL 0.9% NaCl （加20个左右的玻璃珠）；（2）250mL三角瓶中加入50mL 0.9% NaCl （作10倍稀释用）。
3、从土壤中分离和纯化微生物（1）采土样选择较肥沃的土壤，铲去表土层，挖5-20cm深度的或特殊要求的地方土壤数10g，装入灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，做好编号记录，携回实验室供分离用。
（2）制备土壤稀释液称取土样1.0g放入盛99mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，置摇床振荡5min使土样均匀分散在稀释液中成为土壤悬液（10-2）。
用1mL的无菌吸头从中吸取0.5mL土壤悬液注入盛有4.5mL无菌水的试管中，吹吸3次，振荡混匀（10-3）。
然后再用同一支1mL吸头，从此管中吸取0.5mL注入另一盛有4.5mL无菌水的试管中（10-4），依此类推制成10-5，10-6，10-7各种稀释度的土壤溶液。
4、涂布用一支1mL无菌吸头分别从稀释度10-7、10-6和10-5的土壤稀释液中各吸取0.1mL对号放入已写好稀释度的肉汤蛋白胨培养基平板上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。
土壤微生物测定方法
土壤微生物测定方法
目前常用的土壤微生物测定方法主要包括直接计数法、培养法、DNA
分析法和生化方法等。
1.直接计数法：直接计数法是指通过显微镜观察和计数土壤中微生物
的数量。
这种方法简单直观，可以快速测定土壤中微生物的数量。
但是，
由于土壤微生物数量庞大，直接计数方法需要大量的样品和时间，且对操
作者的要求较高。
2.培养法：培养法是指通过将土壤样品接种在富含营养物质的培养基上，并在一定温度和湿度下培养一段时间，通过观察和计数可见的菌落来
测定土壤中微生物的数量和种类。
这种方法可以有效地测定土壤中常见的
细菌和真菌等，但是对于无法培养的微生物种类相对有限。
3.DNA分析法：DNA分析法是指通过提取土壤中微生物的DNA，并通
过PCR扩增和DNA测序等技术来测定土壤中微生物的种类和多样性。
这种
方法可以检测到所有存在的微生物，无论是否可以培养。
因此，DNA分析
法可以更全面地测定土壤中微生物的多样性和种类。
但是，这种方法对实
验条件和技术要求较高。
4.生化方法：生化方法是指通过测定土壤中微生物代谢产物的含量或
活性来测定土壤中微生物的数量。
例如，通过测定脲酶、葡萄糖酶、氧化
还原酶等土壤微生物常见的酶活性来评估微生物的活性和数量。
生化方法
可以快速测定土壤微生物的数量和活性，但是受土壤理化性质的影响较大。
总之，以上所述的方法各有优缺点，可以根据实际情况选择合适的方
法或多种方法相结合来测定土壤微生物的数量和多样性。
此外，测定方法
的选择还要考虑实验所需的样品数量、可行性和经济性等因素。
土壤微生物研究方法
第二节 土壤微生物的计数与分析
• 一、培养计数法
•
根据培养基上所生长微生物的数量来 估算土壤中微生物的数量的方法
（一）一般微生物的分离与计数
• 稀释平板法
• 最大或然数法（MPN稀释法） • 土粒法
• 稀释平板法：
•
用已知质量的土壤在适量的溶液中搅拌的时候，微生 物和土壤分离，这些分开的微生物细胞在营养琼脂平板上 生长成为分散的菌落，根据菌落数换算得单位重量土壤中 微生物的数量。土壤中微生物的数量很多，因此必须取少 量样品制成土壤悬液，然后稀释，使发育在培养皿中的菌 落可以很好地分散开
测定是微生物在与野外环境完全不同的溶液 中的代谢活性，因此，也不能确定它的结果能 否反映土壤区系的实际代谢情况；
二、土壤微生物结构多样性分析
• 磷脂脂肪酸法也称为PLEA法 • （phospholipid fatty acid 法）； • 磷酸脂肪酸是所有微生物细胞膜磷脂的组分，具有结构多 样性和较高的生物学特异性，用磷酸脂肪酸作为标记物来 研究鉴别土壤微生物群落结构多样性变化。
?土壤微生物细胞利用31种碳源进行代谢以代谢过程产生的酶与四唑类显色物质如种碳源进行代谢以代谢过程产生的酶与四唑类显色物质如ttctv发生颜色反应的浊度差异为基础运用独有的显性排列技术分析土壤微生物的代谢特征指纹图谱反映不同环境条件引起的土壤微生物群落变化发生颜色反应的浊度差异为基础运用独有的显性排列技术分析土壤微生物的代谢特征指纹图谱反映不同环境条件引起的土壤微生物群落变化?biolog测试板含有96个小孔除对照外其余孔内分别含有不同的有机碳源和一种指示剂通过接种菌悬液根据微生物对碳源利用时指示剂颜色变化差异来鉴定微生物群落功能多样性个小孔除对照外其余孔内分别含有不同的有机碳源和一种指示剂通过接种菌悬液根据微生物对碳源利用时指示剂颜色变化差异来鉴定微生物群落功能多样性该法优点?灵敏度高分辨力强?无需分离培养纯种微生物可以最大限度地保留微生物群落原有的代谢特征无需分离培养纯种微生物可以最大限度地保留微生物群落原有的代谢特征?测定简便数据读取与记录可以由计算机辅助完成测定简便数据读取与记录可以由计算机辅助完成?可以连续监测微生物的变化可批量分析该法缺点?特别依赖于群体生理活性不能监测休眠体也不能检测那些不能利用特别依赖于群体生理活性不能监测休眠体也不能检测那些不能利用biolog碳源底物的群体
土壤微生物生物量测定方法
土壤微生物生物量测定方法
土壤微生物生物量的测定方法有很多种，一般可以分为直接和间接测定方法。
直接测定方法包括：
1. 水解法：将土壤样品经过水解处理，然后通过高密度离心和显微镜观察计数获得微生物生物量。
2. 利用滴定法：通过向土壤中添加抑制剂或适宜的滴定液，测定细菌和真菌的数量以确定生物量。
3. 融解法：将土壤样品与溶解剂混合，在特定温度下溶解土壤中的微生物，然后通过测定溶液中的生物量来计算土壤中的微生物生物量。
间接测定方法包括：
1. 培养基测定法：将土壤样品接种到特定的培养基中，利用培养基中微生物生长所需的营养物质来测定微生物生物量。
2. 脂肪酸测定法：通过提取土壤样品中的脂肪酸，并利用气相色谱仪测定来确定微生物的生物量。
3. 磷脂酸测定法：通过提取土壤中的磷脂酸，并利用色谱或质谱仪测定磷脂酸来估计微生物生物量。
这些方法各有优缺点，选择适合的方法需要考虑实验条件、样品处理的方便程度
和测定结果的准确性。
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• 剖面刀 • 孟加拉红酚染色液：称取1.0g孟加拉红和
0.3g CaCl2加入100mL5%酚水溶液内。 • 显微镜、镜头油、二甲苯等。 • 电炉、水浴锅、载玻片支架。
2020/7/25
实验程序
• 埋片制备 • 取出埋片并染色 • 显微镜观察
2020/7/25
实验程序Ⅰ
（埋片制备）
• 制备土样 称取待测土壤100g，每组2份，其中1份加入有 机质1g，充分混匀后装入瓷钵，另一份作对照 ，并调节湿度。
• 用剖面刀在土壤中划一缝，将清洁的载玻片垂 直地插入土内，露出土面2cm左右。每钵插2 片，贴好标签，用塑料布覆盖，以防土壤干燥 ，放入280C恒温室培养。
2020/7/25
实验程序Ⅱ
（取出埋片并观察）
• 上述材料培养1星期后取出载玻片。 • 用水浸洗载玻片，以去除大的土粒，将载玻
片风干。 • 将风干载玻片置于沸水浴上，用孟加拉红染
2020/7/25
土壤微生物区系的埋片观察法
• 目的要求 • 实验材料 • 实验程序 • 思考题
2020/7/25
目的要求
• 学习观察和鉴别土壤环境中微生物 的一种方法。
• 了解土壤环境中某些微生物的排列 和空间分布状态，微生物之间以及 微生物与土粒之间的相互关系。
2020/7/25
实验材料
• 供试土壤。 • 直径为10cm高为8—10cm左右的瓷钵2个。 • 洁净的载玻片，4片。 • 加入土壤的有机质（如蛋白胨、豆饼粉或其
• 比较加与不加有机质土壤，埋片观察微生物 外貌的差异。
2020/7/25
思考题
• 进行埋片观察土壤生物区系应注意哪 些
液热染10min，边蒸边染，以防染液蒸干。 • 水洗、晾干载片，待镜检。
2020/7/25
实验程序Ⅲ
（显微镜观察）
• 在油镜下，检出细菌和其它微生物，凡是深 红色和红色的为微生物菌体；呈黄色、浅粉 红色的或褐色的为惰性有机物；而矿物颗粒 不着色，
• 在油镜下仔细观察微生物细胞的密度，特有 的群体，微生物间相互关系，微生物和土壤 间的关系。