细胞生物学

细胞生物学研究技术在自身研究中的应用摘要：细胞生物学是当代生命科学的基础学科, 也是发展迅猛的前沿学科之一。

包括多种先进技术，例如酵母双杂交技术、免疫共沉淀技术、流式细胞术等等。

该文介绍了以上三种技术的原理及在各种领域的应用，并对此做出了展望。

关键词：细胞生物学；酵母双杂交技术；免疫共沉淀技术；流式细胞术Application of cell biology technology in its own reseach field Abstract:Cell biology is the foundation of contemporary life sciences, and is one of the rapidly developing frontier subjects. Cell biology include varieties of advanced technologies，such as yeast two-hybrid technology, co-immunoprecipitation and flow cytometry. This study introduces the principle and application in various fields of the above three technologies, and future applications were prospected.Key words:cell biology; yeast two-hybrid technology; co-immunoprecipitation; flow cytometry前言细胞生物学是研究细胞生命活动规律的一门科学。

科学家们通过现代分子生物学理论和技术手段，从分子水平、细胞及组织水平上逐步揭示细胞生命活动规律。

细胞生物学是生命科学的重要支柱，它与分子生物学、遗传学和发育学等多学科相互交汇融合，反映着生命科学发展的最新成就。

近半个世纪以来，生命科学领域取得许多重大发现和进步都是来自这门学科的实验研究，各种技术也不断的出现并迅速发展，本文从酵母双杂交技术、免疫共沉淀技术和流式细胞术三个方面介绍细胞生物学给各个学科带来的重大变革。

1. 酵母双杂交技术1.1酵母双杂交系统原理酵母双杂交系统由Fields 和Song[1]等于1989 年首先在研究真核基因转录调控中建立，此系统是在酿酒酵母体内分析蛋白质间的相互作用。

是一种在酵母中利用转录激活物的重组来鉴定蛋白质之间相互作用的方法，该系统利用转录激活蛋白GAL4 的DNA 结合结构域（DNA binding -domain，BD）和转录激活结构域（transcription-activating domain，AD），分别与诱饵蛋白及可能与诱饵蛋白相互作用的捕获蛋白相连，并共同转入酵母敏感株细胞，如果两个蛋白能够发生相互作用，就能使转录因子原来分开的两部分结合起来，从而激活下游报告基因[2]。

1.2酵母双杂交的应用1.2.1利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。

将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。

另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。

例如：Engelender[3]等人以神经末端蛋白alpha-synuclein蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交CLONTECH MATCHMARKER SYSTEM 3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并证明了Synphilin-1与alphasynuclein之间的相互作用与帕金森病的发病密切相关。

为了研究2个蛋白之间相互作用的结合位点，找到影响或抑制2个蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1~65个氨基酸残基和Synphilin-1的349~555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。

研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发[4]。

1.2.2利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间免疫反应来研究抗原和抗体之间的相互作用，且均为基于体外非细胞环境中蛋白质与蛋白质的相互作用，而在细胞体内的抗原和抗体的聚集反应则可以通过酵母双杂交进行检测。

Eric等[5]以DFR 作为诱饵蛋白，将编码抗体的3个可变区的基因分别克隆在AD-LIBRARY载体上，将BD-BAIT载体和每种AD-LIBRARY载体分别转化到改造后的酵母菌株中，并检测报道基因在克隆菌落中的表达活性，从而在活细胞水平上检测抗原和抗体的免疫反应。

在结核杆菌特异性应激反应中，抗sigma因子拮抗物对于调节sigma因子的表达起重要作用。

Parida 等发现结核分枝杆菌抗sigma因子拮抗物与sigma因子Rv3287c蛋白间有相互作用[6]。

synemin是一种细胞质中间丝蛋白，人类synemin至少编码两个剪接突变体，包括C末端插入312个额外的氨基酸大片段α-synemin和小片段β-synemin。

运用酵母双杂交技术把小片段β-synemin整个C末端尾部结构域构建为诱饵载体，从人骨骼肌cDNA文库中筛选得知，斑联蛋白Lin-IslMec结构域和人β-synemin有特异性的相互作用，表明β-synemin参与了斑联蛋白的黏附，阻碍synemin蛋白的表达即可减弱细胞的黏附，增加细胞的死亡率，所以对细胞的黏附、转移免疫应答起着重要的作用[7]。

1.2.3建立基因组蛋白相互作用网络众多蛋白质在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的，编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。

通过基因组的测序和序列分析，发现很多新的基因和EST序列。

Hua等[8]利用酵母双杂交，将所有的已知基因和EST 序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白质，从而找到基因之间的联系，建立了基因组蛋白连锁图（genome protein linkage map）。

Maria等[9]构建了一个插入大量外来蛋白质基因序列的蛋白质相互作用网络，这个高精确度和高分辨率的基因蛋白连锁图在不了解每一个突变体的组成及其结构信息的情况下为分析任何蛋白质之间的相互作用提供了快速、简便的方法，同时也可以在任何标准的生物学实验室进行。

利用酵母双杂交、串联亲和提纯蛋白混合物以及蛋白质芯片技术，加之已经绘制出来的基因组蛋白连锁图，为研究细胞的功能奠定了基础。

Walhout 等[10]以线虫的生殖发育过程为研究对象，利用已知的27个线虫发育相关蛋白建立了一个大规模的双杂交系统，获得了100多个相互作用的蛋白。

由此可见，酵母双杂交为绘制生物体的蛋白质相互作用的网状图谱提供了条件。

2.免疫共沉淀技术2.1 免疫共沉淀的原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）技术，是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，用来确定两种蛋白质在完整细胞内的生理性相互作用[11]。

随着后基因组时代的来临，科学家们逐渐认识到蛋白质才是细胞活性及功能的最终执行者，而蛋白质之间的相互作用是蛋白质发挥功能的重要途径，因此对生物功能的研究已从单一的蛋白质过渡到对蛋白之间相互作用的研究。

目前研究蛋白质相互作用的方法非常多，包括酵母双杂交技术技术免疫共沉淀技术和串联亲和纯化技术等，其中Co-IP技术因能揭在生理条件下的蛋白相互作用而得到广泛应用。

2.2 免疫共沉淀的应用细胞裂解物中加入抗体，这样可与已知抗原形成特异的免疫复合物，若存在与已知抗原相互作用的蛋白质，则免疫复合物中还应包含这种蛋白质;经过洗脱，收集免疫复合物，然后分离该蛋白质，对该蛋白质进行N端氨基酸序列分析，推断出相应的核苷酸序列。

将包含活性物质的组织或细胞构建成cDNA文库，以上述核苷酸序列为探针从cDNA文库中分离出cDNA克隆[12]。

2.2.1验证蛋白复合物的存在蛋白质在生物体内发挥作用是通过和其他蛋白质相互作用来实现的，因此蛋白复合物的研究成为近期研究的热点。

鹿连明等人利用免疫共沉淀技术研究水稻中条纹病毒(Rice stripe virus, RSV) 外壳蛋白(coat protein，CP)、病害特异蛋白(disease-special protein，SP)和可能的运动蛋白NSvc4 自身和两两之间的互作关系，提取烟草中瞬时表达的蛋白，以HA 或c-Myc 抗体进行免疫共沉淀试验，最后免疫混合物通过c-Myc 抗体或HA 抗体进行Western blot 检测，确定蛋白的互作情况。

结果表明，RSV CP 蛋白自身能够发生互作[13]。

热休克蛋白作为分子伴侣，参与细胞生长、凋亡，在肿瘤的增殖、分化及转移中起着非常重要的作用。

HSP通过与癌基因的表达产物及肿瘤相关蛋白相互结合而发挥作用，已在人乳腺癌和口腔癌中检测到HSP70-P53复合物[14, 15]。

为了验证HSP70-P53复合物在肝癌中是否存在，用免疫组化染色法从12例肝癌组织中筛选HSP70与P53均呈阳性表达的标本，分别用HSP70与P53的抗体沉淀样品，然后用WB检测双阳性标本中两种蛋白的存在，结果检测到HSP70和P53蛋白的存在，提示人肝癌中、以HSP70和P53复合物的形式存在[16]，为肝癌的发病机制及免疫治疗的研究提供新的方向。

2.2.2 发现新的蛋白复合物郑斌等[17]用Co-IP结合免疫荧光等技术鉴定弓形虫MIC6羧基端和酵缩酶的相互作用及两种蛋白在虫体内的定位。

结果表明，在自然状态下无论在虫体内或体外与MIP6羧端作用的蛋白是醛缩酶，间接免疫荧光定位显示两蛋白共定位于虫体的顶端，为MIP6和醛缩酶相互作用的确立提供了细胞定位学上的证据。

HMGP4是一个生殖细胞特异性表达的基因，在正常成年人及精原细胞瘤患者的睾丸中都能检测到阳性信号。

为揭示其在睾丸中的作用，王成等[18]应用Co-IP联合质谱分析，从生殖细胞起源的人畸胎瘤细胞Ntera-2细胞中鉴定了5个结合蛋白，为进一步研究HMGP4在精子发生机制中的生理功能提供基础。

3 流式细胞术流式细胞仪(Flow Cytometer)是一种对细胞进行定量分析与分选的精密仪器, 它具有分析速度快、特异性好和灵敏度高的优点, 是生物学研究的有力工具。