慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
慢病毒包装和滴度检测方案流程
慢病毒包装、滴度测定方案流程一、背景：四质粒的包装体系1.含有目的基因的转染质粒2.VSV-G：pMD2.G（包膜质粒）3.Rev：pRSV-Rev4.Gag/Pol：pMDLg/pRRE二、包装细胞：293T293T细胞由293细胞通过基因技术派生出的细胞系，是经过腺病毒E1A基因的转染，能表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区。
该细胞贴壁松散，操作时请尽量轻柔；换液时需预热培养基。
培养条件：DMEM ＋10% FBS＋1% P/S三、主要试剂1.93T培养基：高糖DMEM（含丙酮酸钠、谷氨酰胺）+ 10% FBS + GlutaMAX2.病毒收获培养基：取50 ml 293T培养基，加入0.5 g BSA（Sigma A9418）和终浓度为10-15 mM的HEPES，0.22 µm过滤。
3.无内毒素质粒抽提试剂盒4.Polybrene (10 mg/ml)：促转染试剂，提高转染效率。
四、包装步骤1.Day1:汇合度90%的10cm dishs HEK293T细胞（~ 6×107/dish）按1：1比例传代至15cm dishs，第二天细胞汇合度达到90%-95%（~1.5×108/dish），培养基为Gibico高糖DMEM培养基（含10%FBS）。
2.Day2:1)转染前2-3个小时更换培养基（含10%FBS)；2)按照以下比例配制转染试剂：Mix 1体积μlMix 2量DMEM（无FBS）1000μlDMEM（无FBS）1000μl目的基因质粒25μgVGF190μl（1μg/μl）PMD2G7.5μgPSPAX215μgMix 1和Mix 2分别混合后，室温5-10min, 后将Mix 1和Mix 2混合，室温30min，加入至15cm dish中。
（细胞达到汇合度90%，细胞过少会影响转染效率）。
3.Day36h-24h内更换新鲜培养基（含10%FBS），观察转染效率并拍照。
慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
以下内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。
二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G,pHBLV TM系列质粒。
1、载体信息（见附录）2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
三、包装细胞293T细胞的培养（一） 293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。
3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。
计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。
计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即为实际 n万/mL 细胞浓度。
4、细胞离心，1000rpm，5min。
慢病毒包装简要步骤
慢病毒包装简要步骤：
以六孔板中的1孔为例，每个样品需要1×10∧6个293FT细胞。
1、取1.5ml灭菌EP管，加入1.5μg包装混合质粒和0.5μg表达质粒以及250μl的无血清Opti MEM。
轻柔混匀，室温孵育5min。
2、取1.5ml灭菌EP管，取9μl 脂质体2000l溶于250μl无血清Opti-MEM I培养基中。
轻柔混匀，室温孵育5min。
3、将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。
室温孵育20min
4、用胰酶消化并记数293FT细胞。
用含血清的DMEM培养基重悬细胞。
5、在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生长培养基，再加入DNA-脂质体复合物。
6、将1ml重悬的293FT细胞（1×10∧6个细胞/ml）加入到平板中。
37℃CO2孵箱中孵育过夜。
7、移除含有DNA-脂质体复合物的培养基移除，代之以DMEM（含丙酮酸钠和非必须氨基酸）。
7、转染后48-72h收获含病毒的上清。
3000 rpm 离心20min，去除沉淀。
8、病毒上清-80°C贮存。
包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。
慢病毒包装操作方案
v1.0 可编辑可修改慢病毒包装操作流程一、材料1 细胞培养试剂试剂名称终浓度试剂品牌DMEM/High glucose基础培养基90%Invitrogen胎牛血清10%Invitrogen/Gibco丙酮酸钠1mM InvitrogenDMSO（冻存用）10%2 慢病毒包装试剂试剂名称浓度试剂品牌Lipofectamine 2000InvitrogenOpti-MEM基础培养基InvitrogenPEG6000溶液50%WakoNaCl溶液40 mMHBSS溶液Invitrogen3 耗材50 mL离心管15 mL离心管10 cm细胞培养皿μm过滤器2 mL EP管二、操作流程1细胞培养1.1293T/293FT细胞的复苏1)将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。
在超净台内，用吸管吸取6~7mL完全培养液至15 mL离心管中；2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C水浴中快速晃动（水不要没到盖子），使其在1~2分钟内完全融化；3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO对细胞造成的毒性作用）。
4)在室温条件下，250 g离心4分钟。
5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取 2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置 37°C、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。
（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的培养容器。
）6)复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。
1.2293T/293FT细胞传代1)待细胞长至60%-70%融合度即可传代。
将培养瓶里的所有培养液全部移去，用1×PBS洗涤细胞两次（洗涤速度要快，避免细胞干涸时间过长），以去除残余的培养液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）；2)加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵育1-2分钟。
慢病毒包装实验步骤
慢病毒包装实验的要点：1：良好的293FT细胞状态是转染成功的首要因素，细胞代数不宜超过30代；2：细胞铺板需均匀，避免细胞成团，影响转染效率；尽量多的细胞转入质粒，产生的病毒就越多；3：细胞换液和共转染时，动作要轻柔避免细胞漂浮。
尽量少的细胞死亡，产生的病毒就越多；实验前要准备的试剂、耗材和仪器；试剂准备：10%灭活胎牛血清+90%DMEM配好的完全培养基,0.25%胰酶，PBS,TRL 转染试剂，包装质粒，目的质粒，无血清培养基。
耗材准备：10cm细胞培养皿，6孔细胞培养板，吸头规格1ml、200ul、10ul，10ml移液管，离心管规格15ml、5ml、1.5ml，0.22um PVDF滤膜和10ml无菌注射器，试管架。
仪器准备：倒置荧光显微镜，普通光学倒置显微镜，电动移液器，吸引器，移液枪，二级生物安全柜，二氧化碳细胞培养箱。
第一天：上午（病毒包装质粒共转染前，293FT细胞复苏后至少让其传代两次以上，293FT 细胞能成倍的增长，确定细胞状态好）；实验前准备：安全柜开紫外灯照30分钟；把培养基和试剂放置常温；消化细胞：从37 5%的co2细胞培养箱拿出细胞状态良好的293FT细胞，吸出原培养基，加入PBS 1ml略洗之后吸出，加入1ml胰酶消化1-2min，轻轻拍打培养皿，再加入3ml新鲜培养基终止消化，将培养皿中的细胞转移至15ml离心管内离心1000r /5min,吸出上清液，加入10ml PBS吹打混匀后，离心1000r /5min, 吸出上清液。
细胞铺板：在10cm细胞培养皿上标记细胞名称、细胞代数、时间和操作人，将计数好大约2.5×106个293FT细胞吸入15ml离心管，再加入完全培养基至10ml充分混匀，然后把混匀的293FT细胞移入10cm培养皿）。
放置培养箱中培养48h。
插入铺板后图片刚铺板后铺板1天后第三天：上午细胞转染：细胞铺板48h后，从培养箱取出293FT细胞，倒置显微镜观察，细胞密度达90%左右；吸出原有培养基，沿皿壁缓慢加入8ml完全培养基，放置于培养箱中，待转染。
慢病毒包装步骤
慢病毒包装步骤慢病毒包装步骤慢病毒包装简要步骤：以六孔板中的1孔为例，每个样品需要1×106个293T细胞。
1、取1.5ml灭菌EP管，加入1.5μg包装混合质粒和0.5μg表达质粒以及250μl的无血清培养基。
轻柔混匀，室温孵育5min。
3、将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。
室温孵育20min4、用胰酶消化并记数293T细胞。
用含血清的培养基重悬细胞。
5、在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生长培养基，再加入DNA-脂质体复合物。
6、将1ml重悬的293T细胞（1×106个细胞/ml）加入到平板中。
37℃CO2孵箱中孵育过夜。
7、转染后48-72h收获含病毒的上清。
3000 rpm 离心20min，去除沉淀。
8、病毒上清-80°C贮存。
包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。
注意事项1.在慢病毒感染细胞前，为检测病毒上清培养液内病毒的活性，并确定病毒与转染细胞之间的比率，需要确定病毒2. 在慢病毒转染细胞的过程中最重要的一步是融合，只有一些较小的慢病毒载体才能转导进细胞，因此，病毒颗粒的吸附是慢病毒转染的限速步骤。
质粒转染的步骤1、DNA的量：Lipofectamine 2000=1：2~32、细胞密度大约占培养板的80%左右，转染。
3、转染期间不要加抗生素，否则会导致细胞死亡。
步骤如下：以24孔培养板为例1、转染前一天细胞换新的培养基2、制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，如下:a、用50ul无血清培养基稀释DNA（0.8g），轻轻混匀；b、Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用48ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5分钟；c、将a+b的液体加在一起，轻轻混匀，室温孵育20分钟，使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成；3、将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中，轻轻前后摇匀；4、放入37度孵箱中培养24~48h后，1：10传代，加入G418筛选。
慢病毒纯化
慢病毒纯化
慢病毒纯化是指从慢病毒病毒培养物中分离和纯化出慢病毒颗粒的过程。
这个过程通常包括以下步骤：
1.细胞培养：首先，需要将慢病毒所感染的细胞系培养到适
当的细胞密度和病毒扩增时间，以确保足够的病毒产量。
2.细胞裂解：将培养的细胞收集并经过离心等方法分离，然
后使用裂解缓冲液裂解细胞，释放出细胞内的慢病毒。
3.离心和过滤：经过细胞裂解后，样品需要进行离心，以去
除细胞碎片和核酸残余物。
然后，可以使用过滤器对澄清
的上清液进行过滤以去除大颗粒物质。
4.病毒浓缩：慢病毒通常是低浓度的，因此需要进行浓缩。
可以使用超滤、离心和沉淀等方法，将病毒颗粒从大量液
体中浓缩到较小的容量中。
5.梯度离心：为了进一步纯化病毒，可以使用梯度离心技术，
如葡聚糖梯度离心或离心浓缩。
这个过程可将纯化的病毒
与细胞碎片、蛋白质和其他污染物分离开来。
6.病毒沉淀：经过梯度离心后，可以进行病毒的最终沉淀。
使用离心来将病毒沉淀到盘底或在离心管底端形成浓缩的
沉淀。
7.再悬浮：将病毒沉淀用缓冲液再悬浮，以便进行后续实验
应用。
在整个慢病毒纯化的过程中，必须遵守基本的生物安全措施，
并使用无菌操作、合适的缓冲液和处理设备。
每一步之间的温度、离心速度和离心时间等参数也需要根据具体的实验条件和病毒类型进行优化和调整。
慢病毒载体构建及包装操作手册
慢病毒载体构建及包装操作手册目录慢病毒收到后的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、慢病毒包装和浓缩四、感染目的细胞附1. 汉恒生物慢病毒质粒列表附2. 慢病毒滴度测定方法简介附3. 慢病毒MOI感染参数附4. 汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较慢病毒安全使用和注意事项➢慢病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)慢病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3)操作病毒时特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。
接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于84消毒液浸泡后统一处理。
4)如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。
5)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。
6)实验完毕用香皂清洗双手。
➢慢病毒收到后的注意事项1)慢病毒的储存用户收到病毒液后在短期内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存（尽量一周内用完）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。
注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%-50%）；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（200 l/tube），收到后直接放置-80℃保存即可。
b．如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。
2)慢病毒的稀释用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(请尽量一周内用完)。
一、整体实验流程二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为psPAX2, pMD2.G, pHBLV TM系列质粒。
1、载体信息（见附表1）2、细胞株：我们采用293T作为慢病毒的包装细胞。
该细胞系为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM+10% FBS+双抗。
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一、包装细胞293T 细胞的培养一、293T 细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T 细胞会出现生长状态下降，出现突变等。
所以要在细胞购进时就进行冻存。
2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's 液洗去残留的培养基。
4. 加入0.25% 的胰酶，消化10-20s 后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7. 将细胞离心，1000rpm ，2min 。
8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70% 完全培养基+20%FBS+10% DMSO ）重悬细胞，密度为3X 10 6个/ml。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
二、293T 细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90% 需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
密度为 3 X10 5个/ml。
4. 分到10cm 培养皿中，10ml/ 皿。
三、293T 细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50 代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40 C。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min 内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml 细胞溶液加入9 ml 完全培养基中并混匀后转入10cm 培养皿。
5. 放回37 C、3%CO 2和95%相对湿度的培养箱中培养。
6. 第二天观察细胞存活率。
倒掉旧的培养基，加入10ml 新鲜培养基。
二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定1. 所用病毒检测引物为WPRE 特异引物，序列如下只供学习与交流5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer), 5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and 5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe) 2. TaqMan Un iversal PCR Master Mix (Applied Biosystems 4304437) 3. TaqMan DNA Template Reage nt Kit (Applied Biosystems 401970)4. TaqMa n RNaseP con trol reage nt (Applied Biosystems 用于包装的293T 细胞的培养用于包装的293T 细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。
任何时候细胞汇合率都不准达 到 100%。
慢病毒的包装1. 预先准备3个T150 瓶的293T 细胞，培养基为 DMEM + 10% FBS ，1% Glutamax ， 1% 青霉素-链霉素。
2. 将细胞分到12分到12个T150瓶中，每瓶的细胞密度是 8 X 10 6个。
3. 第二天，镜下检查细胞。
细胞融合度应大致为30-40% ，分布均匀。
4. 转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入 20ml 的Opti-MEM 培养基，将细胞送回培养箱。
5. 取两支无菌的 50ml 离心管，其中一支中加入 252 卩g pNLEGFP/CMV/WPREDU3载体质粒，168卩g pCD/NL -BH*DDD 包装质粒和 84卩g pLTR -G 质粒，用Opti-MEM 培养基补齐到 18ml 。
另一支中加入 500卩l Trans -EZ 溶液和17.5 ml Opti-MEM 培 养基，用电动移液器轻轻混匀。
将Trans-EZ 稀释液滴加到质粒管中，边加边轻轻晃匀。
cat. no.cat. no. cat. no. 4316844)in 帕*;Tri £luctionSunBio IV VectorPackaging Cell关键步骤：推荐使用 Qiagen 质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。
6. 室温孵育20分钟，使DNA 和Trans-EZ 充分结合形成转染复合体。
7. 取1支5ml 的移液管，将得到的 DNA-Trans-EZ 复合体均匀滴加入到细胞培养板 中，每板3ml 。
来回晃动培养板，混匀后放回到 5%二氧化碳培养箱。
每一皿细胞培养 盘不要超过6盘。
8. 6小时后，移去细胞上清，更换为 17ml 的DMEM 完全培养基。
9. 转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是健康的并且密度接近 60-80% 。
如果所转染质粒带有 GFP 荧光，那么这时候可以看到大于95%的细胞都是带有荧光的。
10. 将细胞送回培养箱继续培养 2天（36-48小时）。
在这个过程中，细胞会逐渐融合 形成多核体，大多数的细胞依然贴壁。
11. 收集所有的上清，分装到 50ml 离心管中。
12.4 C, 500g 离心10分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片。
13.总的上清约为204 ml ，用250- ml 0.45 卩m PVD 过滤装置过滤。
如果发现滤膜 被堵住，表现为过滤速度变慢，更换新的滤器。
慢病毒的浓缩与纯化 方法一超速离心沉淀法 1. 取 6 个 Ultra-clear SW28 外灯继续消毒30分钟。
2. 每个 Ultra-clear SW28 离心管中加入约 32ml 的预先处理的病毒上清液。
离心管，用70%乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫[IN A W .WTfflMfZ C JJ TO 祝3. 取一支10ml 的移液管，吸取12 ml 20% 的蔗糖溶液。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出 4 ml 。
同样地，将剩下8 ml 的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下 3 管进行同样处理。
4. 用PBS 调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g 。
5. 按次序将所有6 个离心管放入Beckman SW28 超速离心转头中。
7. 小心将管子从转头中取出。
倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10 分钟使剩余的上清流干。
吸掉剩余的液滴。
在管底应当有可见的沉淀。
8. 每管中加入100ml 不含钙和镁的PBS 洗下沉淀。
9. 将SW28 超速离心管插入到50ml 锥底离心管中，盖上盖子。
10. 在4 C溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
11.4 C, 500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
12. 用200卩I移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
避免产生泡沫。
将所有管中的液体集中到一个SW28 离心管中。
13. 集中后的病毒悬液分装成50卩I每份，保存在成品管中。
用碎干冰速冻后储存在-80 C 。
方法二PEG-8000 浓缩法PEG （聚乙二醇）是高分子聚合物，具有高亲水性，在溶液中会吸收大量水分，减少病毒之间的距离,使病毒与病毒能够很容易的聚合在一起,病毒的相对浓度提高,达到沉淀浓缩的目的。
5X PEG8000+NaCI 配制称取NaCI 8.766 g; PEG8000 50g 溶解在200mI MiIIi-Q 纯水中；121 摄氏度30min 湿热灭绝30min ；保存在 4 C 。
1. 使用0.45 ym滤头过滤慢病毒上清液；3. 每20〜30min 混合一次，共进行3-5次；4. 4 度放置过夜；5. 4 度, 4000 g ,离心20min ；6. 吸弃上清,静置管子1 〜2 分钟,吸走残余液体；7. 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；8. 集中后的病毒悬液分装成50卩每份，保存在成品管中。
用碎干冰速冻后储存在-80 C病毒滴度的测定稀释计数法滴度单位：TU/ml ，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。
”TU”为” transducing units ”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
第一天细胞准备将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1X 105/ml ,加入96孔板，100卩1/孔,为每个病毒准备10个孔。
放入37 C, 5%CO 2培养箱中培养。
第二天加病毒在EP 管中做10 倍梯度稀释，连续10 个稀释度。
稀释方法如下：每种病毒准备10 个1.5ml EP 管，每管加入90卩1培养液，往第一个管中加入10卩1病毒原液，混匀后，吸取10^1加入第二个管混匀。
依此类推，做十个稀释度（10~10 -8）。
吸取96 孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。
并做好标记。
第三天追加培养液在每个孔再加入100卩1完全培养液，利于细胞的生长。
第五天观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。
假设为X 和Y，则滴度（TU/ml ）= （X+Y*10 ）*1000/2/X 孔的病毒液的含量（卩）。
定量PCR 法病毒感染1天前，取6孔板接种HOS细胞。
每孔细胞为5X 10 4个。
接种细胞24 小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N 。
弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5卩g/ml polybrene 的新鲜培养基。
将浓缩病毒用培养基稀释200倍，也就是取1卩1病毒加入到199卩1的培养基中。
在3个培养孔中分别加入0.5卩1, 5^1和50 ^1的稀释病毒。
感染开始后20小时，除去培养上清，换为500^1含DNasel （Takara Mirus Bio ，终浓度为10 U/ml）的新鲜培养基。
在37 C 消化15 分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA 。
然后换为2ml 正常的培养基，继续培养48 小时。
用0.5ml 0.25% 胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37 C放置1分钟。
用培养基吹洗下，离心收集细胞。
按照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组DNA。
每个样品管中加入200 ^1 洗脱液洗下DNA。
用DNA定量试剂盒定量(Bio-Rad )。
基因组DNA可以稳定保存在-20 C至少2个月。
准备PCR所需的试剂和样品。
为病毒序列检测引物配总管I :n = number of reactions. 例如：总反应数为40 ,将1ml 2 X TaqMan UniversalPCR Master Mix , 4 卩l forward primer , 4 卩l reverse primer , 4 卩l probe 和788 卩l H2O混和。
震荡后放在冰上。
为人基因组序列检测引物配总管n :n = number of reactions. 例如：总反应数为40 ,将1ml 2 X TaqMan UniversalPCR Master Mix , 100 卩l 10 X RNaseP primer/probe mix 和700 卩l H2O 混和。