第8章双水相萃取技术
《双水相萃取技术》课件
03
双水相萃取技术的实验操作
实验准备
01
02
03
实验材料
准备双水相萃取所需的试 剂和材料，如蛋白质溶液 、双水相体系、离心管等 。
实验设备
确保实验所需的设备齐全 ，如离心机、天平、量筒 等。
安全措施
确保实验环境安全，穿戴 适当的实验服和护目镜， 避免试剂溅出。
实验步骤
加入蛋白质溶液
将待分离的蛋白质溶液加入离 心管中。
应用范围广泛
该技术在生物、医药、环保等领域有 广泛应用，可用于蛋白质、酶、细胞 等的分离和纯化。
操作简便高效
双水相萃取技术操作简单，分离速度 快，可实现大规模生产。
环境友好
该技术使用无毒或低毒性的物质，对 环境友好，符合绿色化学的发展趋势 。
技术展望
深入研究机理
进一步深入研究双水相萃取技术的机理，提高分 离效率和选择性。
蛋白质回收率测定
测定蛋白质的回收率，评估双水相萃取技术的效 果。
3
数据分析
对实验数据进行统计分析，了解双水相萃取技术 的分离效果和影响因素。
04
双水相萃取技术的优缺点
技术优势
高分离效率
双水相萃取技术能够实现高效率的分离过程，对于一些难以分离 的物质，如蛋白质、酶等，能够实现快速、准确的分离。
低成本
收集上清液
将上清液收集到适当的容器中 ，以便后续分析。
配制双水相体系
按照所需的浓度配制双水相体 系，确保比例准确。
离心分离
将离心管放入离心机中，设定 适当的转速和时间进行离心分 离。
清洗沉淀
清洗离心管中的沉淀，确保蛋 白质的纯度和回收率。
实验结果分析
1 2
萃取技术—双水相萃取技术(药物分离纯化课件)
内侧流 外侧 分配 萃取物
体 流体 系数
细胞色素 C 磷酸盐 PEG 0.18 肌红蛋白 磷酸盐 PEG 0.009 过氧化氢酶 磷酸盐 PEG 0.12 尿激酶 磷酸盐 PEG 0.65
内侧流 速,cm/s
16.3 4.0 16.3 16.3
外侧流 传质系 速,cm/s 数,cm/s
6.6 5.5?0 -6 5.0 7.5?0 -7 5.0 2.8?0 -5 5.0 2.0?0 -4
双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）
1.双水相萃取的应用
双水相分离条件 （1） 目的分子与细胞应分配在不同的相 （2） 分配系数应足够大 （3） 离心机容易分离
双水相萃取的应用
分离物质
举例
体系
NaDS-硫酸葡聚糖
酶 核酸 生长素 病毒 干扰素
细胞组织
过氧化氢酶的分离 分离有活性核酸DNA 人生长激素的纯化 脊髓病毒和线病毒纯化 分离β－干扰素
双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）
2.双水相萃取分离技术的发展方向 （1）廉价双水相体系的开发
优点： (1)蛋白质溶解度大。蛋白质在PPT浓度到15％以前没有沉淀，但在PEG浓度大于
5％时，溶解度显著地减小，在盐溶液中的溶解度更小。 (2)粘度小。PPT的粘度是粗dextran的1/2,传质好。 ⑶价格便宜。PPT几十$/kg,粗dex几百$/kg
系线
TMB：系线连接双节线上两点的 直线。
在临界点处，分配系数为1
临界点
药物分离与纯化技术课程
3．双水相相图
系线反映的信息:
(1)系线长度：衡量两相间相对差别的尺度。越长则两相间性质差 别越大，反之则越小；趋向于零时，（双节线上的点，临界点）， 两相差别消失，成为均一相。
第八章 生物产品的萃取和富集
图1 连续错流萃取回收酶的流程图
目的产物的萃取
细胞悬浮液经珠磨机破碎细胞后，与PEG和无机 盐在萃取器中混合，然后进入离心机分相。通过 选择合适的双水相组成，一般使目标蛋白质分配 到上相( PEG相) ，而细胞碎片、核酸、多糖和杂 蛋白等分配到下相(富盐相) 。主要原因有： (1) 核酸和多糖由于其亲水性，易分配到富盐相， 目标蛋白质只有分配到富PEG相才能达到分离目 的。 (2) 下相的高盐浓度易造成蛋白质失活或沉淀，而 PEG对蛋白质有保护作用。 (3) 细胞碎片分配在下相有利于连续式离心机分离， 如在上相易堵塞离心机出口。
第1步萃取后的上相中还含有较多杂蛋白及一些 核酸、多糖和色素(色素因其疏水性分配在上相) 等，可通过加入适量的盐，再次形成PEG/无机盐 体系来进行纯化。目标蛋白质仍留在PEG相中。 在第3步萃取中则将蛋白质转入富盐相，从而将 蛋白质与PEG分离开。但从经济角度考虑，一般 用2步萃取，即在第2步将目标蛋白质转入富盐相。
含水量是反胶团的一个重要参数，决定反胶团物 理性质，决定其大小和每个胶团中所含表面活性 剂的个数。 含水量与表面活性剂的种类、助表面活性剂、水 相中盐的种类和浓度有关。
反胶团体系分类
反胶团制备
相转移法
注射法 溶解法
溶解推动力
A 静电作用： 当溶质所带电荷与表面活性剂相反时,由于静电引 力的作用,溶质易溶于反胶团,溶解率或分配系数 较大,反之,则不能溶解到反胶团相中. B 空间相互作用 盐浓度增大对反胶团相产生脱水效应, 含水率W0 随盐浓度的增大而降低,反胶团直径减小, 空间排 阻作用增大, pro溶解下降.
生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间 的各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作 用和生物亲和作用等。因此，分配系数是各种相 互作用的和。
双水相萃取技术
高等分离工程课程论文双水相萃取技术的发展与应用随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、代谢工程等高新生物技术研究工作的广泛展开，各种生化新产品不断涌现，对生化分离技术也提出了越来越高的要求。
但由于大部分的生物产品原液是具有低浓度和生物活性的，对分离条件以及环境要求及其苛刻，使得传统的液液萃取已不能适应分离要求，因此一种新型的液液分离技术-双水相萃取技术应运而生，双水相萃取技术是利用组分在两水相间分配的差异而进行组分的分离提纯的技术。
由于双水相萃取分离过程条件温和、可调节因素多、易于放大和操作，并可借助传统溶剂萃取的相关理论和经验，不存在有机溶剂残留问题，特别适用于生物物质的分离和提纯。
目前，双水相萃取技术已被广泛地应用于医药化学、细胞生物学、生物化工和食品工业等领域，被认为是生物工程中一种具有广阔应用前景的分离技术，在电化学生物传感器中生物活性分子的制备中至关重要。
1 双水相萃取的基本要点1.1 双水相萃取的原理双水相萃取是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。
当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同。
对于某一物质，只要选择合适的双水相体系，控制一定的条件，就可以得到合适的分配系数，从而达到分离纯化之目的。
将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值，体系会自然的分成互不相溶的两相，这就是双水相体系。
双水相体系的形成主要是由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。
一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异，混合时就可发生相分离，且憎水程度相差越大，相分离的倾向也就越大。
1.2 双水相的种类双水相萃取中使用的双水相是由两种互不相溶的高分子溶液或者互不相溶的盐溶液和高分子溶液组成。
最常见的就是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dextran)和PEG/无机盐(硫酸盐、磷酸盐等)体系,其次是聚合物/低分子量组分、离子液体体系和高分子电解质/高分子表面活性剂体系。
蛋白分离纯化技术之双水相萃取技术
蛋白分离纯化技术之双水相萃取技术双水相萃取是一项蛋白分离和蛋白纯化技术，是利用物质在两相间的选择分配差异而进行分离提纯的，目前已经被广泛应用与医药化学、细胞生物学、生物化工和食品工业等领域。
双水相萃取技术用于提取蛋白质等生物活性物质时，具有操作简单、体系含水量高，在萃取过程中可以保持物质的构象稳定、蛋白不易失活并获得高的萃取率的特点。
1、双水相萃取技术可分离和纯化蛋白双水相萃取技术可以用于蛋白分离和蛋白纯化，包含在一些蛋白分离公司提供的服务。
早期，如在20世纪60年代，有研究者全面进行了生物大分子在双水相系统中的分配行为的研究，得到了蛋白质、酶、核酸、病毒、抗体抗原复合物以及细胞等的分配数据。
双水相系统具有温和的操作条件，对于在极性条件下易造成变性失活的蛋白质和酶的提取中表现出了很大的优势。
双水相萃取法进行蛋白分离和蛋白纯化的原理是：聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间由于分子空间阻碍作用形成了双水相。
当待分离物质进入体系后，由于各组分表面性质、电荷作用和各种力的作用和溶液环境的影响，使其在上、下相中的分配系数不同，通过调节体系参数使被分离物质在两相间选择性分配，从而实现目标组分的分离纯化。
双水相萃取技术进行蛋白分离和蛋白纯化具有以下优点：（1）易于放大，各种参数可以按照比例放大而不降低产物收率[1]；（2）双水相系统传质和平衡过程速度快，回收效率高、能耗较小；（3）易于进行连续化操作、设备简单，且可以直接与后续提纯工序相连接，无需进行特殊处理；（4）相分离条件温和，双水相体系的张力很小，有利于保持生物分子的活性，可以直接用在发酵液中；（5）影响双水相体系的因素比较复杂，可调参数多，便于改变操作条件提高纯化效果。
美迪西提供蛋白质分离纯化技术服务，可以根据客户要求，提供从小试到规模生产全程的蛋白分离纯化服务，并根据工艺的要求结合产品特点给客户定制适用的工艺和系统。
2、双水相萃取技术分离和纯化物质的研究α-淀粉酶是一类用途十分广泛的酶，在粮食、食品加工，以及医药行业等都经常使用，由于α-淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶，周内外很多课题组对它进行了研究。
双水相萃取技术
中草药成分等) 在双水相体系中服从Nernst分配定律:
K = Ct / Cb
其中ct 、cb 分别代表溶质在上相、下相中的浓度。
系统固定时,分配系数为一常数,与溶质的浓度无关。 当目标物质进入双水相体系后,在上相和下相间进行选择 性分配,这种分配关系与常规的萃取分配关系相比,表现出
长素等大分子生物物质的分离与纯化,取得了较好的成效。
近年来,双水相萃取技术的分离对象进一步扩大,已包括了 抗生素、多肽和氨基酸、重金属离子和植物有效成分中的
小分子物质。下表为近年来双水相萃取技术在生物物质分
离的部分应用实例。双水相萃取技术在生物工程分离中已 经显示了良好的应用前景。
EOPO为环氧乙烷（EO）和环氧丙烷（PO）的随机共聚物
表面电荷 当盐的正、负离子对上、下两相有不同的亲和力， 即正负离子的分配系数不同时，就会在相间产生电位， 此电位差的大小为：
U2－ U1=[RT㏑(KB
Z-
÷ KA
Z+
)]/[F(Z+－Z-)]
、 KA
Z+分别表示
其中， U1、U2分别表示相1和相2的电位；Z+、Z-分 别表示一种盐的正、负离子价； KB
一般可获得较大的分配系数，也可调节被分离组分
在两相中的分配系数， 使目标产物有较高的收率；
⑶ 传质速率快,分相时间短。双水相体系中两相的含水 量一般都在80%左右，界面张力远低于水-有机溶剂 两相体系，故传质过程和平衡过程快速； ⑷ 操作条件温和，所需设备简单。整个操作过程在室 温下进行，相分离过程非常温和，分相时间短。大
《双水相萃取技术g》PPT课件
精选ppt
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1.2.2 疏水作用
PEG/Dx和PEG/无机盐等双水相系统的上相(PEG相)疏水 性较大，相间的疏水性差用疏水性因子HF (hydrophoblc factor)表示。HF可通过测定疏水性已知的氨基酸在其等电点 处的分配系数maa测算
l酸的相对疏水性(relative hydrophobicity)， 是通过测定氨基酸在水和乙醇中溶解度的差别确定的，并设 疏水性最小的甘氨酸的RH＝0。所以上式中 B为
聚丙二醇、聚乙二醇 甲基纤维素
羧甲基纤维素钠盐
磷酸钾、硫酸铵、硫酸钠 硫酸镁、酒石酸钾钠
精选ppt
5
a 系线 两相区
双节线 均相区
b
两相区 系线
双节线 均相区
临界点
图分别为PEG/葡萄糖(Dx)和精P选EpGpt/磷酸钾(KPi)系统的典型相图 6
在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分 成组成相同而体积不同的两相。两相的体积近似 服从杠杆规则，即
可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二 醇(polyethylene glycol,略作PEG)/葡聚糖 (dextran，略作Dx)，聚丙二醇(polypropylene glycol) / 聚乙二醇和甲基纤维素 (methylcellulose)/葡聚糖等。双水相萃取中常采 用的双聚合物系统为PEG/Dx，该双水相的上相富 含PEG，下相富含Dx。除双聚合物系统外，聚合 物与无机盐的混合溶液也可形成双水相。
双水相萃取技术
1.1 双水相系统 1.2 双水相中的分配平衡 1.3 影响物质分配平衡的因素 1. 4 双水相系统的应用
精选ppt
1
1.1 双水相系统
• 基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需 经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的 变化给固－液分离带来了困难，同时这类产品的 活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素 特别敏感。由于它们在有机溶剂中的溶解度低并 且会变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采 用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法 可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。
双水相萃取ppt
天然植物药用有效成分的分离与提取
中草药是我国医药宝库中的瑰宝 ,已有数千 年的历史 ,但由于天然植物中所含的化合物 众多 ,特别是中草药有效成分的确定和提取 技术发展缓慢 ,使我国传统中药难以进军国 际市场。因此 ,采用具有较高选择性和专一 性的双水相萃取技术对中草药有效成分的 提取是一项很有意义的工作。利用双水相 萃取中草药有效成分具有代表性的工作是 对黄岑甙和黄岑素的分离。
抗生素的分离与提取
数抗生素都存在于发酵液中 ,提取工艺路线复杂 ,能耗 高 ,提取过程易变性失活。而双水相萃取在抗生素中具 有较大的应用价值 ,萃取提取涉及到各类抗生素。β 内酰胺类抗生素是抗生素家族中应用最多的一类 ,主要 由青霉素类和头孢菌素类构成。对青霉素进行工业化意 义的双水相萃取是结合传统工艺溶媒萃取法进行的。先 以 PEG2000/ (NH4) 2SO4系统将青霉素从发酵液中提取 到 PEG相 ,后用醋酸丁酯(BA)进行反萃 ,再结晶 ,处理 1000ml 青霉素发酵液 ,得青霉素晶体 7. 228g ,纯度 84. 15 % ,三步操作总收率 76. 56 %。
酶工程药物的分离与提取
酶在医药方面的应用一是作为药用酶 ,二是用作化学合 成药物中的酶催化剂。迄今 ,双水相萃取技术已广泛应 用于生物大分子、细胞、细胞器、蛋白质、核酸、病毒、 细菌、蓝藻、叶绿素、线粒体、 菌体等的分离与提取 , 几乎所有的酶均可用此技术仅通过调节 pH、合物和盐的 种类或浓度 ,选择合适的分离条件就可进行理想的分离 纯化。目前双水相萃取技术已成功应用于已较大规模提 取纯化的酶有几十种 。其中成功地实现从微生物细胞碎 片中提取纯化甲酸脱氢酶 ,其分离经 4 次连续萃取 ,已 达处理 50kg 湿细胞规模 ,处理的酶蛋白含量已高达 150g ,收率为 90 %～100 % ,由于工艺简单 ,原材料成 本较低 ,产品的价格也有大幅度降低。
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第8章双水相萃取技术
第8章双水相萃取技术
1双水相萃取现象：最早是1896年由Beijernek在琼脂和可溶性淀粉或明胶混合时发现的，这种现象称之为聚合物的“不相溶性”。
70年代中期西德的Kula和Kroner等人首先将双水相系统应用于从细胞匀浆
液中提取酶和蛋白质，大大地改善了胞内酶的提取效果。
双水相萃取技术：某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相系统。
利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质进行物质分离的方法称双水相萃取技术，又称水溶液两相分配法。
2双水相萃取技术基本原理：①双水相的形成一聚合物的不相容性：混合是熵增加的过程，可自发进行。
但是，分子间的相互作用力也会随分子量的增大而增大。
当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于分子量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。
这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相容性。
双水相的形成一系统举例：绝大多数天然的或合成的亲水性聚合物水溶液，在与第二种亲水性聚合物混合，并达到一定浓度时，就会产生两相，两种高聚物分别溶于互不相溶的两相中。
如用等量的 1.1 %右
旋糖酐溶液和0.36 %甲基纤维素溶液混合，静止后产生两相，上相中含右旋糖酐0.39 %，含甲基纤维素
0.65 %;而下相含右旋糖酐 1.58 %，含甲基纤维素0.15 %。
聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相，例如，PEG^磷酸钾、PEG^磷酸铵、PEG^硫酸钠等常用于生物产物的双水相萃取。
PEG^无机盐系统的上
相富含PEG下相富含无机盐。
Dextran-PEG体系的相图：（1）TKB称为双节线，双节线以下的区域为均相区，以上的区域为两相区。
（2）TMB称为系线，是连接双节线上两点的直线，在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体积不同的两相。
萃取原理：双水相萃取与水-有机相萃的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配。
当萃取体系的性质不同时，物质进入双水相系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如疏水键、氢键和离子键等）的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。
几个常用的术语：（1）分配系数:、二G/C2 = C_/C=.（分配系数K等于物质在两相的浓度比，由于各种物质的K值不同，可利用双水相萃取体系对物质进行分离）。
（2）萃取率：
该相中被提取物质的量
Y%= 100%
%=体系中被提取物质的总量％
双水相体系萃取分离的特点：条件温和；操作方便；回收率高、提纯的倍数可达2-20倍,如体系选择
适当，回收率可达80%-90%A上,且分离速度快。
3双水相相图的操作：①把刻度离心管放置于电子天平上，调零；②向刻度离心管滴加一定量50% PEG-6000（简称A），记录重量；③调零，再滴加40%硫酸铵溶液（简称B），振荡，继续滴加B,直到混合物
呈现混浊状态，显示已形成不溶的两相，记录B的重量；④电子天平调零，然后，向混合物滴加一定重量
的水（0.4-0.5ml），经振荡后，重新呈现澄清状态，此现象表明溶液又回复成单相，记录此时的W重量；⑤
电子天平调零。
接着，再一次滴加B;⑥重复上述步骤。
最后可得一系列成单相的点。
双水相相图的绘制：以PEG-6000和硫酸铵构成的双水相系统的相图曲线可根据如下公式计算获得：
X=［0.4B/（A+B+W）］100% , 丫二［0.5A/（A+B+W）］100% （公式符号含义：Y :在某成单相点时
PEG-6000占总量的百分数；X :在某成单相点时硫酸盐占总量的百分数； A :在某成单相点时PEG-6000溶
液在系统中的总量（g）；B:在某成相点时硫酸铵溶液在系统中的总量（g）；W：在某成单相点时水在系统中的总量（g））。
以丫为纵坐标，X为横坐标，丫对X作图得双水相系统相图。
相图中曲线左边部分为单相区（含
曲线），曲线以右为双相区。
4双水相萃取的应用：①分离和提取各种蛋白质（酶）:PEG /硫酸铵双水相体系提取 a -淀粉粉酶和蛋白酶时a -淀粉粉酶收率90%分配系数为19.6，蛋白酶的收率高于60%分离系数高达15.1 :②提取抗生素；③双水相电泳分离氨基酸、蛋白质④基因工程药物的分离与提取：用PEG 4000/磷酸盐从大肠杆
菌碎片中提取人生长激素，用PEG -磷酸酯/磷酸盐提取a 1-干扰素和3 -干扰素。
5双水相萃取分离技术的发展方向：①新型双水相体系的开发：用变性淀粉取代葡聚糖；用羟基纤维
素取代聚乙二醇。
②后续色谱纯化工艺研究：双水相萃取与层析技术。
③金属亲和双水相萃取技术：利用金属离子和蛋白质中精氨酸、组氨酸的亲和作用。
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