293T细胞中包装慢病毒实验方案
慢病毒包装和滴度检测方案流程
慢病毒包装、滴度测定方案流程一、背景：四质粒的包装体系1.含有目的基因的转染质粒2.VSV-G：pMD2.G（包膜质粒）3.Rev：pRSV-Rev4.Gag/Pol：pMDLg/pRRE二、包装细胞：293T293T细胞由293细胞通过基因技术派生出的细胞系，是经过腺病毒E1A基因的转染，能表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区。
该细胞贴壁松散，操作时请尽量轻柔；换液时需预热培养基。
培养条件：DMEM ＋10% FBS＋1% P/S三、主要试剂1.93T培养基：高糖DMEM（含丙酮酸钠、谷氨酰胺）+ 10% FBS + GlutaMAX2.病毒收获培养基：取50 ml 293T培养基，加入0.5 g BSA（Sigma A9418）和终浓度为10-15 mM的HEPES，0.22 µm过滤。
3.无内毒素质粒抽提试剂盒4.Polybrene (10 mg/ml)：促转染试剂，提高转染效率。
四、包装步骤1.Day1:汇合度90%的10cm dishs HEK293T细胞（~ 6×107/dish）按1：1比例传代至15cm dishs，第二天细胞汇合度达到90%-95%（~1.5×108/dish），培养基为Gibico高糖DMEM培养基（含10%FBS）。
2.Day2:1)转染前2-3个小时更换培养基（含10%FBS)；2)按照以下比例配制转染试剂：Mix 1体积μlMix 2量DMEM（无FBS）1000μlDMEM（无FBS）1000μl目的基因质粒25μgVGF190μl（1μg/μl）PMD2G7.5μgPSPAX215μgMix 1和Mix 2分别混合后，室温5-10min, 后将Mix 1和Mix 2混合，室温30min，加入至15cm dish中。
（细胞达到汇合度90%，细胞过少会影响转染效率）。
3.Day36h-24h内更换新鲜培养基（含10%FBS），观察转染效率并拍照。
慢病毒包装简要步骤
慢病毒包装简要步骤：
以六孔板中的1孔为例，每个样品需要1×10∧6个293FT细胞。
1、取1.5ml灭菌EP管，加入1.5μg包装混合质粒和0.5μg表达质粒以及250μl的无血清Opti MEM。
轻柔混匀，室温孵育5min。
2、取1.5ml灭菌EP管，取9μl 脂质体2000l溶于250μl无血清Opti-MEM I培养基中。
轻柔混匀，室温孵育5min。
3、将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。
室温孵育20min
4、用胰酶消化并记数293FT细胞。
用含血清的DMEM培养基重悬细胞。
5、在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生长培养基，再加入DNA-脂质体复合物。
6、将1ml重悬的293FT细胞（1×10∧6个细胞/ml）加入到平板中。
37℃CO2孵箱中孵育过夜。
7、移除含有DNA-脂质体复合物的培养基移除，代之以DMEM（含丙酮酸钠和非必须氨基酸）。
7、转染后48-72h收获含病毒的上清。
3000 rpm 离心20min，去除沉淀。
8、病毒上清-80°C贮存。
包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。
慢病毒(过表达)包装步骤
慢病毒（过表达）包装步骤秦超1.转染复苏293T细胞,传2-3代进行转染，转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂。
转染步骤：（以10cm培养皿为例）⑴最好在铺细胞后20h左右进行转染，控制转染前细胞密度70%—90%，保证细胞处于良好的状态,转染前一小时把一半培养基（约5ml）换成新的（含血清，因为此转染试剂不需换液）。
⑵加psin 10ug，pspax2 10ug，pmd2.g 5ug于800ul opti—mem，混匀⑶加40ul慢病毒转染试剂于800ul opti—mem，混匀，室温静置5min⑷将⑶所得的转染试剂稀释液滴加到⑵所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置20min⑸取出细胞培养皿，将⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培养箱。
2.收毒(36—48h)收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到60%即可.⑴将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中，然后2000rpm离心10min,以沉淀细胞碎片。
⑵取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管(用蛋白质浓缩管即可）中。
4000rpm离心至所需体积。
⑶浓缩完毕后，吸出浓缩后的病毒液,按每次的接毒量分装，-80℃冻存。
由于反复冻融会降低慢病毒滴度，因此避免反复冻融。
3.接毒接毒前12-20h铺细胞，使接毒时细胞密度约为40％—50%，务必使用生长状态良好的细胞。
将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加polybrene使其终浓度为8ug/ml细胞密度60%—70%时可以再接毒一次。
4.检测及培养细胞系（48h)如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用puromycin杀三天（对照组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。
如需培养成细胞系,可继续培养。
如果剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。
慢病毒包装操作方案
慢病毒包装操作流程一、材料1 细胞培养试剂试剂名称终浓度试剂品牌胎牛血清10%Invitrogen/Gibco丙酮酸钠1mM Invitrogen2 慢病毒包装试剂PEG6000溶液50%Wako3 耗材●50 mL离心管●15 mL离心管●10 cm细胞培养皿●0.45μm过滤器● 2 mL EP管二、操作流程1细胞培养1.1293T/293FT细胞的复苏1)将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。
在超净台内，用吸管吸取6~7mL完全培养液至15 mL离心管中；2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C 水浴中快速晃动（水不要没到盖子），使其在1~2分钟内完全融化；3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO对细胞造成的毒性作用）。
4)在室温条件下，250 g离心4分钟。
5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置37°C、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。
（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的培养容器。
）6)复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。
1.2293T/293FT细胞传代1)待细胞长至60%-70%融合度即可传代。
将培养瓶里的所有培养液全部移去，用1×PBS洗涤细胞两次（洗涤速度要快，避免细胞干涸时间过长），以去除残余的培养液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）；2)加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵育1-2分钟。
在显微镜下观察，可看到大部分细胞变圆不贴壁，拍打培养瓶两侧会有大量细胞脱离，此时应立即终止消化，若细胞仍然有大部分贴壁，可适当延长孵育时间；3)加入等体积完全培养液终止消化，并用吸管吹打培养瓶底2-3次使所有细胞彻底脱壁。
基础医学研究protocol：慢病毒包装
一、puromycin杀伤曲线的制作1、12孔板中铺适量细胞（记住此时的细胞密度），每种细胞6孔2、文献查阅适宜该种细胞的puro浓度，再该值上下设定浓度梯度，通常以0.5或1为一个单位3、配制不同浓度的puro，加入细胞中，留1孔作为blank对照4、每2天更换一次培养基，并添加相应浓度的puro5、开始杀伤的第四天，观察细胞，以cell全部死亡的最低浓度作为病毒感染的puro杀伤浓度二、病毒包装：1、第一天：一盘长满的293T细胞1：3传代于10cm的平板，添加10mlDMEM培养基（10%FBS）传代后次日下午进行病毒包装，即为合适的细胞浓度2、第二天：准备转染复合物：总1ml体系复合物A：pLKO-Tet-On shRNA 20 µg (must be high purity, ≥0.5µg/ul)pLP1 6 µgpLP2 2 µgpLP/VSVG 2 µgCaCl2（2M）62.5μL加ddH2O补至500ul溶液B：2×HBSS 500ul3、用流式管加入B液并始终以合适的速度涡旋，同时缓慢加入复合物A，避免形成肉眼可见的颗粒。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在磷酸盐溶液中加入DNA-CaCl2溶液时需用空气吹打，以确保形成尽可能细小的沉淀物，因为成团的DNA不能有效地粘附和进入细胞。
4、在标准生长条件下培养12h-18h，除去培养液，加入7ml完全培养液培养细胞。
4、继转染后48h，收取上清，4度保存5、重新加入4ml 培养基，培养24h，收取上清6、1500rpm离心10min，取上清分装后存于-80（共10ml上清）三、病毒感染1、铺适量细胞（同制作杀伤曲线的细胞密度）于12孔板2、24h后细胞贴壁，更换全病毒的培养基，0.5ml病毒/孔（DMEM）或者0.3ml病毒+0.2ml medium/孔（1640）3、培养3天，待病毒表达后，加入最适浓度的puro进行杀伤，同时以一孔正常细胞作为对照。
慢病毒包装步骤
慢病毒包装步骤慢病毒包装步骤慢病毒包装简要步骤：以六孔板中的1孔为例，每个样品需要1×106个293T细胞。
1、取1.5ml灭菌EP管，加入1.5μg包装混合质粒和0.5μg表达质粒以及250μl的无血清培养基。
轻柔混匀，室温孵育5min。
3、将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。
室温孵育20min4、用胰酶消化并记数293T细胞。
用含血清的培养基重悬细胞。
5、在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生长培养基，再加入DNA-脂质体复合物。
6、将1ml重悬的293T细胞（1×106个细胞/ml）加入到平板中。
37℃CO2孵箱中孵育过夜。
7、转染后48-72h收获含病毒的上清。
3000 rpm 离心20min，去除沉淀。
8、病毒上清-80°C贮存。
包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。
注意事项1.在慢病毒感染细胞前，为检测病毒上清培养液内病毒的活性，并确定病毒与转染细胞之间的比率，需要确定病毒2. 在慢病毒转染细胞的过程中最重要的一步是融合，只有一些较小的慢病毒载体才能转导进细胞，因此，病毒颗粒的吸附是慢病毒转染的限速步骤。
质粒转染的步骤1、DNA的量：Lipofectamine 2000=1：2~32、细胞密度大约占培养板的80%左右，转染。
3、转染期间不要加抗生素，否则会导致细胞死亡。
步骤如下：以24孔培养板为例1、转染前一天细胞换新的培养基2、制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，如下:a、用50ul无血清培养基稀释DNA（0.8g），轻轻混匀；b、Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用48ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5分钟；c、将a+b的液体加在一起，轻轻混匀，室温孵育20分钟，使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成；3、将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中，轻轻前后摇匀；4、放入37度孵箱中培养24~48h后，1：10传代，加入G418筛选。
慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤之欧阳语创编
一、包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。
所以要在细胞购进时就进行冻存。
2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7.将细胞离心，1000rpm，2min。
8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
二、293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
密度为3×105个/ml。
4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。
三、293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
6. 第二天观察细胞存活率。
倒掉旧的培养基，加入10ml 新鲜培养基。
二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)2. TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems， cat. no. 4304437)3. TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems， cat. no. 401970)4. TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems， cat. no. 4316844)用于包装的293T细胞的培养用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。
慢病毒包装protocal
慢病毒包装用于侵染Hela细胞和A549细胞用24孔板进行培养293FT细胞，每孔500μl培养液，用于包装慢病毒实验。
用6孔板培养Hela细胞和A549细胞，每孔2ml培养液，用于侵染实验。
包装对照质粒：表达GFP和RFP的PTK643空载体；包装样品质粒：PTk643-cc1各片段和PTk643-cc2各片段。
具体操作流程如下：（1）对用去内毒素试剂盒提过的质粒进行浓度测定，用于统一之后慢病毒包装中质粒的量。
（2）准备293FT细胞，按1：5接种于0.5ml DMEM（含10%FBS）的24孔板中，过夜培养到60%-80%细胞密度。
（3）准备DNA mixture。
按1ug PTK643-cc +0.7 ugΔNRF +0.5 ugVSVG计算相应的质粒体积。
将上述混合物加入50ulopti-MEM中，振荡并稍离心。
（4）准备PEI mixture。
融化PEI并稍离心，按60：500的比例将PEI加入到opti-MEM中，立即振荡并稍离心，静置5min。
（5）准备DNA/PEI混合液，将56ul的PEI混合物一滴滴加入到（3）中的DNA混合液中，振荡并稍离心。
室温孵育20-30min。
（6）从细胞培养皿中移去100ul培养液，之后加入上述DNA/PEI 混合液，同时左右摇摆盘子。
（7）37ºC培养过夜。
12小时后，换培养液（加入500ul DMEM （含10%FBS））。
（8）回收病毒上清。
转染分别在48和72小时后，回收病毒上清。
（可用0.45μm syringe filter millipore过滤回收病毒上清，本次不用）（9）将病毒上清分为300ul和200ul两份，立即进行侵染实验或于-80ºC保存。
（一份300ul侵染Hela细胞，用于后面的流式分析；另一份200ul用于跟踪观察细胞的形态。
）（10）侵染12小时后，换一次培养液。
培养48小时后，观察细胞，弱培养液变黄，则换培养液。
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慢病毒包装实验⽅方案
实验步骤
⼀一、细胞培养
1、⽤用含10%FBS的H-DMEM培养基于37°C、5%CO2培养箱中培养293T
细胞，其中加1×102U/ml⻘青霉素、100µg/ml链霉素和10µg/ml
ciprofloxacin防⽌止⽀支原体污染，
2、待10cm⽫皿中细胞融合度到80%左右，⽤用0.25%胰酶消化293T细胞，分
到两个6cm⽫皿中，另⼀一盘10cm293T作同样处理理，使细胞在接种之后的
18-24h达到70%融合度。
●注意事项
293T细胞转染慢病毒24h之前，培养液中停⽌止使⽤用抗⽣生素和ciprofloxacin，减少对病毒转染的影响；注意接种后的293T细胞密度，过⾼高和过低的细胞密度都会导致转染后细胞死亡。
⼆二、细胞转染
3、每个6-cm培养⽫皿在转染之前4h⽤用5ml不不含⾎血清的H-DMEM培养基换
液，
4、应⽤用500µl Optimum和14.18µl Lipofactamine2000混匀于室温静置5min，
将500µl Optimum、1.7µg慢病毒载体、1.13µg psP AX2和0.57µg MD2.G
混匀配制成DNA mixture，然后与静置5min的
Optimum/Lipofactamine2000混匀，于室温静置20min后，将混匀后的
mixture加⼊入到培养基中。
5、6h之后将培养基更更换为含10%FBS的H-DMEM完全培养基，
6、分别收集48h、72h和96h的细胞上清液。
●注意事项
①293T细胞容易易脱落⽫皿底，加H-DEME沿⽫皿侧壁缓慢加⼊入，并且边加边轻微摇晃使培养基均匀分布⽫皿底防⽌止细胞⽆无培养基死亡
②质粒换算要准确，
③将mixture加⼊入培养基中要边滴边摇晃培养⽫皿使其mixture与培养基混匀，这样直⾄至结束。
三、病毒收集和浓缩
1、将离⼼心机时间和转速参数调⾄至成3000rpm和15min,其中加速度和下降速度降⾄至最低，
2、将收集的293T细胞上清液加⼊入超滤管中（⼀一次最多15ml）,3000rpm、15min开始离⼼心，离⼼心结束后⽤用收集病毒，-80℃保存。