实验一 细菌的单染色及油镜的使用
试验显微镜油镜的使用和保养试验目的1学会显微镜油镜的使用
实验一、显微镜油镜的使用和保养[实验目的]1. 学会显微镜油镜的使用与保养方法。
2. 学会认识细菌的基本形态与特殊结构。
[油镜的原理]由于油镜的透镜很小，自标本玻片透过的光线因介质密度（从载物玻片到空气，再进入油镜）的不同，部分光线因发生折射而散失（如下图A—A‘），不能进入透镜，致使射入的光线较少，物像呈现不清。
当在油镜与标本片之间加镜油后（镜油的折光率为1.515和玻璃的折光率1.52相近似），从而减少了光线通过标本片与油镜之间空气（折光率1.0）引起的散光现象，增加了进入透镜的光线（如下图中C—C‘），使视野的明亮度加强，物像可看清楚，此外，加用镜油能增加油镜的数值孔径，提高显微镜分辨能力。
油镜加香柏油的原理[实验内容]（一）显微镜的使用材料显微镜，镜油（香柏油），擦镜纸，玻片标本。
方法1．检查：使用前必须对所用显微镜进行详细检查，如发现问题应及时向老师报告。
2．调光：检查未染色标本时，以弱光线为宜，此时可将集光器下降或缩小光栅，检查染色标本时，以光线强为宜，此时应适当升高集光器或将光栅打开。
3．标本观察：将标本置于载物台上，先用低倍镜观察。
用粗调节器调至看出物象后，再调节细调节器，使物像更加清晰。
在换高倍镜观察前，鉴于高倍镜视野范围比低倍镜小，故须将被观察内容移至视野中央后再换之。
（二）油镜的使用和保养1．油镜头的识别：油镜头上一般刻有100×、或Oil、油等标记。
2．油镜的使用方法：（1）将显微镜直立于桌上，不要扳动倾斜关节，使载物台保持水平。
（2）对光：用低倍镜对光，检查染色标本时光线宜强。
要抬高集光器，放大光圈。
（3）滴加香柏油一小滴于染色标本片上，将标本置于载物台上，移置待检部分于接物镜下。
（4）换用油镜，眼睛从侧面看着物镜，转动粗调节器，使镜筒下降至油镜头浸入镜油并几乎接触标本片。
（5）左眼看接目镜，一面观察，一面缓慢转动粗调节器，使镜筒上升，直到观察到模糊的物像时，再适当转动细调节器，使物像完全清晰，即可正式观察。
1-1-3 实训 细菌染色技术
革兰氏染色法的原理： ①G+菌等电点(pH2～3)比G-菌等电点(pH4～ 5)低，在同一pH条件下G+菌比G-菌所带负 电荷多，因此与带正电荷的碱性染料结合 力强，不易脱色； ②G+菌体内含有大量核糖核酸镁盐，可与进 入体内的结晶紫、碘液等牢固结合成大分 子复合物。G-菌含核糖核酸镁盐很少，故 易被脱色； ③G+菌细胞壁结构致密，肽聚糖层厚，含脂 质少，乙醇不易渗入脱色；G-菌细胞壁结 构疏松，肽聚糖层薄，含脂质多，乙醇容 易溶解脂类而渗入使之脱色。
实训 细菌染色技术
（一）实训目的 1.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类 鉴定中的重要性。 2.熟悉细菌涂片、染色的基本技术。 3.掌握细菌的简单染色与革兰氏染色法，并 进一步掌握油镜的使用方法。
（二）实训原理
染色法 单染色：仅用一种染料着色； 复染色：用两种或两种以的 染料着色。
复染色法中较为常用的是革兰氏染色。
（三）材料和用具 细菌：大肠杆菌和金黄色葡萄球菌 18～24h培养物。 试剂：香柏油、二甲苯、生理盐水、 吕氏美蓝染色液、草酸铵结晶紫染色 液、碘液、95%乙醇、稀释的石炭酸 复红染色液。 其他：显微镜、酒精灯、载玻片、接 种环、擦镜纸、吸水纸、火柴等。
（四）操作步骤
1．细菌的单染色法
1．细菌的单染色法 （1）涂片 取洁净无油渍的玻片一张，将接种环在 酒精灯火焰上烧灼灭菌后，取1～2环无菌生 理盐水，放于载玻片中央，再将接种环灭菌、 冷却后，从固体培养基上取少许菌落或菌苔 与生理盐水混匀，作成直径1cm的涂面（如 液体培养物，可取一环直接涂于玻片上即 可）。接种环用后在火焰上灭菌，杀死残留 的细菌。 （2）干燥 涂片应在室温下自然干燥，必要时将涂 面向上，置酒精灯火焰高处微烤加热烘干， 但切忌直火加热，避免细菌变形。
革兰氏染色及油镜的使用
经此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌
为革兰氏阳性菌；细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染 上复染剂的颜色（红色）的细菌为革兰氏阴性菌。
Gram stain of Gram -
Gram stain of Gram +
细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分 和结构不同而造成的。初染后，所有细菌都被染成初染剂的 蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫—碘的 复合物，增强染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，革 兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁 厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层 的网状结构孔经缩小，透性降低，从而使结晶紫—碘的复合 物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染 剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层 较薄、类脂质含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶 解，细胞壁透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗 脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
• 油镜原理及说明
• 微生物是个体微小、结构简单、肉眼 无法看到的微小生命体。因此，我们要借 助显微镜来进行观察。显微镜的种类很多， 但基本构造可分为两大部分 ：一是机械装 置，二是光学系统。（下面以普通光学显 微镜为例）。
• 1、机械装置由镜座、镜臂、镜筒与物镜转移 器、载物台、移动器粗细调节器组成。
实验一 革兰氏染色及油镜的使用
一 目的要求： 1、学习并初步掌握革兰氏染色法。 2、了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类 鉴定中的重要性。
3、掌握油镜原理及使用方法。
二 基本原理： 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain
Gran 创立的，基本步骤是： 1、初染：结晶紫染色 2、媒染：碘液媒染 3、脱色：乙醇脱色 4、复染：番红复染
环境微生物实验问题与答案
环境微生物实验问题与答案一、光学显微镜的操作及细菌单染色1、为什么油镜的放大倍数比普通物镜大？答：油镜能减少光的折射，进而提高视野的亮度；通过提高显微镜的数值口径增加显微镜的分辨力。
2、数值口径的表达公式？答案：N.A=n ×sin α，n为介质折射率；α为光线最大入射角的半数。
3、显微镜数值口径与分辨力的关系？答案：分辨力是指显微镜能辨别两点之间最小距离的能力，它与光的波长成反比，与数值口径成正比。
4、油镜的使用与普通物镜有何不同？答案：油镜必须借助于光折射率等于或接近于玻璃的试剂，如香柏油等才能使用，而普通物镜则不需要；油镜是由100×物镜与香柏油构成，而普通物镜则限于10×物镜、40×物镜等。
5、使用油镜时应特别注意什么？答案：上下调节镜头时应使用微螺旋，否则容易损坏镜头；应使油镜始终浸泡在香柏油中，否则就不是油镜；使用完毕后，必须用搽镜纸沾取二甲苯等有机溶剂搽去残留的油迹，否则会玷污油镜。
6、单染色的原理是什么？答案：主要基于微生物细胞能与各种染料进行不同程度地结合。
7、单染色过程中，为什么干燥固定？答案：因为通过干燥可以使菌体蛋白变性，细胞质凝固，进而可以使菌体紧密地附着于载玻片表面。
8、单染色过程中，为什么水洗时水流要缓慢地从载玻片上端流下？答案：因为如果水流直接冲洗有菌部位，容易使菌体被冲洗掉。
9、为什么载玻片要完全干燥后，才能使用油镜？答案：因为香柏油与水不相溶，容易造成光线发生折射或散射，一方面无法构成油镜，另一方面也会降低视野的亮度。
二、放线菌形态观察与细菌革兰氏染色1、革兰氏染色的原理是什么？答案：对于G+细菌来说，当用乙醇脱色时，由于肽聚糖含量高，网孔小，再加上脂量低，所以乙醇脱色后，进一步地缩小了网孔，结晶紫-碘复合物无法脱出，第二次用番红染色时无法着色，进而呈紫色；对于G-细菌来说，当用乙醇脱色时，由于肽聚糖含量低，网孔大，再加上脂量高，所以乙醇脱色后，进一步地扩大了网孔，结晶紫-碘复合物被脱出，第二次用番红染色时着色，进而呈红色。
01油镜的使用和细菌的简单染色法
率。
：
镜口角（即入射角）。
普通光学显微镜Ⅲ
油镜使用的原理
油镜，即油浸接物镜。当光 线由反光镜通过玻片与镜头 之间的空气时，由于空气与 玻片的密度不同，使光线受 到曲折，发生散射，降低了 视野的照明度。若中间的介 质是一层油（其折射率与玻 片的相近），则几乎不发生 折射，增加了视野的进光量， 从而使物象更加清晰。
5.观察完毕，取下标本片，立即用擦镜纸顺一 个方向旋转擦拭镜头上的油。若油已干，应 先用二甲苯滴在擦镜纸上擦净镜头，再用另 一干净擦镜纸拭去镜头上沾有的二甲苯;
6.显微镜擦净后，降低物镜并将其转成八字形， 集光器下降，光圈关上，关闭电源，罩上显 微镜罩
油镜使用注意事项
油镜的识别：油镜头上都有标记；标有100×；镜头 前端有黑、白或红色的圆圈；刻有“III”或Oil等，其 入光孔径也较其他物镜小；
普通光学显微镜Ⅱ
显微镜的放大倍数和分辨率
1.放大倍数=接物镜放大倍数×接目 镜放大倍数
2. 显微镜的分辨率 是表示显微镜
辨析物体（两端）两点之间距离的
能力，可用公式表示为：
D=λ/2n·sin(α/2 )
式中D：物镜分辨出物体两点间的
最短距离。
：可见光的波长（平均0.55m)
n: 物镜和被检标本间介质的折射
常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、石炭酸复红等。
实验材料
菌种 产气杆菌营养琼脂斜面培养物； 金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面培养物
试剂 结晶紫染液、石炭酸复红染液、香柏油、二甲苯、无菌 水
仪器及其它 显微镜、酒精灯，载玻片，接种环，擦镜纸等。
实验流程
制备细菌染色装片
油镜观察
实验步骤
1、 用简单染色法制备细菌染色装片 涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥
experiment1单染色和革兰氏染色
四、实验方法
1、简单染色：
▪ （1）涂片：注意取菌不要太多。 ▪ （2）晾干：自然晾干。 ▪ （3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过
火焰2-3次固定（以不烫手为宜） ▪ （4）染色：涂片加美兰染色1-2min。 ▪ （5）水洗：水洗背冲涂片 ▪ （6）干燥：自然晾干或用吸水纸吸干。 ▪ （7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出
▪ G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质， 而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱 色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初 染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被 脱色，再经番红复染后就成红色。
▪ G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含 量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小， 通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
▪ 当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌 所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚 果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合 物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。
▪ 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram创 立的。作为细菌学上最常用最重要的鉴别染色法， 革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌 （G+）和革兰氏阴性菌（G－）两大类。
无色，立即水洗。
▪ （5）复染：滴加番红复染2min，水洗。 ▪ （6）镜检：干燥后，油镜镜检观察。 ▪ （7）混合涂片法：三区法染色
五、实验报告
▪ 给出枯草杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌形态图，并注明其革兰氏 染色反应。
六、注意事项（思考题）
▪ 1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰 氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革 兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短受 涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。
实验一 细菌的单染色及油镜的使用
而不是直接用高倍镜或油镜观察？
内容回顾
一、原理 显微成像原理 油镜使用原理 单染色原理
二、技术和方法 无菌操作技术 制片和单染色方法 显微镜使用方法
实验一 细菌的单染色及 油镜的使用
实验目的 实验原理 实验材料 实验步骤 实验结果 问题与讨论
一、实验目的
学习并掌握普通光学显微镜的构造和油 镜的使用技术及维护的基本知识
学习微生物涂片、单染色的基本技术 初步认识细菌的形态特征， 学习简单的无菌操作技术
二、实验原理1
显微镜的构造
1.放大倍数：物镜放大倍数×目镜放 大倍数 2. 显微镜的分辨率:是表示显微镜辨 析两点之间距离的能力。可用公式 表示为：
D=λ/2n·sin(α/2 )
式中D：物镜分辨出物体两点间的最 短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) n: 物镜和被检标本间介质的折射率。 ：镜口角（即入射角）。
D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰
1.光学部分:目镜 、 物镜 、 照明装置(聚光镜、 虹彩光 圈、 反光镜等)。它使检视 物放大,生成物象。
2.机械部分:镜座、镜臂、镜筒、 物镜转换器、载物台、载物台 转移器、粗调节器、细调节器 等部件.它起着支持 调节 固定 等作用.
倒立的虚像
图1-1-2 光学显微镜的成像原理
显微镜的放大倍数和分辨率
滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。 3.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。 4.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然
后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残 留的二甲苯，后将镜体全部复原。
微生物学实验报告
微生物学实验报告(格式标准)(生命科学专业)教师:黎勇目录索引实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 3实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 5实验三常用培养基的配制7实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别8实验五、微生物大小的测定与显微计数10实验六环境中微生物的检测与分离纯化11实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应12实验八(综合实验)化能异养微生物的分离与纯化13课程名称: 微生物学实验班级:化生系生命科学本科实验日期: 指导教师:黎勇实验一油镜的使用与细菌的简单染色法〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术;观察细菌的基本形态;学习观察细菌的运动性的基本方法。
〔基本原理〕1、 N·A=n·sinα2、 D=λ/2N、A3、目镜可提高放大倍数,但有效放大率取决于镜口率。
已经分辨的物体不放大瞧不清,未分辨物放得再大也瞧不清。
4、用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时,可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。
〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸;细菌、放线菌等固定装片;培养18小时左右的B、subtilis、 S、arueus 菌斜面培养物;无菌水、生理盐水。
〔方法步骤〕:(一) 油镜的使用镜检装片在中倍(或高倍镜)下找到目的物,并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置,虹彩光圈开到最大,镜头转开成八字形在玻片的镜检部位(光斑处)滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台(缩短镜头与装片距离,镜头浸入油中,至油圈不扩大为止镜头几与装片接触) 粗调器徐徐下降载物台(密切注视视野,当捕捉到物像时,立即用细调器校正) 仔细观察并绘图取出装片,清洗油镜:擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留(用手指辅助,迅速拭擦一、二次) 用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯(2-3次)。
(二) 细菌的简单染色法:涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察(三) 细菌运动性的观察取洁净盖玻片,四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察〔结果分析〕1、画一圆圈表示视野,选取所观察的微生物绘图,注意特殊结构、形状与排列。
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三、口腔微生物的观察
1.在洁净无油腻的载片中央滴一小滴无菌水，用牙签取牙垢少许 与水滴充分混匀，涂成薄膜。 2.将涂片于室温中自然干燥后，按单染色法的步骤，进行固定、 染色、水洗，干燥后镜检。
四、细菌的特殊形态结构
芽孢：休眠体，不利环境下产生，耐受各 种极端环境。 荚膜：多糖，包裹在菌体外围，保护菌体 鞭毛：运动，菌落形态。
D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰
油镜使用的原理
油镜，即油浸接物镜。当光 线由反光镜通过玻片与镜头 之间的空气时，由于空气与 玻片的密度不同，使光线受 到曲折，发生散射，降低了 视野的照明度。若中间的介 质是一层油（其折射率与玻 片的相近），则几乎不发生 折射，增加了视野的进光量， 从而使物象更加清晰。
枯草杆菌芽孢的观察
细菌鞭毛的观察
细菌荚膜的观察
荚膜
五、实验结果
用油镜观察大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以 及口腔微生物的染色标本，并绘图。 绘图表示芽孢、荚膜、鞭毛的形态特征。
六、问题与讨论
1.涂片为何要固定？ 固定加热时间过长会怎样？ 2.使用油镜时，为什么必须用香柏油？ 3.镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而 不是直接用高倍镜或油镜观察？
三、实验材料
双筒普通光学显微镜 蕃红（沙黄）和美兰染色液。 培养24h的大肠杆菌（E.coli)和枯草芽 孢杆菌 载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二 甲苯、擦镜纸、吸水纸和镊子等。
四、实验步骤
一、制作大肠杆菌观察片
现场演示
涂片
无菌操作
干燥
固定
染色
水洗
干燥
镜检
细菌的单染色
涂片 干燥 固定
本次实验课结束
请确保油镜头擦拭干净！
根据公式D=λ/2n·sin(α/2
) ，增大分母，使得D值
减小，分辨率增大。
显微镜保养和使用中的注意事项
1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布， 以保证光洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜， 最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用 油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻 片或损伤镜面。 4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜 座，不可单手拿，更不可倾斜拿。 5.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生 霉菌而腐蚀镜片。
水洗、吸干 镜检 染色1~2min
二、显微操作
现场演示
1.低倍镜观察：粗调、细调。依次再进行中倍、高倍观察 2.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央 滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。 3.换片：另换新片，必须从第1条开始操作。 4.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然 后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残 留的二甲苯，后将镜体全部复原。 注意：油镜使用完毕后一定要用二甲苯擦拭镜头
食品微生物学实验
李文亮
课堂纪律
严格遵守实验室规章制度 严肃课堂纪律 不允许无故旷课、早退 迟到 工作服
实验室安全和卫生
安全 实验室严禁吸烟。 注意用水、防电和防火 正确使用化学试剂和仪器
卫生
每次实验需留下4位同学值日，协助保 持实验室清洁
实验报告
姓名、班级和学号
实验题目
实验原理
实验操作
实验结果
画图 文字描述
分析和讨论
思考题
实验一
细菌的单染色及 油镜的使用
实验目的 实验原理 实验材料 实验步骤 实验结果 问题与讨论
一、实验目的
学习并掌握普通光学显微镜的构造和油镜 的使用技术及维护的基本知识 学习微生物涂片、单染色的基本技术
初步认识细菌的形态特征， 学习简单的无菌操作技术
二、实验原理1
显微镜的构造
1.光学部分:目镜 、 物镜 、 照明装置(聚光镜、 虹彩光 圈、 反光镜等)。它使检视 物放大,生成物象。
2.机械部分:镜座、镜臂、镜筒、 物镜转换器、载物台、载物台 转移器、粗调节器、细调节器 等部件.它起着支持 调节 固定 等作用.
倒立的虚像
图1-1-2 光学显微镜的成像原理
油镜的使用
待后边演示
二、实验原理2
细菌的单染色
细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。利 用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背 景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和 结构。 染色前必须固定细菌，其目的是： 一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。 二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和自然 风干固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。
显微镜的放大倍数和分辨率
1.放大倍数：物镜放大倍数×目镜放
大倍数 2. 显微镜的分辨率:是表示显微镜辨 析两点之间距离的能力。可用公式 表示为：
D=λ/2n·sin(α/2 )
式中D：物镜分辨出物体两点间的最 短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) n: 物镜和被检标本间介质的折射率。 ：镜口角（即入射角）。