免疫细胞体外诱导及培养
自体CIK细胞免疫治疗病人健康教育
自体CIK细胞免疫治疗病人健康教育CIK(Cytokines-inducedki11er)即细胞因子活化杀伤细胞，是外周血单个核细胞在体外经多种细胞因子共同诱导培养后产生异质细胞群，同时具有T细胞和NK细胞这两种人体内主要具有抗肿瘤活性细胞的效应，如同“细胞导弹”，对肿瘤细胞有很强的识别力和杀伤力。
C1K细胞疗法是自体免疫细胞回输方法的简称。
即抽取患者自身的外周血在体外培养时经过复制和激活过程，使它们的数量和活性得到大幅度的提高，然后再将它们回输给患者，增强机体抗肿瘤的能力，从而达到杀灭肿瘤细胞的目的。
随着肿瘤治疗技术的不断发展与完善，肿瘤生物治疗已成为继常规手术治疗、放射治疗、化学药物治疗后又一种新的更加有效的治疗方法。
【CIK治疗特点及适用范围】1.治疗特点(1)治疗流程规范：CIK治疗过程分为外周血单核细胞采集、体外诱导及回输三部分。
先用血细胞分离机分离患者全部外周血中的单核细胞，或采全血50m1,再将分离出的细胞或全血送至GMP标准实验室内进行体外培养及诱导获得CIK细胞，7~14d后再分次将增殖数倍的细胞回输至患者体内，直接杀伤患者体内残余的肿瘤细胞，增强患者的免疫功能，延长肿瘤患者的生存期，提高其生活质量。
整个操作过程均在无菌环境下进行，保证了治疗的安全性。
(2)应用范围广：由于CIK细胞溶瘤作用不受癌组织类型的限制，因此，对任何一种癌症均有杀灭作用。
C1K疗法完全是自体细胞，所以没有副作用和排斥反应，对血液、淋巴中残存的、散在的或处于休眠状态中的癌细胞也可以彻底清除，最大限度地防止复发和转移。
生物免疫细胞疗法在保障显著的治疗效果的同时，更能提高患者生活质量。
治疗效果与患者生活质量并重，这是生物免疫细胞疗法优于其他治疗方式的独到之处。
2•适用范围(1)适应证：可用于肝癌、食管癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肾癌、白血病、淋巴瘤(T细胞淋巴瘤除外)、多发性骨髓瘤等癌症的治疗Q任何一期的肿瘤患者，早期、中晚期的病例均有较好的近期疗效。
一种高效的巨噬细胞体外诱导培养方法
一种高效的巨噬细胞体外诱导培养方法张春蕾; 华正宇; 袁小林; 杨真; 张青; 李小欢【期刊名称】《《大连医科大学学报》》【年(卷),期】2011(033)005【总页数】5页(P512-516)【关键词】死亡细胞; 诱导; 巨噬细胞; 分化【作者】张春蕾; 华正宇; 袁小林; 杨真; 张青; 李小欢【作者单位】大连大学附属中山医院中心实验室辽宁大连116001; 大连医科大学附属第一医院病理科辽宁大连116011【正文语种】中文【中图分类】R392巨噬细胞是机体免疫系统的重要细胞成分，在非特异性免疫防御及特异性免疫应答中均起十分关键的作用。
研究与应用巨噬细胞的核心问题是如何获得高纯度、高活性的巨噬细胞，然而由于该细胞的诱导、分化及激活机制尚不十分清楚，体外诱导培养很困难，这对于巨噬细胞的研究与应用限制很大。
本实验室在以往研究中发现，死亡细胞可诱导巨噬细胞前体细胞活化增殖并分化成具有较高吞噬活性的巨噬细胞。
本研究进一步完善巨噬细胞的体外培养方法，旨在为巨噬细胞诱导、分化及激活机制的研究提供实验资料和理论依据。
实验动物:昆明小鼠，5～8周龄，由大连医科大学实验动物中心提供。
瘤细胞株:小鼠肝癌细胞株(H22)腹水型，由哈尔滨医科大学免疫学教研室提供。
主要试剂及仪器:小鼠淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)，MURINE GMCSF(PEPROTECH，INC.)，羊抗小鼠 CD68 单克隆抗体(Santa Cruz，美国)，FITC标记兔抗山羊IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)，XDS-1B倒置显微镜(重庆光电仪器有限公司)，XSZ-HY1荧光显微镜(重庆光电仪器有限公司)，OLYMPUS光学显微镜(日本制造)。
1.2.1 鸡红细胞悬液的制备于无菌条件下，自鸡翼下静脉采血5 mL，立即加入到事先加有1 mL肝素钠(1000 U)抗凝剂的Eppendorf管中混匀，4℃保存。
使用前，以无菌生理盐水离心(2000 rpm×5 min)洗涤3次，然后用生理盐水配成体积分数为5%的鸡红细胞悬液备用。
人原代肥大细胞体外诱导和组织分离方法的建立
人原代肥大细胞体外诱导和组织分离方法的建立翟荣荣;蒋金凤;张济;丁永斌;王建华;魏继福【摘要】目的:建立获取和培养人原代肥大细胞的方法,为探讨肥大细胞的免疫调节作用及其机制奠定基础.方法:用重组人源干细胞因子、IL-6和IL-3刺激CD34+造血干细胞使之分化成肥大细胞；Percoll密度梯度离心结合免疫磁珠分选法,分离肠道黏膜肥大细胞.应用免疫荧光染色技术分析所获得的原代肥大细胞表面分子CD117和FcεRⅠ,甲苯胺蓝染色或间接免疫荧光染色检测胞内类胰蛋白酶含量.结果:黏膜肥大细胞及CD34+造血干细胞刺激分化而来的肥大细胞均表达CD117和FcεRⅠ,胞内均含有类胰蛋白酶.结论:这两种方法均可以有效地获得大量纯化的原代肥大细胞,且各有优势,所得细胞适用于肥大细胞在机体免疫调节和病原防御等生理功能的后续研究.%Objective:To establish the technique for generation or isolation of human primary mast cells,and for further studying their roles in regulating host immunity and elucidatingimmunopathogenesis.Methods:CD34 + hemopoietic stem cells were cultured in presence of stem cell factor,IL-6,and IL-3 to generate primary mast cells.Mast cells allocated in human intestinal tissues were isolated through digestion,density gradient centrifugation and purification with specific antibodies-coated magnetic beads.Cell phenotype was monitored by immuostaining of surface markers of CD117 and FcεRⅠ and intracellular tryptase,or cells were identified with Toluidine blue staining.Results:Both of the CD34 + cell-derived and intestinal mast cells expressed CD117 and FcεRⅠ,the specific markers for mast cells,and contained intracellular tryptase.Conclusion:Both methods could providesufficient and purified primary mast cells for further study in regulating host immune response and defence against pathogenic microorganism.【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2013(023)003【总页数】5页(P224-228)【关键词】肥大细胞;肠道黏膜;类胰蛋白酶;诱导【作者】翟荣荣;蒋金凤;张济;丁永斌;王建华;魏继福【作者单位】南京医科大学第一附属医院药学部研究室,江苏南京210029;中国科学院上海巴斯德研究所病毒免疫学实验室,上海200025;中国科学院上海巴斯德研究所病毒免疫学实验室,上海200025;南京医科大学第一附属医院普外科,江苏南京210029;南京医科大学第一附属医院普外科,江苏南京210029;中国科学院上海巴斯德研究所病毒免疫学实验室,上海200025;南京医科大学第一附属医院药学部研究室,江苏南京210029【正文语种】中文【中图分类】R329.2肥大细胞是定位于组织的一类胞质内富含嗜碱性颗粒的细胞［1］，与哮喘、变态反应等疾病的发生密切相关。
体外t细胞耗竭模型原理
体外t细胞耗竭模型原理体外T细胞耗竭模型是一种研究T细胞生物学功能和免疫应答机制的实验模型。
该模型通过体外培养方式使T细胞持续刺激暴露于活化状态，从而诱导T细胞衰竭。
体外T细胞耗竭模型的研究对深入了解T细胞功能调控机制和应对肿瘤、感染等疾病具有重要意义。
体外T细胞耗竭模型的实验过程通常包括以下几个步骤：初始T 细胞活化、连续刺激、功能特征鉴定、细胞检测和实验结果分析。
首先，为了使T细胞进入活化状态，研究人员通常通过使用抗CD3和抗CD28等细胞表面激活抗体，对T细胞进行刺激，模拟体内免疫应答。
这种刺激可以激活T细胞表面的共刺激分子和信号传导通路，使T 细胞开始增殖和产生细胞因子。
接下来，为了模拟T细胞长期持续刺激的环境，研究人员将活化的T细胞连续培养在含有靶细胞、肿瘤抗原、细胞因子等刺激物质的培养基中。
这种刺激环境可以使T细胞得到持续的活化信号，从而诱导T细胞功能紊乱和耗竭。
在连续刺激阶段，研究人员通常会观察T细胞的功能特征和表型变化。
例如，通过检测细胞因子产生水平，如干扰素γ（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）等，可以评估活化的T细胞的生物学功能。
同时，通过流式细胞术检测细胞表面标记物的表达，如程序性死亡受体1（PD-1）、淋巴细胞功能相关抗原4（CTLA-4）等，可以评估T细胞的抑制性和活化状态。
在连续刺激和功能特征鉴定阶段，研究人员还可以根据需要使用特定的靶细胞、肿瘤抗原和共刺激分子来模拟不同疾病状态下的免疫应答。
例如，在研究肿瘤免疫治疗时，可以使用肿瘤细胞或表达肿瘤抗原的靶细胞来模拟肿瘤免疫应答。
在细胞检测阶段，研究人员通常通过流式细胞仪等技术对T细胞进行检测和分析。
流式细胞仪可以对细胞进行单个细胞水平的多参数检测，包括表面标记物表达、胞内细胞因子水平等。
通过这些检测，可以评估T细胞的功能状态、抑制性效应和活化程度。
最后，通过对实验结果的分析和统计，研究人员可以得到有关T 细胞功能调控机制和耗竭过程的重要信息。
细胞培养技术中的细胞诱导分化方法
细胞培养技术中的细胞诱导分化方法细胞培养技术是一种重要的研究方法，它可以用来研究细胞的生物学特性和功能，也可以用来治疗一些疾病。
在细胞培养技术中，细胞诱导分化方法是一项关键技术，它可以将多能干细胞分化为特定功能的细胞类型，如心脏细胞、神经元等。
本文将介绍几种常见的细胞诱导分化方法。
首先，一种常见的细胞诱导分化方法是传统的化学诱导法。
这种方法通过添加一系列的化学物质到培养基中，来模拟细胞发育过程中的信号通路，从而诱导细胞向特定细胞类型分化。
例如，要诱导多能干细胞分化为心脏细胞，可以添加一些心脏发育相关的化学物质，如心肌生成因子。
然而，化学诱导法往往存在效率低、稳定性差等缺点，且可能对细胞产生不可逆的损害。
另一种常见的细胞诱导分化方法是基因转导法。
这种方法通过将特定基因导入到细胞中，来激活或抑制细胞内的信号通路，从而诱导细胞分化成特定细胞类型。
基因转导可以通过病毒载体或基因转染剂实现。
例如，要诱导多能干细胞分化为神经元，可以将神经相关基因导入到细胞中，如神经生长因子。
然而，基因转导法可能引发基因突变或不受控制的基因表达，从而导致不可预测的后果。
除了化学诱导和基因转导法，还有一种新兴的细胞诱导分化方法是体外模拟法。
这种方法通过模拟胚胎发育中的微环境，如松弛力、机械刺激等，来诱导细胞分化。
体外模拟法可以通过调节培养基的成分，如细胞外基质、生理条件等，以及应用一些外部机械刺激装置，如牵拉力装置、压力装置等来实现。
例如，要诱导多能干细胞分化为心脏细胞，可以在培养基中添加心肌发育所需的生长因子，同时施加适当的机械刺激。
体外模拟法具有操作简单、效率较高等优点，但其分化效果受多种因素影响，如培养条件、细胞外基质等。
细胞诱导分化方法的选择应根据具体研究目的和细胞类型来确定。
不同的方法有不同的优缺点，研究人员应结合实际情况进行选择。
此外，细胞诱导分化仍然存在许多挑战，如诱导效率提高、稳定性改善等，研究人员需要在不断探索中完善和优化这些方法。
树突状细胞的体外培养及其诱导的抗肺癌免疫作用
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尹小 川 ¨，杨达 宽¨ ，洪 志鹏 （ ） 昆明 医学 院第一 附属 医院胸 外科 ，云 南 昆明 ６ ０ ３ ； １ ５ ０ ２ ２ 昆明 医学 院第二 附属 医院心胸 外科 ，云 南 昆明 ６ ０ ０ ） ） ５ １ １
［ 要］ 目的 摘 建立体外培 养扩增树突状细胞 （ Ｃ） 的方法 ，并 观察其 诱导 的抗肿 瘤免 疫作 用．方法 Ｄ
ｗｉｈ ＧＭ —ＣＳＦ ａ ｄ Ｉ 一４ ａ ｄ ＤＣ ｗｅ ｅ ｐｕ ｓ ｄ ｗｉ ｕ ｒｓ ｌ ｂ ｅ ａ ｔ ｅ ｂ ｔａ ｔｄ ｆｏ ｌ ｎ ａ ｃ ｒｃ Ｕ ｌｎ ｔ ｎ Ｌ ｎ ｒ ｌｅ ｔ ｔ ｍｏ ｏ ｕ ｌ ｎ ｉ ｎ ａ ｓｒｃ ｅ ｒ ｍ ｕ ｇ ｃ ｎ ｅ ｅ ｉ ｅ ｈ ｇ
前 者 为 ８ ． ％ 、６ ． ％ 、４ ． ％ 和 ５ ． ％ ，后 者 为 ４ ． ％ 、３ ． ％ ， ５ ０ 和 ３ ． ％ ． 结 论 ４７ ６９ ９３ ６０ ３５ １３ ４．％ ２４ 成 功 的诱 导 出
具有典 型形态特征及 增强 Ｌ Ｋ细胞杀伤活性 的 Ｄ ． Ａ Ｃ ［ 关键词 ］树 突状细胞 ；肺肿瘤 ；免疫作用 ［ 中图分类号 ］Ｒ ３ ． ［ ７４２ 文献标识码 】Ａ ［ 文章编号 ］１０ ４０ （ ０７ ４—０２ ０ ０ ３— ７ ６ ２ ０ ）０ ０ ３— ４
Ｉ ｔ ｏ Ｃｕ ｔ ｒ ｆ Ｄｅ ｄｒｔｃ Ｃｅ ｌａ ｄ Ｉｓ Ｉ ｕｃ ｄ ｎ Ｖｉｒ ｌｕ ｅ ｏ ｎ ｉｉ ｌ ｎ ｔ ｎｄ ｅ
不同种培养基对体外诱导免疫细胞的生物活性及细胞毒作用
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一种高效体外扩增自体NK细胞的培养体系及培养方法[发明专利]
![一种高效体外扩增自体NK细胞的培养体系及培养方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/a2fbdbe177a20029bd64783e0912a21614797fff.png)
(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201510690590.X(22)申请日 2015.10.22C12N 5/0783(2010.01)(71)申请人苏州科贝生物技术有限公司地址215123 江苏省苏州市工业园区星湖街218号C5独栋苏州科贝生物技术有限公司(72)发明人姬云 周艳 王珏 孙石磊吴守亮 姬星河(54)发明名称一种高效体外扩增自体NK 细胞的培养体系及培养方法(57)摘要本高效体外扩增自体NK 细胞的培养体系及培养方法，培养体系包括含GT-T551基础培养基、白细胞介素IL-2、白细胞介素IL-12、白细胞介素IL-15、白细胞介素IL-18、白细胞介素IL-17、白细胞介素IL-22和天然中药物质。
培养方法为：采集并分离自体40ml 外周血单个核细胞，用含10％自身血浆培养基重悬细胞，加入到用CD3抗体或CD56抗体包被的细胞培养瓶中，细胞因子组合A 刺激，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育并振摇，6-7天后转入细胞培养袋中培养并补加含细胞因子组合B 培养基，培养期间，每隔3-4天在含有IL-2基础培养基培养，共培养17-19天可得到高纯度性的NK 细胞。
本培养基及培养方法能使NK 细胞体外扩增1000倍以上，获得超过5X109次方的高纯度NK 细胞。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书5页 附图1页CN 105238752 A 2016.01.13C N 105238752A1.一种高效体外扩增自体NK细胞的培养体系，其特征在于，所述的培养体系包括含GT-T551基础培养基、特异因子组合A和特异因子组合B；所述的特异因子组合A包含IL-2、IL-12、IL-15、lL-17，IL-18、IL-22，其中IL-2浓度为1000u/ml、IL-12的浓度为100-200ng/ml、IL-15的浓度为100-200ng/ml、IL-17的浓度为200-400ng/ml、IL-18的浓度为100-200ng/ml、IL-22的浓度为100-200ng/ml；所述的特异因子组合B包含来自天然中药物质提取物的单个成分或多个成分组合：为人参皂苷、三七皂苷、紫杉醇、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、黄芩素、沙苑子总黄酮、姜黄素、云芝多糖中的一种或两种物质组合，其浓度分别为人参皂苷2-5ug/ml、三七皂苷2-5ug/ml、紫杉醇2-6ug/ml、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)5-8ug/ml、黄芩素5-8ug/ml、沙苑子总黄酮3-5ug/ml、姜黄素3-5ug/ ml、云芝多糖5-10ug/ml。
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过继性T细胞治疗是过继性细胞免疫治疗研究的重点，但对MHCI类分子阴性的肿瘤细胞无效，而NK细胞(Natural killer cell, NK细胞)由于表达MHCI类分子的抑制性受体-杀伤细胞抑制性受体(Killer inhibitory receptor, KIR)，可以杀灭MHCI类分子阴性的肿瘤，随着对NK细胞研究的深入，目前NK细胞用于肿瘤免疫治疗成为研究热点。
19世纪80年代兴起的细胞过继免疫治疗带给了肿瘤患者一个新的希望。
自然杀伤(natural killer, NK)细胞作为机体抗肿瘤的第一道防线，再加上其对肿瘤细胞的杀伤作用是由其表面抑制性受体和活化性受体的共同信号决定，所以NK细胞成为近年细胞过继免疫治疗的研究热点。
自然杀伤细胞表面标志与分类1．依据表面标志分为CD56bright和CD56dim两个亚群NK细胞表达众多表面分子，但只具有相对特异性。
通常将CD56+CDl6+CD3-TCR―BCR―的淋巴样细胞定为NK细胞，并以CD56的表达密度不同，将NK分为CD56bright和CD56dim两群。
CD56bright NK细胞高表达CD56、CD94／NKG2A和L选择素(CD62L)；低表达CDl6和KIR；表达高亲和力的IL2受体(1L-2RapY)。
而CD56dim NK细胞高表达CDl6、PEN5、KIR和LFA―1；低表达CD56，CD94／NKG2A；仅表达不带。
链的中亲和力的IL-2受体(IL-2Rβγ)。
NK细胞亚群CD56bright和aD56dim的表型特点2．依据细胞因子分泌格局分为NKl和NK2两个亚群NK细胞也存在着类似Thl和Th2样的亚群。
分离外周CDl6+，或CD56+细胞，用ILl2和抗IL―4抗体可以诱导出分泌IFN―Y的Thl型NK亚群，用IL4和抗体诱导出分泌IL5、ILl3的Th2型NK细胞亚群，分别命名为NKl和NK2。
也有人认为NK细胞发育经历K2一NK0一NKl的过程。
在这一过程中IL4促进NK2增殖；ILl2促使NK2向NKl转变，并促进NKl的或熟。
3．依据黏附功能分为黏附NK和非黏附NK两个亚群根据NK细胞在IL2的诱导下表现出的黏附能力，分为黏附NK(A―NK)和非黏附NK(NA―NK)两个亚群。
A―NK细胞的表型比较均一，主要为CD3―CD56dim CDl6十IL2R+，不含CD56bright细胞。
NA―NK细胞是具有不同表型的异质性群体，各种表型如CD56bright、CD56dim、CD56―、CDl6十、CDl6―均可存在。
方法：1.采取10例健康志愿者和山西省肿瘤医院血液科10例AML患者外周血15ml,运用常规单个核细胞提取法提取单个核细胞，分别放于含有SCGM培养基的培养孔中培养，前5d加入0.5ul CD3McAb，在培养的第5d，倒掉含有CD3McAb 的培养液，加入含有rhIL-2的SCGM培养基。
隔日补充一次培养液，直至第25d 。
2. 运用细胞计数仪检测培养第0d、5d、10d、15d、20d及第25d的细胞数量及细胞存活率。
3. 运用流式细胞仪检测培养第0d、5d、10d、15d、20d及25d细胞中的NK细胞百分率和T细胞百分率。
4. 采用比色法检测培养第0d、5d、10d、15d、20d及25d分选出的NK细胞对K562细胞和RPMI8226细胞的杀伤活性。
健康志愿者即健康人群NK细胞的最佳培养时间间期是20d。
1．细胞增殖活性的测定采用改进的四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法于培养的第1，4，7，10和第14天分别取细胞，充分洗涤，以1×10 6/ml浓度加入96孔平底板中，每孔0.2ml，设3个复孔，培养箱中培养48h后，每孔加MTT（5mg/ml）20ul，继续培养4h，然后翻板，每孔滴加100ul二甲基亚砜（DMSO）轻轻振荡10min后在酶标仪上570nm处测定吸光度（OD值），取3孔均值，OD 值高则增殖快。
2. 细胞杀伤活性的测定采用MTT法进行免疫活性细胞的细胞毒性测定靶细胞为Anip973和K562肿瘤细胞，效应细胞为完全培养基和AIMV分别培养的A-NK细胞和NA-NK细胞，效靶比例为100:1。
设立效应细胞和靶细胞共同孵育孔（E+T），效应细胞对照孔（E）和靶细胞对照孔（T），每组设3个复孔，操作方法同1.4。
测定的OD值，取3孔均值，公式如下［2］:细胞杀伤活性（%）=［1+（OD E+T -OD E ）/OD T ］×100.3. 细胞表型分析细胞诱导3～5h后，分别收集完全培养基和AIMV培养的A-NK细胞和NA-NK 细胞，按5×10 5 个细胞/管，用美国Becton-Dickinson公司的流式细胞仪检测并分析CD11 c 的表达。
4. 透射电镜标本制备在培养瓶中将A-NK细胞和K562肿瘤细胞共同培养，过夜，第二天取出离心（4000rpm×5min），用3%戊二醛固定30min（37℃）后按常规处理电镜标本。
目的：通过改进培养基及细胞因子体系从而制订更优的NK细胞体外培养扩增方案，为临床NK免疫细胞治疗提供实验依据。
方法：4例血细胞分离机单采的新鲜白细胞及3例复苏的G-CSF动员后的外周血造血干细胞(PBSCs),通过破红、去血小板、弃贴壁细胞等处理,调节悬浮细胞浓度至5×106/ml，添加细胞因子(包括1000U/ml rh IL2、10ng/ml rh IL12、10ng/ml rh IL15、10ng/ml rh IL21)后培养于37℃5%CO2孵箱中6天。
根据不同培养基及是否添加rh IL-18将实验组分为AIM-V±rh-IL18组及SCGM±rh-IL18组,rh IL-18浓度为20ng/ml。
每隔2~3天半量换液，调节细胞浓度至2×106/ml,并补充相应细胞因子。
收集培养到第3天(D3)及第6天(D6)的细胞进行计数、NK纯度及功能表型检测。
结果：SCGM+rh IL18相比AIM-V组能使NK细胞扩增能力明显增强,培养到D6天NK细胞绝对值上调4~8倍,NK纯度提高10%~20%(P0.05)。
培养到D6天时,SCGM+rh IL18相比AIM-V组能使NK细胞的穿孔素、颗粒酶的表达分别上调(19±4)%及(10±4)%(P0.05),迁移表型CD62L及成熟表型CD57的表达分别上调(12±4)%及(7±2)%(P0.05)。
而且SCGM+rh IL18能使NK细胞分泌更高水平IFNγ(P0.05)。
另外,NK细胞的功能表型及分泌IFNγ的能力随着培养时间的延长明显递增(D6D3D0)(P0.05)。
结论：本实验证明SCGM培养基联合IL-12/15/18是体外培养制备NK细胞的更好策略,能进一步提高NK细胞的纯度、绝对值、功能表型及分泌IFNγ的能力。
本实验为临床上同种异体NK细胞治疗移植后复发AML提供了理论依据：有望进一步提高GVL效应并减少GVHD发生。
恶性肿瘤所致的死亡率中，白血病在男性中居第六位，女性中居第八位，儿童及35岁以下成人中则居第一位。
白血病的治疗目前包括放、化疗药物降低瘤负荷获得缓解；移植和免疫治疗。
CTL (Cytotoxic T cell, CTL)细胞目前在血液临床方面主要应用于外周血干细胞移植和其他过继免疫治疗中。
根据移植物的来源不同移植分为自体移植和同型异体移植。
自体外周血干细胞移植(Auto-HSCT)无G VHD，移植后生活质量较高，但因无GVLE (graft-versus gost effect,，GVLE)，易复发。
自体外周血干细胞移植主要靠自身CTL细胞杀灭肿瘤细胞。
如果在移植后辅助性输注一定量的自身体外诱导的白血病抗原特异性的CTL细胞，复发问题可能会在一定程度上得以解决。
或自体移植的基础上输入一定量的供者来源的白血病细胞特异性的CTL细胞，增加GVLE，在某种程度上可能会改变自体移植的效果。
异基因造血干细胞移植(Allogeneic stern cell transplantion, Allo-S CT)，由于存在GVLE，使得一些患者能够得以长期生存，然而伴随而来的移植物抗宿主病(Graft versus host disease, GVHD)，严重感染，植入失败，造血重建延迟等相关并发症成为移植成功的巨大障碍。
CTL细胞是GVHD及GVLE的效应细胞，也是预防移植后感染、促进植入和造血重建的重要免疫细胞。
供者淋巴细胞输注(Donor lymphocyte transfusions, DLT)能诱导出GVLE消除白血病复发，CTL细胞是它的主要效应细胞。
DLI在受者体内也会产生多种移植相关并发症，如何得到最佳疗效，使DLI得到更好的应用，是现在临床面临的一大课题。
ALL细胞表面缺乏淋巴细胞功能性抗原(LFA-1)，ALL对NK的治疗效果差，C TL细胞似乎成了除了药物唯一能针对ALL肿瘤的效应细胞了。
CTL细胞在免疫治疗思想及技术路线上已经展示出了它的重要性。
临床上发现，植入是否成功以及GVHD的严重程度与移植后供、受体T细胞比例显著相关。
异基因干细胞移植即便是完全供者型，也并没有彻底去除受者的效应细胞及记忆细胞，找出针对自身肿瘤细胞的受者的CTL克隆，发挥RVLE (Recepient-versus leukemi effect, RVTE)，在排斥及RVLE之间找到最佳平衡点，不仅能发挥自身识别肿瘤的免疫清除功能，而且协同供者成分发挥杀瘤效应，同时有助于了解代替免疫与过继免疫的理念，分析临床上见到的一些患者移植失败后并无疾病复发获得长时间生存，而一些患者在完全供者嵌合(FDC)状态下出现原疾病复发的原因。
Wilms tu mor antigen-1(WT1)过度表达在70%-90%的ALL病人中，而这样的病人有着高的复发率。
体外及小鼠研究中的证实，WT1是一个有意义且广泛表达的白血病抗原靶标。
髓性白血病和健康供者中有WTl特异性的T细胞，说明WTl的表达很容易诱导出T细胞反应。
WT1特异性的CD8+的T细胞和白血病肿瘤负荷减轻密切相关。
高度纯化CD8+T细胞混合骨髓移植会产生高GVL效应低的致死性GVHD已得到证实。
如果能够培养分离出具备高度选择性杀伤白血病细胞的CTL克隆，对正常细胞无明显作用，无GVHD，无排斥，宿主完全耐受，扩增率高并能在体内增殖，具有强大的细胞毒性及白血病细胞清除能力，那么分离G VHD与GVL即将成为可能，改善自体移植效果成为可能，增进过继免疫治疗成为可能。
那么如何在体外得到高度纯化的抗原特异性CTL细胞？这就是本实验的主要研究目标：拟在体外分离培养CD8+WT1特异性的CTL细胞克隆，并从多方位鉴定其功能特性及其来源，为进一步的研究及应用打下坚实的基础。