26单克隆抗体制备——单抗亚型鉴
单克隆抗体的制备过程
单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。
通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。
制备过程1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。
一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。
抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
2、细胞融合采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。
将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。
在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。
在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。
未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。
只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。
通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。
采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。
经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。
5、单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法。
单克隆抗体的制备方法
单克隆抗体的制备方法
单克隆抗体的制备方法主要包括以下几个步骤：
1. 免疫兔或小鼠：首先选择一个目标抗原，这可能是一种蛋白质、多肽或其他分子。
然后，将该抗原注射到实验动物（通常是免疫兔或小鼠）的体内，以刺激其免疫系统产生抗原特异性的抗体。
2. 細胞樹突瘤：在动物体内产生抗体后，从其体内提取淋巴细胞，通常是从脾脏或骨髓中获得。
然后，将这些淋巴细胞融合到特定的癌细胞（如骨髓瘤细胞）中，形成融合细胞，称为淋巴瘤细胞。
3. 杂交瘤筛选：将淋巴瘤细胞培养在富含饲养基的培养皿中，使其成长为一种混合的细胞群。
然后，利用对抗体特异性的检测方法，如ELISA或流式细胞术，筛选出对目标抗原具有高亲和力和高特异性的单克隆抗体产生的杂交瘤细胞。
4. 单克隆抗体培养和纯化：将筛选出的单克隆抗体杂交瘤细胞进行扩增培养，并采用特定培养基和条件，如添加低髓酸和高髓酸补充物，以增加单克隆抗体的产量。
随后，通过离心、净化和纯化等步骤，从培养物中分离和纯化出单克隆抗体。
5. 验证和应用：对制备的单克隆抗体进行验证，包括测定其亲和力、特异性和功能等方面。
然后，将其应用于各种实验和临床研究领域，如免疫组织化学、免
疫印迹、流式细胞术和免疫疗法等。
需要注意的是，单克隆抗体的制备过程较为繁琐和耗时，并且存在一定的技术挑战。
因此，近年来还出现了许多其他方法来制备单克隆抗体，如基因工程技术和体外抗体筛选技术等，可以更快速和高效地得到目标单克隆抗体。
免疫学技术(单抗的制备)
剂量——0.5-100g 次数——视抗原而定 间隔——视抗原而定 佐剂——视抗原而定 收集时间：末次加强免疫后72-96h收集
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步骤二 骨髓瘤细胞的准备
常用骨髓瘤细胞系：SP2／0、NS1、P3.653 融合时骨髓瘤细胞的选择：
a.处于对数生长期，良好的形态，活细胞计 数高于95％
b.细胞株保持HGPRT（次黄嘌呤尿嘌呤核糖 转移酶）缺陷状态
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腹腔接种
取BALB/C 雌性小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石腊或 降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细 胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单 克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器 抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。
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体外细胞培养
总体上讲，杂交瘤细胞系并不是严格的贴壁依赖细胞， 因此既可以进行单层细胞培养，又可以进行悬浮培养。 杂交瘤细胞的单层细胞培养法是各个实验室最常用的 手段，即将杂交瘤细胞加入培养瓶中，以含10-15%小 牛血清的培养基培养，细胞浓度以1×106-2×106/ml 为佳，然后收集培养上清，其中单抗含量约1050ug/ml。 目前在杂交瘤细胞的大量培养中，主要有两种类型的 培养系统。其一是悬浮培养系统，采用转瓶或发酵罐 式的生物反应器，其中包括使用微载体；其二是细胞 固定化培养系统，包括中空纤维细胞培养系统和微囊 化细胞培养系统。 近来的研究表明，微载体培养法是杂交瘤细胞大量培 养的理想途径之一。
单克隆抗体制备流程
单抗制备流程1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序,逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前准备(一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果.下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0。
5ml ip (腹腔内注射)↓2~3周后第二次免疫1×10７／0。
5ml ip↓3周后加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv（静脉内注射)↓取脾融合2。
可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂，常用佐剂:福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。
要求抗原和佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态.商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│（一般0.8～1ml 0.2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip│（ip剂量不宜超过0。
5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)↓2~3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜,ip或iv↓3天后取脾融合目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程单克隆抗体是一种来源于单一B细胞克隆的抗体，具有高度的特异性和亲和力，被广泛应用于生物医药领域。
其制备流程主要包括免疫原制备、动物免疫、细胞融合、筛选和鉴定等步骤。
下面将详细介绍单克隆抗体制备的流程。
1. 免疫原制备。
首先需要准备纯化的抗原蛋白，可以是蛋白质、多肽、细胞膜蛋白等。
抗原蛋白的纯度和活性对单克隆抗体的制备至关重要，因此需要进行严格的纯化和活性检测。
通常采用亲和层析、离心、电泳等方法进行抗原蛋白的提取和纯化。
2. 动物免疫。
将纯化的抗原蛋白注射到小鼠或兔子等动物的体内，诱导其产生特异性抗体。
在免疫过程中，需要注意控制免疫程序，监测抗体滴度，以及合理调整免疫方案，以提高单克隆抗体的产量和质量。
3. 细胞融合。
从免疫动物中获取脾细胞或骨髓细胞，与骨髓瘤细胞（如SP2/0、NS-1等）进行融合，得到杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞具有较高的产抗体能力，能够长期稳定地分泌单克隆抗体。
4. 筛选和鉴定。
通过ELISA、免疫印迹、细胞免疫荧光等方法对杂交瘤细胞培养上清液进行筛选和鉴定。
筛选出特异性较强的单克隆抗体阳性杂交瘤细胞，并进行亚克隆的鉴定，最终获得单克隆抗体细胞株。
5. 扩大培养和纯化。
将筛选出的单克隆抗体细胞株进行扩大培养，获得大量的单克隆抗体上清液。
然后采用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等方法对单克隆抗体进行纯化，获得高纯度的单克隆抗体制剂。
总结。
单克隆抗体制备流程是一个复杂而又精细的过程，需要在每个环节都严格控制条件，确保单克隆抗体的产量和质量。
通过上述步骤的实施，可以获得高效、高纯度的单克隆抗体，为生物医药领域的研究和应用提供有力支持。
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体的制备流程
一、抗体cDNA克隆
2、结合分离：抗体和抗原之间采用免疫学方法，进行亲和结合分离，在病理学中，可以采用细胞亲和免疫电泳或者细胞色素紧缩技术来进行识
别性结合分离抗体。
3、mRNA提取：使用RNAsy Plus Kit根据操作说明提取亲和结合分
离后的抗体的mRNA，用于cDNA合成。
4、cDNA合成：使用双链cDNA合成试剂盒，根据说明书操作，将mRNA合成双链cDNA。
5、克隆：将双链cDNA进行克隆，经过构建的一系列步骤，最终将cDNA克隆到载体上，构建出抗体cDNA克隆库。
二、抗体cDNA克隆抗体制备
1、选择克隆体：选择抗体cDNA克隆库中的抗体表达克隆，采用PCR
技术进行选择，并检测克隆体具有良好的免疫特性，可以快速确定最佳克
隆体。
2、表达载体构建：将最佳克隆体插入到表达载体中，构建出属于克
隆体的表达载体，以此保证克隆体的正确表达。
3、表达系统筛选：利用多种表达系统，筛选出最佳的表达系统，以
此来达到最佳的表达效果。
4、表达调控：对于最佳的表达系统，根据cDNA克隆体的特性，进行
最佳的表达调控，以此达到最佳的抗体表达效果。
单克隆抗体制备方法
单克隆抗体制备方法
1. 嘿，你知道单克隆抗体制备第一步是啥吗？就好像搭房子得先有稳固的地基呀，这第一步就是免疫动物。
比如给小老鼠打上特定的抗原，让它的免疫系统开始行动起来！
2. 然后呢，就要融合细胞啦！这就像把两种不同的力量汇聚在一起，产生奇妙的反应。
像骨髓瘤细胞和免疫细胞的融合，多神奇呀！
3. 筛选阳性克隆，哇哦，这可是个精细活儿呀！就好像在一堆沙子里找出金子一样不容易呢。
比如说在众多细胞中找出能产生我们需要抗体的那一个。
4. 接下来得克隆化培养啦！这就好似精心呵护一棵小树苗，让它茁壮成长。
把筛选出来的细胞好好培养，让它不断繁殖。
5. 扩大培养也很重要哟！这不就像把一个小团队发展成一个大部队嘛。
让细胞数量大量增加，为后面做准备。
6. 单克隆抗体的收集，哇，终于等到这一刻啦！就像收获辛勤劳作后的果实一般让人开心呀。
把产生的抗体收集起来。
7. 之后还得对抗体进行鉴定呢，这难道不像是给一件宝贝做个全面检查，看看它是不是真的厉害。
比如检测它的特异性啥的。
8. 纯化抗体也是必不可少的步骤呀，这就好比把杂质去掉，只留下最纯净的精华，让抗体更加好用。
9. 最后可别忘记保存抗体哦，要好好地保护起来，让它随时能发挥作用。
就像把宝贝放在一个安全的地方。
我的观点结论：单克隆抗体的制备真的是一个很神奇的过程，每一步都至关重要，需要我们认真对待才能得到好用的单克隆抗体呀！。
单克隆抗体的制备(详细材料)之欧阳美创编
单克隆抗体的研制一、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。
常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。
一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。
即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。
因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。
由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。
因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。
随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。
1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。
这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。
与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。
单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。
Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。
二、杂交瘤技术（一）杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。
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单抗亚型鉴定
单克隆抗体经过几次亚克隆之后需要对亚型进行鉴定，鉴定之后对其理化性质更为熟悉，便于下游纯化和抗体保存和使用，小鼠抗体亚型主要有以下几类：IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA,其中前三种亚型抗体最多；最简单的检测方法是ELISA方法：抗原包被ELISA板子，封闭后加入单克隆抗体(细胞培养上清或者腹水)，最后分别加入HRP标记的羊抗几种亚型的特异性二抗，加入底物显色，单抗亚型与显色的亚型二抗对应。
标准的结果应该是只有某一种亚型的二抗显色，其他亚型不显色。
如果其他亚型也显色，在排除系统操作误差之后应该考虑亚型二抗质量问题。
系统问题主要排除封闭和二抗稀释度问题。
所有的问题都排除了之后，如果还是同时多种亚型显色应该考虑单克隆细胞株是否为单克隆；如果是腹水用于检测有可能是腹水中含有一些自身抗体干扰，所以亚型鉴定一般最好使用细胞培养上清。
上文提到，亚型二抗试剂质量对亚型鉴定至关重要，所以建议客户选择高品质亚型试剂。