哈茨木霉对禾谷镰孢病原菌的抑菌活性研究

哈茨木霉对禾谷镰孢病原菌的抑菌活性研究韩勇军【摘要】用3种实验方法研究了哈茨木霉对禾谷镰孢菌的抑制效果,分别是哈茨木霉和禾谷镰孢菌在PDA培养基上的对峙培养,哈茨木霉和禾谷镰孢菌在载玻片上对峙培养,哈茨木霉发酵液的上清液对禾谷镰孢菌的抑菌圈实验,并对培养基、pH值、温度3种培养条件进行了优化.3种实验方法的结果均表明哈茨木霉对禾谷镰孢菌有较强的抑制作用,哈茨木霉适宜生长的条件为培养基PDB,pH值6.0,30℃.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2010(049)002【总页数】3页(P356-358)【关键词】哈茨木霉;禾谷镰孢菌;抑制作用【作者】韩勇军【作者单位】华南理工大学轻工与食品学院,广州,510640【正文语种】中文【中图分类】S482.292小麦（镰刀菌）根腐病又称小麦根腐叶斑病或黑胚病、青死病等［1］，是我国麦田常发病害。

该病的病原由多种镰刀菌引起［2，3］，其中优势病原种为禾谷镰孢菌（F.graminearum）［4］，而目前化学农药防治不仅效果不很理想，且污染环境。

木霉（Trichoderma spp.）是广泛存在于土壤及其他基物中的一类重要真菌，它在生物防治中扮演着重要角色，木霉作为一种重要的植病生防因子一直受到普遍关注［5］。

研究表明，真菌寄生是木霉主要拮抗机制之一，在包括趋向生长、识别、接触、缠绕和穿透等步骤的真菌寄生过程中，木霉分泌产生的一系列细胞壁降解酶，如葡聚糖酶、几丁质酶、纤维素酶、蛋白酶等起着重要的作用，其中以几丁质酶尤为重要。

1 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 供试菌株哈茨木霉（T.harzianum）由河南工业大学生物技术实验室提供，禾谷镰孢菌（F.graminearum Schw.）购买于中科院微生物研究所。

1.1.2 培养基木霉菌胶霉生产发酵液（GPF）：葡萄糖 25 g，酒石酸铵 2 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 1 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，几丁质 10 g；玉米麦麸培养液：麦麸 30 g，玉米粉 30 g，KH2PO41 g；Richard 培养液：KNO310 g，MgSO4·7H2O 2.5 g，KH2PO45 g，FeCl30.02 g，蔗糖 50 g，几丁质 10g；Czapek 培养液：蔗糖30 g，NaNO32 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，几丁质 10 g；PDB培养液：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，自来水1L，几丁质10 g，以灭菌水为空白对照，除PDB培养液，其他培养液均加1 L蒸馏水，依次编号为1号，2号，3号，4号，5号，6号。

1.2 实验方法1.2.1 菌种的活化三点式接种哈茨木霉在PDA培养基上，28℃倒置培养7 d左右即可满皿。

真空冷冻干燥的禾谷镰孢菌种恢复培养。

1.2.2 对峙培养实验1）周对峙：在灭过菌的PDA培养基上，平板中心接种禾谷镰孢菌，3 d后在以禾谷镰孢菌为中心，半径3cm的圆周上等距离接种4点同质等量的哈茨木霉菌丝，定期测哈茨木霉的菌落指向病菌的半径，病原菌指向哈茨木霉的半径及空白对照直径。

2）点对峙：在灭过菌的PDA培养基上同时对称接种哈茨木霉和禾谷镰孢菌，它们之间的接种距离是3cm左右。

另做两个空白实验，一个只接种哈茨木霉，另一个只接种禾谷镰孢菌。

然后定期测定哈茨木霉和禾谷镰孢菌的半径。

空白实验测定直径。

上述对峙实验均做3组平行实验。

3）载玻片对峙培养：取融化状态下的PDA培养基少许，用微量移液枪移取若干均匀涂布在载玻片上。

然后用接种环分别挑取哈茨木霉和禾谷镰孢菌，距离1.5～2.0 cm。

定期在显微镜下观察并拍照。

1.2.3 摇床发酵培养条件优化和抑菌圈实验1）哈茨木霉孢子悬浮液的制备［6］。

用灭菌的0.1%Tween80数毫升洗脱经PDA培养基培养8d的哈茨木霉平板表面孢子，血球计数板法检测孢子数，用无菌水调配成每mL 107个孢子的孢子悬浮液。

用灭菌的三角瓶盛装密封，放在4℃下冰箱内保存备用。

2）禾谷镰孢菌孢子悬浮液的制备［6］。

用灭菌的0.1%Tween80数毫升洗脱经PDA培养基培养12d的禾谷镰孢菌平板表面孢子，在低倍显微镜下观察，调配成满视野30～50个孢子的孢子悬浮液。

用灭菌的三角瓶盛装密封，放在4℃冰箱内保存备用。

1.2.4 哈茨木霉发酵条件的优化1）培养基优化。

按照培养基配方将各培养基配制成100 mL的培养液，各自装于250 mL三角瓶中，灭菌；冷却培养液，在超净工作台里加入1 mL哈茨木霉孢子悬浮液，26℃下置于200 r／min摇床中发酵7 d，然后进行抑菌效果的测定。

2）pH值优化。

用上述优化得来的培养基发酵，pH 值分别选为 4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，其他操作同上。

3）温度优化。

在优化培养基和pH值条件下发酵，温度分别选为 24，26，28，30，32，34，36℃，其他操作同上。

1.2.5 哈茨木霉发酵液的抑菌圈实验发酵液在4℃下，12 000 r／min 离心 20 min；取上清液，用 0.22 μm微孔过滤器过滤得到无菌滤液；在无菌台上用打孔器将厚PDA平板打一个直径为11 mm的小孔，在酒精灯上加热封底，用微量移液器移取禾谷镰孢菌孢子悬浮液40 μL，均匀涂布在平板上，在小孔中加入100μL无菌哈茨木霉发酵液滤液，在28℃条件下培养3～7 d，查看抑菌圈效果及定期测量抑菌圈直径和计算抑菌率。

抑菌率＝抑菌圈直径／平板直径，每种培养液做3个平行实验。

2 结果与分析2.1 对峙培养实验结果对峙法测定结果表明，哈茨木霉对禾谷镰孢菌有较强的拮抗作用。

由哈茨木霉抑制禾谷镰孢菌生长曲线（图1a）得出：周对峙培养的第五天哈茨木霉未与禾谷镰孢菌相接触，禾谷镰孢菌与空白对照的生长速度相近；到第六天哈茨木霉已将禾谷镰孢菌包围，哈茨木霉和禾谷镰孢菌均几乎没生长；到第七天接触部分有明显的萎缩痕迹，接触边缘有明显隔离带，在以后的观察中，它们均几乎没生长，空白对照的禾谷镰孢在第十四天前都在较快地生长。

由曲线图1b知：点对峙试验的第七天时两者接触后开始出现抑菌圈，并且观察到禾谷镰孢菌在和木霉菌相遇后就受到抑制，生长速度减缓。

第九天后木霉菌沿禾谷镰孢菌落的四周生长形成包围圈。

载玻片上的对峙培养接触界面处的菌丝在显微镜下观察，可以观察到木霉菌丝以缠绕、穿插、紧贴等方式寄生于禾谷镰孢菌上，使病菌菌丝变形，细胞变短，并观察到木霉菌丝产生的圆形吸器侵入病原菌菌丝，吸取营养，致使病原菌菌丝从隔膜处断裂、解体的现象。

由于木霉能产生多种物质，对稻瘟病菌丝的生长有较强的抑制作用，致使禾谷镰孢菌丝停止生长。

由于木霉的抗生物质，使病菌菌丝细胞质消解或使菌丝原生质凝结，并逐渐腐烂、失活、解体，有时还发生自溶或外溶现象。

禾谷镰孢菌被木霉菌丝争夺生活空间，病菌菌丝生长受到限制，生长混乱、扭曲，表现为环形生长，菌丝顶部变细，内容物减少，最后禾谷镰孢菌停止生长或死亡。

2.2 哈茨木霉发酵液的抑菌实验结果2.2.1 不同培养基条件下对哈茨木霉发酵液抑菌率的影响用不同培养基于26℃下摇床培养7 d，用发酵液做抑菌试验。

由图3可以看出哈茨木霉在5号培养基中所得到的发酵液的抑菌率最大，此发酵液中的抑菌物质可能也最多、最有效。

说明哈茨木霉的最适拮抗培养基为5号，即PDB培养基。

2.2.2 不同pH条件对哈茨木霉发酵液抑菌率的影响将木霉菌株接种于不同初始pH值的5号培养基中，发酵培养7d后，测定其生物防治效果，结果见图4。

从图4可以看出，当pH值为6.0时，抑菌率最高，在弱酸环境中，木霉的发酵液抑菌性最好，说明木霉发酵液的适宜发酵环境为弱酸性。

2.2.3 不同温度条件对哈茨木霉发酵液抑菌率的影响将木霉菌株接种于初始pH值为6.0的5号培养基中，不同温度下发酵培养7 d，测定其生物防治效果，结果（图5）表明：该菌株在24～36℃均能生长，最佳发酵温度为30℃。

3 结论根据以上点对峙、周对峙、抑菌圈实验，可知哈茨木霉对禾谷镰孢菌的抑制作用是比较明显的。

在光学显微镜下，可以观察到哈茨木霉的菌丝在禾谷镰孢病菌的菌丝上缠绕生长；或穿过病原菌的菌丝生长，说明重寄生作用是木霉菌作为拮抗菌的一个重要机制。

通过对培养基、pH值、温度条件的优化，得知哈茨木霉适宜生长的条件为：培养基PDB，pH值6.0，30℃。

今后研究的一个方向是研究具体哪些发酵产物对禾谷镰孢菌生长起到了抑制作用，以便制成有效的农药制剂用于病虫害防治。

参考文献：［1］曹桂香，韩文革，于裴枝.黑龙江省小麦根腐病病原及生态分布［J］.现代化农业，2001（4）：11－l3.［2］黄小红，叶华智.四川省小麦赤霉病菌的种群组成［J］.西南农业学报，2005（3）：30－33.［3］邱艳，刘亚辉.宁夏小麦赤霉病禾谷镰刀菌致病性分化的研究［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2005（S1）：25－26.［4］王裕中，肖庆璞，杨新宁，等.江苏省小麦赤霉病菌优势种——禾谷镰刀菌Fusarium graminearum Schwabe的致病力［J］.江苏农业学报，1985（1）：55－56.［5］徐同，钟静萍，孟征.木霉在植病生防中的地位［A］.第三届全国真菌地衣学术讨论会学术报告及论文摘要汇编［C］.北京：中国真菌学会，1990.［6］肖爱萍，游春平，陈金明，等.稻瘟病拮抗细菌发酵配方与培养条件的研究［J］.江西农业大学学报，2004，26（4）：499－502.。