转录组测序技术原理及应用PPT课件
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转录组测序ppt课件
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2019/5/5
环境转录组也可以这样做
• 使用RNA-seq手段对实验样本进行转录组分析，关注个体或者组织器 官在不同环境条件下基因表达的动态变化，挖掘生物对逆境适应的分 子机制。
转录组？
• 转录组是特定组织或细胞在某一功能状态下所能 转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编码 RNA。
• 转录组（transcriptome）广义上指某一生理条件 下，细胞内所有转录产物的集合，包括信使RNA、 核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA；狭义上指所有 mRNA的集合。蛋白质是行使细胞功能的主要承担 者，蛋白质组是细胞功能和状态的最直接描述， 转录组成为研究基因表达的主要手段，转录组是 连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必 然纽带，转录水平的调控是目前研究最多的，也 是生物体最重要的调控方式。
3. DNA成簇（Cluster）扩增
4. 高通量测序（Illumina Genome Analyzer IIx）信息分析流程
生物信息分析
基本信息分析
• 数据量产出：>2Gb per sample • 测序策略：HiSeq2000, PE91 or 101 • 插入片段大小：200 bps • 测序质量控制：Q20% >80
相关概念
• 高通量测序中，每测一个碱基会给出一个相应的质量值， 这个质量值是衡量测序准确度的。Q20与Q30则表示质量值 大于等于20或30的碱基所占百分比。
• Q20值是指的测序过程碱基识别过程中，对所识别的碱基 给出的错误概率。
• 质量值Q20，错误识别概率是1%，即正确率是99%； 质量值Q30，错误识别概率是0.1%，即正确率是99.9%； 质量值Q40，错误识别概率是0.01%，即正确率99.99%； Q“N”0的质量值，就是正确率有N个9的百分比。
RNA-seq技术原理及应用-课件PPT
2. 2005 年以来，以 Roche 公司的 454 技术、 Illumina 公司的 Solexa 技术和 ABI 公司的 SOLiD 技术为标志的新一代测序技术相继诞生，又称作深 度测序技术。
3.把高通量测序技术应用到由 RNA 逆转录生成 的 cDNA 上，从而获得来自不同基因的RNA 片段 在特定样本中的含量，这就是 RNA测序或 RNA-
总结
高通量测序技术的应用面非常广，RNA-seq 只是 其中一个方面，除此之外，基因组的从头测序和重 测序 、染色质免疫沉淀测序、甲基化测序等技术都 同样有着广泛的应用。
进一步，通过对供体和受体位点的读段计数，结合 外显子其他区域的读段数据，还能定量地计算选择性 剪接事件之间的比例。
三、RNA-seq结果分析
两类样本 RNA-seq 数据比较分析的框架
四、RNA-seq技术应用
1、转录本结构研究 利用单碱基分辨率的RNA-Seq技术可极大地丰
富基因注释的很多方面内容, 包括 5′/3′边界鉴定、 UTRs区域鉴定以及新的转录区域鉴定等。RNA-Seq 还可对可变剪接(Alternative splicing)进行定量研究。
三、RNA-seq结果分析
2. 基因表达水平估计 RNA-seq 数据最基本的应用是检测基因的表达水 平 ，与基因芯片数据相比 ，RNA 测序得到的是数字 化的表达信号，具有灵敏度高、分辨率高、无饱和区 等优势。 RNA 测序数据是对提取出的 RNA 转录本中随机 进行的短片段测序，如果一个转录本的丰度高，则测 序后定位到其对应的基因组区域的读段也就多，可以 通过对定位到基因外显子区的读段计数来估计基因表 达水平。
二、RNA板扩增
序列
1234
TTTT…
簇序列读取反应
3.把高通量测序技术应用到由 RNA 逆转录生成 的 cDNA 上，从而获得来自不同基因的RNA 片段 在特定样本中的含量，这就是 RNA测序或 RNA-
总结
高通量测序技术的应用面非常广，RNA-seq 只是 其中一个方面，除此之外，基因组的从头测序和重 测序 、染色质免疫沉淀测序、甲基化测序等技术都 同样有着广泛的应用。
进一步，通过对供体和受体位点的读段计数，结合 外显子其他区域的读段数据，还能定量地计算选择性 剪接事件之间的比例。
三、RNA-seq结果分析
两类样本 RNA-seq 数据比较分析的框架
四、RNA-seq技术应用
1、转录本结构研究 利用单碱基分辨率的RNA-Seq技术可极大地丰
富基因注释的很多方面内容, 包括 5′/3′边界鉴定、 UTRs区域鉴定以及新的转录区域鉴定等。RNA-Seq 还可对可变剪接(Alternative splicing)进行定量研究。
三、RNA-seq结果分析
2. 基因表达水平估计 RNA-seq 数据最基本的应用是检测基因的表达水 平 ，与基因芯片数据相比 ，RNA 测序得到的是数字 化的表达信号，具有灵敏度高、分辨率高、无饱和区 等优势。 RNA 测序数据是对提取出的 RNA 转录本中随机 进行的短片段测序，如果一个转录本的丰度高，则测 序后定位到其对应的基因组区域的读段也就多，可以 通过对定位到基因外显子区的读段计数来估计基因表 达水平。
二、RNA板扩增
序列
1234
TTTT…
簇序列读取反应
转录组分析(RNA-Seq)-PPT文档资料
原则上, 所有的高通量测序技术都能进行RNA测序。自2019 年以来, 以Roche 公司的454 技术、Illumina 公司的 Solexa 技术和ABI 公司的SOLiD 技术为标志的新一代测 序技术相继诞生, 之后HelicosBiosciences 公司又推出单 分子测序(Single molecule sequencing, SMS)技术。新一 代测序又称作深度测序或高通量测序, 是相对于传统的 Sanger 测序而言,主要特点是测序通量高, 测序时间和成 本显著下降。各平台测序原理及序列长度的差异决定了各 种高通量测序仪具有不同的应用侧重
Random hexamer primed cDNA synthesis
Paired-end
Solexa Sequencing
-6- dT微珠纯化mRNA ������ mRNA片段化处理 ������ 反转录反应合成合成双链cDNA ������ 双链DNA末端修复及3’末端加‘A’ ������ 使用特定的测序接头连接DNA片 段两端
转录组分析（RNA-Seq）
• 李江攀
RNA-Seq 的技术背景 RNA-Seq 的应用领域 RNA-Seq 面临的挑战及发展前景
RNA-Seq 的技术背景
RNA-Seq又称转录组高通量测序（transcriptome sequencing）或称为全转录组鸟枪法测序（Whole Transcriptom Shotgun Sequencing WTSS）
数字表达谱与芯片的比较
特点
数字化信号 高通量 可重复性高 无需重复实验 检测低丰度基因 检测新转录本 检测反义链转录本
数字表达谱
√ √ √ √ √ √ √
芯片
√
Unigene12000个以上，但转录组大小受基因数目和基因丰度双 重影响，组织差异、状态和实验处理也会影响转录组组成。Βιβλιοθήκη RNA-Seq 的发展前景
Random hexamer primed cDNA synthesis
Paired-end
Solexa Sequencing
-6- dT微珠纯化mRNA ������ mRNA片段化处理 ������ 反转录反应合成合成双链cDNA ������ 双链DNA末端修复及3’末端加‘A’ ������ 使用特定的测序接头连接DNA片 段两端
转录组分析（RNA-Seq）
• 李江攀
RNA-Seq 的技术背景 RNA-Seq 的应用领域 RNA-Seq 面临的挑战及发展前景
RNA-Seq 的技术背景
RNA-Seq又称转录组高通量测序（transcriptome sequencing）或称为全转录组鸟枪法测序（Whole Transcriptom Shotgun Sequencing WTSS）
数字表达谱与芯片的比较
特点
数字化信号 高通量 可重复性高 无需重复实验 检测低丰度基因 检测新转录本 检测反义链转录本
数字表达谱
√ √ √ √ √ √ √
芯片
√
Unigene12000个以上，但转录组大小受基因数目和基因丰度双 重影响，组织差异、状态和实验处理也会影响转录组组成。Βιβλιοθήκη RNA-Seq 的发展前景
转录组测序技术原理及应用
转录组测序技术原理及应用转录组测序技术原理及应用：转录组测序技术可以帮助研究者了解细胞或组织中全部转录本的类型及其相对表达水平，从而揭示基因的功能和表达调控机制。
本文将介绍转录组测序技术的原理及其在生命科学研究中的应用。
转录组是特定细胞或组织中所有mRNA的集合，转录组测序即是测定所有mRNA的序列和表达水平。
传统的方法是利用几个重要的基因进行差异表达研究，但其局限性在于只能检测少量基因的表达水平。
而转录组测序技术的出现，使得研究者可以全面了解细胞或组织中的基因表达情况。
转录组测序技术主要有两种方法：全长转录组测序和测序-by-synthesis。
全长转录组测序技术是利用长读长的方法，直接测定mRNA的全长序列。
其中最具代表性的技术是RNA-seq。
该方法主要包括以下几个步骤：RNA提取、RNA 分离、RNA片段化、cDNA合成、文库构建、测序和数据分析。
首先，需要从样品中提取总RNA，并经过纯化和富集步骤，去除干扰物质。
然后，将RNA 切割成短片段，随后利用逆转录酶合成第一链cDNA。
接着，用DNA聚合酶合成第二链cDNA，并进行文库构建。
最后，将文库进行高通量测序，获取转录组数据。
数据分析通常包括预处理、比对、表达矩阵的构建、差异分析和功能注释等步骤。
通过该方法，可以得到高质量的转录组数据，进而研究目标细胞或组织中的基因表达情况。
测序-by-synthesis技术是通过测定每个mRNA片段的长度和表达水平，进而还原出全长的mRNA序列。
这种技术通常使用short-read测序技术，如Illumina （第二代测序仪），其基本原理是将DNA片段固定在流动细胞中，利用荧光染料标记的碱基链延伸的方式进行测序。
针对短读长的特点，通常需要对样本进行切割，并进行高通量测序。
此外，还需要进行数据重组和序列拼接。
虽然短读长测序技术成本较低，但由于测序片段的长度受限，会对结果的准确性和可靠性产生一定影响。
转录组测序技术的应用非常广泛。
转录组测序原理.pptx
激发碱基荧光并收集荧光信号
去除阻断基团和荧光基团
Cycle 2-n:
重复前面的步骤
第16页/共40页
ห้องสมุดไป่ตู้基片段杂交
OH
diol
P7 P5
Flow Cell接头
diol diol
模板杂交
diol diol
延长
diol diol
变性
第17页/共40页
Cluster station
• 剩下的复制链其一端“固定”在芯片上，
Throughput : up to 25 Gb per day
Output 26-35 Gb 75-100 Gb 150-200 Gb
第15页/共40页
基于SBS测序技术
3’-
…-5’
5’-
GTATTTTCGGCACAG
A
G
A
C
T
T
C TG
Cycle 1:按顺序加入反应试剂
合成第一个碱基
清除未反应的碱基和试剂
第25页/共40页
鉴定基因可变剪接
exon1
common reads
exon2
exon3
mRNA
exon1
junction reads
exon3
exon1
exon2
exon3
第26页/共40页
鉴定融合基因
第27页/共40页
Paired Reads distribution
Reads cluster
主要内容• 样品检测 • 制备 • Cluster Station • Illumina Sequencing • 生物信息分析
第14页/共40页
新一代测序技术
RNA-SEQ原理及应用解析PPT课件
二者的关系：测序深度与基因组覆盖度之间是一个正相关的关系， 测序带来的错误率或假阳性结果会随着测序深度的提升而下降。 当测序深度在10～15X以上时，基因组覆盖度和测序错误率控 制均得以保证。
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2020/1/1
11
• 3、RPKM（reads per kilobase per million reads）是每百万 读段中来自于某基因每千碱基长度的读段数。其公式为:
6
高通量测序
• 高通量测序技术（High-throughput sequencing）是指 能够一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定， 每一次序列测定的读长一般较短的测序技术。
• 高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对 几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文 献中称其为下一代测序技术(next generation sequencin g)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种 的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又 被称为深度测序(deep sequencing)。
所以近年来，许多通过RNA-seq进行测序分析的文章都包括对
ncRNA的分析，并且发现了许多新的ncRNA。
5
二、RNA-seq技术原理
RNA-seq 实验流程图
首先，我们获得细胞总RNA，然后根据实 验需要，比如是需要测mRNA，ncRNA还 是 smallRNA等，对RNA样品进行处理。处理
好的RNA再进行片段化最后用新一代高通量测序 依进行测序。
8
三种高通量测序技术的优缺点
9
高通量测序中重要名词解释
• 1、测序深度：测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。 假设一个基因组大小为7M，测序总碱基数为70M，则测序深 度为10×。
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• 3、RPKM（reads per kilobase per million reads）是每百万 读段中来自于某基因每千碱基长度的读段数。其公式为:
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高通量测序
• 高通量测序技术（High-throughput sequencing）是指 能够一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定， 每一次序列测定的读长一般较短的测序技术。
• 高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对 几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文 献中称其为下一代测序技术(next generation sequencin g)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种 的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又 被称为深度测序(deep sequencing)。
所以近年来，许多通过RNA-seq进行测序分析的文章都包括对
ncRNA的分析，并且发现了许多新的ncRNA。
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二、RNA-seq技术原理
RNA-seq 实验流程图
首先，我们获得细胞总RNA，然后根据实 验需要，比如是需要测mRNA，ncRNA还 是 smallRNA等，对RNA样品进行处理。处理
好的RNA再进行片段化最后用新一代高通量测序 依进行测序。
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三种高通量测序技术的优缺点
9
高通量测序中重要名词解释
• 1、测序深度：测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。 假设一个基因组大小为7M，测序总碱基数为70M，则测序深 度为10×。
转录组测序技术原理及应用 ppt课件
新型安捷伦2200 TapeStation 系统是新一代测序（NGS）、生物微阵列芯片分析和qPCR 工作流程以及蛋白质纯化和抗体生产过程中对生物样品进行质量控制（QC）的理想解 决方案。 ● 可扩展的通量—16联或96孔微量滴定板 ● 快速得到结果—平均每个样品只需一分钟便可获得结果 ● 使用简单—可直接使用的ScreenTape预制胶条简化了工作流程 ● 样品用量少—每次运n Illumina Sequencing 生物信息分析
转录组测序技术原理及应用
Applications of RNA-Seq
Application
Expression-profiling Alternative Splicing Fusion Gene SNP detection
真核mRNA的纯化
mRNA的纯化主要通过的磁珠与 生物素吸附原理从而分离纯化
Oligo（dT）25磁珠纯化原理主要 是mRNA的3′的poly A与磁珠在 bindingbuffer的作用下相结合。磁 珠通过MPC（磁分离器）从溶液 中分离出来。
mRNA与磁珠结合后，再用Tris-
HCL在加热条件下解离洗脱到溶
加入1µl的stop buffer终止 反应。
加入沉淀剂（NaAc 糖原 无水乙醇）沉淀产物。
RT ds cDNA
转录组测序技术原理及应用
末端修复(防止自连） cDNA 3′末端加A Adapter连接
转录组消化DNA
↓
mRNA的分离
↓
mRNA的打断
Size selection, then PCR amplification
HiSeq 2000n Illumina Sequencing 生物信息分析
转录组测序技术原理及应用
转录组测序技术原理及应用
Applications of RNA-Seq
Application
Expression-profiling Alternative Splicing Fusion Gene SNP detection
真核mRNA的纯化
mRNA的纯化主要通过的磁珠与 生物素吸附原理从而分离纯化
Oligo（dT）25磁珠纯化原理主要 是mRNA的3′的poly A与磁珠在 bindingbuffer的作用下相结合。磁 珠通过MPC（磁分离器）从溶液 中分离出来。
mRNA与磁珠结合后，再用Tris-
HCL在加热条件下解离洗脱到溶
加入1µl的stop buffer终止 反应。
加入沉淀剂（NaAc 糖原 无水乙醇）沉淀产物。
RT ds cDNA
转录组测序技术原理及应用
末端修复(防止自连） cDNA 3′末端加A Adapter连接
转录组消化DNA
↓
mRNA的分离
↓
mRNA的打断
Size selection, then PCR amplification
HiSeq 2000n Illumina Sequencing 生物信息分析
转录组测序技术原理及应用
系统生物学-第三讲-转录组学PPT课件
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• 第一个被确认的miRNA——在线虫中首次发现的lin-4 和 let-7 ，可以通过部分互补结合到目的mRNA靶的3’非编 码区(3’UTRs)，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制， 进而抑制蛋白质合成，通过调控一组关键mRNAs的翻译 从而调控线虫发育进程。
继线虫之后，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多 种生物物种中鉴别出数百拼接和注释表达与分类功能分析作用机理分析qpcr验证est软件平台est序列库序列的质量检查测序量监控聚类和拼接检查借助于基因组信息全长orf寻找发现全长基因研究表达基因概况的主要实验手段dnachipproteomics的先驱功能分类表达量分析交替剪接检测est特有信息microarray和genechip大规模表达谱或全景式表达谱globalexpressionprofile
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40
表达序列标签(EST)测定及分析
1、什么是EST? 2、EST的应用 3、EST序列测定及分析过程
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41
1、表达序列与表达序列标签概念
(1) 什么是表达序列?
基因组表达为RNA的序列: mRNA和功能RNA
(2) 什么是表达序列标签?
（expressed sequence tag, EST）
• 转录组研究是基因功能及结构研究的基础和 出发点，是解读基因组功能原件和揭示细胞 及组织分子组成所必需的。
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34
• 转录组的特点：受到内外多种因素的调节，因而是 动态可变的。能够揭示不同物种、不同个体、不同 细胞、不同发育阶段及不同生理病理状态下的基因 差异表达信息。
.
35
• 转录组学（Transcriptomics）：研究细胞在某 一功能状态下所含mRNA的类型与拷贝数；比较不
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Total RNA
Eukaryon
Procaryon
Enrich mRNA by OligoT
Remove rRNA
RNA fragmentation (200nt~700nt)
Random hexamer primed cDNA synthesis
Size selection, then PCR amplification
Eukaryon
Procaryon
Enrich mRNA by OligoT
Remove rRNA
RNA fragmentation
Random hexamer primed cDNA synthesis
Size selection, then PCR amplification
HiSeq 2000 sequencing
Size selection, then PCR amplification
HiSeq 2000llumina Sequencing 生物信息分析
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Applications of RNA-Seq
Application
Expression-profiling Alternative Splicing Fusion Gene SNP detection
RT ds cDNA
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末端修复(防止自连） cDNA 3′末端加A Adapter连接
.14第一天制备第二天第三天消化DNA
↓
mRNA的分离
↓
mRNA的打断
↓
cDNA的合成
末端修复
↓
3’端↓ 加A
↓
加接头↓胶回收质量检测： Aligent 2100：片段大小、纯度、浓度 qPCR：片段大小、浓度 手工检测：跑胶验证。
O
Small RNA 测序
Small RNA
O
降解组测序 mRNA
Non-coding RNA测序
Non-coding RNA
O
O
表达谱研究
O
O
O
O
基因结构分析
O/X
X
X
O
EST 测序
O/X
X
X
X
筛选分子标记
O
O
O
X
转录融合基因 表达
O/X
XXXຫໍສະໝຸດ .5Workflow of RNA-Seq
Total RNA
RNA-Seq (Transcriptome resequencing)
11
原核mRNA的纯化
Ambion MICROExpress Kit
LNA扣锁型探针
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12
mRNA反转录---fragment+RT
纯化过的mRNA样品加入 1 µl的fragment buffer 70℃ 作用1.5min。
加入1µl的stop buffer终止 反应。
加入沉淀剂（NaAc 糖原llumina Sequencing 生物信息分析
.
6
Total RNA样品检测
Agilent 2200 检测 OD260/280:1.8~2.2 RNA 28S:18S ≥ 1.0; RIN≥7
新型安捷伦2200 TapeStation 系统是新一代测序（NGS）、生物微阵列芯片分析和qPCR
RNA测序技术原理及应用
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1
基因组—转录组—表观遗传组—蛋白组层次
遗传的中心法则
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2
什么是转录组？
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All transcripts
All mRNAs
3
RNA是解读基因组的关键
Genotype
Phenotype
DNA
Protein
RNA
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4
RNA 测序技术
测序技术 研究对象 鉴定新分子
RNA-Seq mRNA
工作流程以及蛋白质纯化和抗体生产过程中对生物样品进行质量控制（QC）的理想解
决方案。
● 可扩展的通量—16联或96孔微量滴定板
● 快速得到结果—平均每个样品只需一分钟便可获得结果
● 使用简单—可直接使用的ScreenTape预制胶条简化了工作流程
● 样品用量少—每次运行仅需要不到2ul样品
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7
检测报告-合格样品
棉铃虫/果蝇
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8
检测报告-不合格样品
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9
Workflow of RNA-Seq
Total RNA
Eukaryon
Procaryon
Enrich mRNA by OligoT
Remove rRNA
RNA fragmentation (200bp)
Random hexamer primed cDNA synthesis
Size selection, then PCR amplification
HiSeq 2000llumina Sequencing 生物信息分析
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10
真核mRNA的纯化
链霉亲合素包被磁珠+生物素标记 Oligo（dT）25+poly（A）
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mRNA的纯化主要通过的磁珠与 生物素吸附原理从而分离纯化
Oligo（dT）25磁珠纯化原理主要 是mRNA的3′的poly A与磁珠在 bindingbuffer的作用下相结合。磁 珠通过MPC（磁分离器）从溶液 中分离出来。
mRNA与磁珠结合后，再用TrisHCL在加热条件下解离洗脱到溶 液中。
RNA-Seq (单端测序---Quantification)
√ － － －
RNA-Seq (双端测序---Transcriptome)
√ √ √ √
HiSeq 2500
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1717
RNA-Seq (Transcriptome)
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18
Workflow of RNA-Seq(Transcriptome)
.
PCR
↓
PCR胶回收
15
Workflow of RNA-Seq
Total RNA
Eukaryon
Procaryon
Enrich mRNA by OligoT
Remove rRNA
RNA fragmentation (200bp)
Random hexamer primed cDNA synthesis
HiSeq 2000 sequencing 101PE
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生物信息学分析
19
RNA-Seq (Transcriptome)
Technique
2
Characterize the transcriptome in unparalleled detail
RNA-Seq (De novo transcriptome assembly)