酶的固定化
酶与细胞的固定化
发酵液中含菌体少，有利于产品的分离纯化，提高产品质量等
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
• 缺点：酶与载体相互作用力弱，酶易脱落等 1）引入功能团和间隔臂；
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方 固定化后酶的哪些主要性质发生了变化?变化的趋势及原因分析.
常见非共价法?常见共价法?
法。 少量的持续不断的配基的脱落;
交联法由于不需要活化基团,所以条件比较温和,酶活的回收率比较高? 活力回收:指固定化后固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分比. 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。颗粒状占 绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产 ，薄膜主要用于酶电极。酶管机械强度较大 ，主要用于工业生产。
固定化酶的优势：
① 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶 液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
② 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱 连续反应
③ 酶反应过程能够加以严格控制； ④ 较游离酶更适合于多酶反应； ⑤ 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ⑥ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ⑦ 酶的使用效率提高、成本降低。
在中性pH下优先与a-氨基反应,因此有一定的选择性 缺点：在包埋过程发生的化学反应同样会导致酶的失活。
• 优点：酶活性中心不易被破坏，酶高级结构 二、载体活化程度和固定化配基密度的测定
固定化过程中，酶分子空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。
酶与细胞的固定化课件.ppt
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶的热稳定性
固定化果胶酯酶的pH稳定性
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶作用的最适温度
固定化果胶酯酶作用的最适pH值
5、酶的动力学特征 固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 二者电荷不同，因静电作用，固定化酶的表观Km值低于溶液的Km值； 电荷相同，由于亲和力降低，固定化酶的表观Km值显著增加。
Cefaclor(R1=H,R3=Cl) Cephalexin(R1=H,R3=Me) Cefadroxil(R1=OH,R3=Me)
酶促合成头孢类抗生素
CHCOOCH3 + H2N
NH2
O
S
Synthetase
N CH3
COOH
Esterase
CHCOOH +
NH2
CHCONH
NH2 O
S
N CH3
交联法有2种形式即酶直接交联法和酶辅助蛋白交联法。
酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。 固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间 的平衡。
酶辅助蛋白交联法：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起 酶失活，可使用第二个"载体"蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、 血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。
二、固定化酶和固定化细胞的性质与表征 （一）固定化酶的性质 1、酶的活性 多数情况下固定化酶的活力常低于天然酶。原因：酶结构变化与空间
位阻。
2、酶的稳定性 大多数固定化酶具有较高的稳定性、较长的操作寿命和保存寿命。
酶固定化技术的方法
酶固定化技术的方法
酶固定化是将酶与载体物质结合在一起，以增强酶的稳定性和重复使用性的技术。
常见的酶固定化方法包括以下几种：
1. 吸附固定化：将酶溶液与载体物质（如活性炭、陶瓷颗粒）接触，酶分子通过吸附作用与载体物质结合。
2. 凝胶固定化：将酶溶液与凝胶物质（如明胶、琼脂）混合，酶通过物理交联或化学交联与凝胶物质牢固结合。
3. 包埋固定化：将酶溶液与聚合物物质（如聚乙烯醇、明胶）混合，然后通过共混或交联反应，使酶被包裹在聚合物内部。
4. 共价固定化：将酶溶液与活性基团多的载体物质（如硅胶、纳米颗粒、聚乙二醇）反应，形成酶与载体物质之间的共价键连接。
5. 薄膜固定化：在载体表面形成一层薄膜，然后将酶与薄膜固定在一起，常见的方法有溶液浸渍、层层自组装等。
这些方法各有优缺点，选择合适的固定化方法应根据具体的酶性质、应用需求和实际操作条件进行综合考虑。
酶和辅酶的固定化及辅酶再生的研究
酶和辅酶的固定化及辅酶再生的研究标题：酶和辅酶的固定化及辅酶再生的研究导言：酶是生物体内非常重要的催化剂，能够加速化学反应的速率。
然而，酶在自由状态下使用存在一些限制，如易受温度、pH和抑制剂的影响等。
为了克服这些限制，研究人员开始探索酶的固定化技术，其中一种关键的固定化方法是将酶和辅酶结合起来，并寻求方法再生辅酶以提高酶的可持续使用性。
本文将深入探讨酶和辅酶的固定化方法以及辅酶再生的研究成果。
主体：1. 酶的固定化方法1.1 物理吸附固定化1.2 包埋固定化1.3 共价键结合固定化2. 辅酶的选择与固定化2.1 辅酶的种类与功能2.2 辅酶的固定化方法3. 辅酶再生的研究3.1 生物辅酶再生技术3.2 化学辅酶再生技术4. 酶和辅酶固定化的应用4.1 工业生产中的应用4.2 医学和生物技术领域的应用5. 对酶和辅酶固定化研究的观点和理解1. 酶的固定化方法酶的固定化技术是将酶通过不同的方法固定在固体载体上，以增强其稳定性和可重复使用性。
1.1 物理吸附固定化是一种简单的方法，将酶通过物理吸附作用固定在载体表面。
然而，物理吸附固定化的稳定性较低，容易受到环境因素的影响。
1.2 包埋固定化是将酶包裹在多孔载体内部，形成一种保护层，提高了酶的稳定性和抗环境因素的能力。
1.3 共价键结合固定化是通过共价键将酶与载体结合，形成较为牢固的固定化结构，提高了酶的稳定性和耐受性，但可能影响酶的活性和底物转化效率。
2. 辅酶的选择与固定化辅酶是酶催化反应过程中的辅助分子，可以与底物结合并催化其转化。
常见的辅酶包括辅酶A、辅酶NAD+等。
选择合适的辅酶并进行固定化，可以进一步提高酶的催化效率和稳定性。
2.1 不同辅酶的种类具有不同的催化功能，如辅酶A在能量代谢中起到重要作用，辅酶NAD+在氧化还原反应中起到关键作用，这些特性对选择合适的辅酶进行固定化具有指导意义。
2.2 辅酶的固定化方法包括共价键结合固定化、交联固定化等，这些方法可以使辅酶与酶固定化结构相连，提高催化效率和稳定性。
固定化酶的三种方法
固定化酶的三种方法固定化酶是把酶结合到一定的表面上，使其失去活性的过程，因此可以用来改变酶的性质、增加酶的稳定性和提高酶的反应效率。
固定化酶的三种方法是物理化学固定化、生物化学固定化和免疫化学固定化。
一、物理化学固定化物理化学固定化是一种将未固定化酶与支架分子相互作用，使酶与支架分子结合，形成可操作的固定化酶系统的方法。
其基本原理是通过多种物理、化学或生物学方法，将酶与支架分子进行结合，从而形成一个可操作的固定化酶系统。
物理化学固定化可以大大提高酶的反应活性、稳定性和重复利用性，并可以改变酶的特性。
常用的物理化学固定化方法有水解结合、热结合、冷结合、电结合、化学结合、离子结合和生物结合等。
二、生物化学固定化生物化学固定化是指将酶与生物聚合物结合，使酶形成可操作的固定化酶系统的方法。
其基本原理是在酶表面分子和支架分子之间形成一种亲和力，使得酶和支架分子之间形成紧密的结合。
生物化学固定化的优势在于，它可以改变酶的特性，使酶更加稳定和可操作，而且不必进行大量的实验，可以节省时间和费用。
常用的生物化学固定化方法有抗体结合法、抑制剂结合法和蛋白结合法等。
三、免疫化学固定化免疫化学固定化是一种将酶与抗体结合，形成可操作的固定化酶系统的方法。
其基本原理是将酶和抗体进行结合，从而形成一个稳定的固定化酶系统。
免疫化学固定化具有较强的特异性，可以在具有极强抗性的环境中实现高效固定化；且不仅能实现酶的固定化，还可以改变酶的特性，使酶更加稳定和可操作。
常用的免疫化学固定化方法有免疫结合法、单克隆抗体结合法和抗体体外表达法等。
综上所述，固定化酶的三种方法是：物理化学固定化、生物化学固定化和免疫化学固定化。
它们可以改变酶的特性，使酶更加稳定和可操作，提高酶的反应活性、稳定性和重复利用性，从而更好地满足人们在实验中的需求。
固定化酶的方法
固定化酶的方法
固定化酶是将酶固定在载体上，形成固定化酶，具有高效、稳定、重复使用等优点。
下面是一种常用的固定化酶方法。
材料：
- 酶
- 载体（如聚丙烯脂、硅胶、玻璃等）
- 活性剂（如戊二醛、双醛、聚乙二醇等）
- 缓冲液（如PBS缓冲液）
- 洗涤液（如去离子水或PBS缓冲液）
步骤：
1. 制备载体：将载体清洗干净并消毒，然后在室温下干燥或烘干。
2. 固定化酶：将制备好的载体浸泡在含有活性剂的缓冲液中，搅拌均匀。
然后加入适量的酶，搅拌均匀并放置一段时间（根据不同的活性剂和载体类型，时间不同）。
最后用洗涤液洗净固定化酶。
3. 检测固定化酶活性：采用适当的方法检测固定化酶的活性，如比色法、荧光法等。
4. 贮存固定化酶：将固定化酶保存在干燥、阴凉、密闭的容器中，避免受潮和受热。
注意事项：
1. 活性剂的选择应根据酶的特性和载体的特点进行选择。
2. 固定化酶活性与载体、活性剂、酶的比例等因素有关，需要进行优化实验。
3. 贮存时要避免温度过高或过低，否则会影响固定化酶的稳定性和活性。
以上是一种常用的固定化酶方法，具体操作时应根据实验要求和条件进行调整。
酶和辅酶的固定化及辅酶再生研究
酶和辅酶的固定化及辅酶再生研究酶和辅酶的固定化及辅酶再生研究一、引言酶是一种生物催化剂，在生物体内起着至关重要的作用。
然而，由于酶的生物活性易受到环境条件的影响，限制了其在工业生产中的应用。
为了克服这一问题，研究人员开始利用固定化技术将酶固定在载体上，以增加其稳定性和重复使用性。
辅酶在许多酶催化反应中起着关键作用，因此辅酶再生技术也成为固定化酶研究领域的热点。
二、酶的固定化技术1. 固定化技术的基本原理固定化技术通过将酶固定在载体表面或内部，使其在催化反应中更加稳定和可控。
常见的固定化技术包括包埋法、交联法、吸附法和共价结合法等。
这些方法可以根据不同的酶和反应需求选择，以增强酶的催化活性和稳定性。
2. 固定化酶的应用固定化酶在工业生产中有广泛的应用。
在食品工业中，固定化酶可以用于酿造、发酵和食品加工过程中，提高生产效率和产品品质。
在医药领域，固定化酶可以用于药物合成和生物转化过程中，加快反应速率和提高产率。
固定化酶还可以用于环境保护、分析检测和能源转化等领域。
三、辅酶的再生技术1. 辅酶的重要性辅酶是许多酶催化反应中不可或缺的辅助因子，它能够促进酶的活性和催化效率。
然而，随着辅酶的消耗，酶的活性会逐渐降低，限制了反应的进行。
辅酶再生技术的研究成为了固定化酶领域的重要课题。
2. 辅酶再生技术的研究进展辅酶再生技术主要包括物理方法和化学方法。
常见的物理方法包括膜渗透技术和超声波辅助技术，通过对辅酶和酶的分离和再结合，实现辅酶的再生。
而化学方法则通过化学催化剂或化学反应将辅酶还原回可用形态。
这些方法在辅酶再生方面都取得了一定的研究进展，为固定化酶的应用提供了更多的可能性。
四、总结与展望固定化酶和辅酶再生技术在酶研究领域具有重要的应用前景。
通过固定化技术，可提高酶的稳定性和重复使用性，进一步推动酶的工业应用。
辅酶再生技术的发展也有助于提高酶催化反应的效率和产率。
未来，随着对酶机理和辅酶再生机制的深入研究，固定化酶和辅酶再生技术将得到进一步的完善和应用扩展，为更多领域的酶催化反应提供解决方案。
酶的固定化
固定化技术
一、固定化酶的概念
固定化酶是指固定在一定载体上并在一定 的空间范围内进行催化反应的酶。 水溶性酶 水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （ 固相酶）
酶的固定化技术和固定化酶
酶 可溶 间歇 固定化
吸附
包埋
间歇
交联
连续
结合
固定化酶与游离酶相比，具有下列优点：
1.极易将固定化酶与底物、产物分开； 2.可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应； 3.在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； 4.酶反应过程能够加以严格控制； 5.产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； 6.较游离酶更适合于多酶反应； 7.可以增加产物的收率，提高产物的质量； 8.酶的使用效率提高，成本降低。
吸附法
常用的固体吸附剂：活性炭、氧化铝、 硅藻土、羟基磷灰石等。 优点：操作简便，条件温和，不引起 酶失活，载体廉价，而且可反复使用。 缺点：结合力弱，易解吸附由于靠物 理吸附作用，结合力较弱，酶与载体 结合不牢固而容易脱落，所以使用受 到一定的限制。
吸附法
（1）常用载体
无机物
活性炭、白陶土、 氧化铝、多孔玻璃、 硅胶、碳酸钙凝胶 有机物 高分子化合物 淀粉麸质、大孔树脂、 DEAE纤维素、 DEAE葡聚糖凝胶
共价键结合法
酶与不溶于水的载体以共价键形式结合制备 固定化酶的方法。即，通过化学共价键，把与酶 蛋白活性无关的氨基酸功能基团连接在不溶于水 的载体上。
（1）酶与载体反应的主要功能基团
游离羟基：肽链C－末端的α –羧基，天门冬酰氨酸 ，谷氨酸的β－γ羧基 游离氨基：肽链N－末端的δ －氨基， 赖氨酸ε －氨基 巯基：半胱氨酸 羟基：丝氨酸，苏氨酸 酚基：酪氨酸 咪唑基：组氨酸
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固定化植物细胞
1982年日本固定化黄色短杆菌原生质体生产谷氨酸 固定化原生质体
6
什么是固定化酶？
固定化酶（Immobilized Enzyme）：通过物理的 或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或 将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流 动，但能使酶充分定化酶
7
固定化酶制备原则
（1）维持酶的催化活性及专一性；
（2）有利于生产自动化、连续化； （3）应有最小的空间位阻； （4）酶与载体必须结合牢固； （5）应有最大稳定性，载体不与废物、产物或 反应
液发生化学反应；
（6）成本要低。
8
固定化酶的优点
长时间使用， 在绝大多数情 况下提高了酶 的稳定性，有 利用工艺的连 续化和管道化
1953年，Grubhoger Schleith 用重氮化聚氨基聚 苯乙烯树脂对羧肽酶、蛋白酶、核酸酶等进行固定， 产生了固定化酶技术。
4
1969年，千田一郎等用固定化氨基酰化酶技
术拆分了DL-氨基酸，生产L-氨基酸，随后固定化 天冬氨酸酶生产L-天冬氨酸等，开创了固定化酶 应用的局面。 1971年，第一次国际酶工程会议在美国召开，会议
13
一、影响固定化酶性质的因素
2、载体的影响
（1） 构象效应 （2） 空间屏蔽效应
14
（3） 微扰效应
（4）分配效应：载体 与底物带相同电荷-底 物少；反之则多。
15
（5）扩散限制效应 外扩散限制
内扩散限制
16
二、固定化后酶性质的变化
1、固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应 速度下降
26
5、相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的
固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶
活力。 6、固定化酶的操作半衰期：在连续测定条件下， 固定化酶的活力下降为最初活力一半所经历的 连续工作的时间。
27
四、固定化酶的活力测定方法介绍
1、间歇测定：在搅拌或震荡反应中，在与溶液
酶相同测定条件下进行，然后间隔一段时间取
多次使用 可以装塔连续反应 优点： 纯化简单 提高产物质量 应用范围广
缺点： 首次投入成本高 大分子底物较困难
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第二节 固定化酶的性质及其影响因素 一、影响固定化酶性质的因素 二、固定化后酶性质的变化 三、评价固定化酶的指标
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一、影响固定化酶性质的因素
1、酶本身的变化，主要是由于活性中 心的氨基酸残基、高级结构和电荷状 态等发生了变化。
b. 酶活力的释放是缓慢的。 c. 抑制自降解，提高了酶稳定性。
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3、pH的变化
pH对酶活性的影响：
（1） 改变酶的空间构象
（2）影响酶的催化基团的解离
（3）影响酶的结合基团的解离
（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或
结合后不能生成产物。
20
pH对固定化酶的影响：
1） 载体带负电荷，pH向碱性方向移动;载体带正
1
2
极易将固定 化酶与底物、 产物分开
优点
酶的使用效 率提高，适 合于多酶反 应
9
酶反应过程可 以严格控制， 有利于工艺自 动化和微电脑 化
3
4
固定化酶的缺点
酶固定化时酶 的活力有所损 失. 增加了固定化的成 本，使工厂开始投 资大
只能用于可溶性的底 物和小分子底物，对 大分子底物不适宜
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固定化酶的优缺点：
电荷，pH向酸性方向移动。
21
3、pH的变化
2）产物性质对体系pH的影响
催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH 值比游离酶的pH值高；反之则低
22
4、最适温度变化
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。
5、底物特异性变化 作用于低分子底物的酶 特异性往往会变化。
23
特异性没有明显变化
既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶
绝大多数酶的化学本质是蛋白质。具有催化效
率高、专一性强、作用条件温和等特点。
2
游离酶的缺陷：
大多数游离酶的稳定性比较差 ； 游离酶的使用成本较高； 一些游离酶存在自水解作用； 产物的分离提纯困难。
3
固定化酶的发展史
在20世纪20年代，就出现了酶工程，以自然酶制 剂在工业上大规模应用的特征，原料以动植物为主
主题是固定化酶的研制和应用,确定固定化酶
（Immobilized Enzyme）统一名称
5
1973年，日本首次在工业上固定化大肠杆菌菌体中天门冬 氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸 固定化死菌体
1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精 固定化细胞
1979年固定化毛地黄细胞和长春花细胞成功
1 Kat =1 mol/s = 60 mol/min = 60*106 umol/min = 6*106 IU 2. 酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA （DNA)所具有的酶活力单位
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三、评价固定化酶的指标：
3、
酶结合效率，又称为酶结合率，是指酶与载体结 合的百分率。
4、
酶活力回收率是指固定化酶的总活力与用于固定 化的总酶活力的百分率。
主要内容
第一节 概述
第二节 固定化酶的性质及其影响因素
第三节 固定化酶的制备 第四节 固定化细胞 第五节 固定化辅酶和原生质体 第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）的应用
1
第一节 概述
什么是酶？
催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。
是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反 应速度，但不改变反应的平衡点。
样，过滤后按常规方法测定产物生成量或底物
的消耗量。
此法操作简单。
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四、固定化酶的活力测定方法介绍
原因：酶结构的变化
空间位阻
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二、固定化酶的性质
固定化对酶稳定性的影响
（1） 操作稳定性提高。
（2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。
(3 ) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。
(4 ) 对分解酶的稳定性提高。 （5） 对变性剂的耐受力升高。
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2 、固定化后酶稳定性提高的原因：
a. 固定化后酶分子与载体多点连接。
6、米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化 （1） 载体与底物带相同电荷，Km’>Km固定化酶 降低了酶的亲和力。
（2） 载体与底物电荷相反，静电作用，Km‘ < Km
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三． 评价固定化酶的指标：
1、酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化 一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶
活单位。