基因突变分析技术综述
基因工程综述
基因工程综述班级：生物技术姓名：林治淮学号：1102021046 摘要：基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。
关键词：基因工程研究进展研究领域基因工程是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。
它克服了远缘杂交的不亲和障碍。
基因工程自20世纪70年代兴起之后，经过20多年的发展历程，取得了惊人的成绩，特别是近十年来，基因工程的发展更是突飞猛进。
基因转移、基因扩增等技术的应用不仅使生命科学的研究发生了前所未有的变化，而且在实际应用领域──医药卫生、农牧业、食品工业、环境保护等方面也展示出美好的应用前景。
1.基因工程与医药卫生目前，基因工程在医药卫生领域的应用非常广泛，主要包括以下两个方面。
在药品生产中，有些药品是直接从生物体的组织、细胞或血液中提取的。
由于受原料来源的限制，价格十分昂贵。
用基因工程方法制造的“工程菌①”，可以高效率地生产出各种高质量、低成本的药品。
如胰岛素、干扰素和乙肝疫苗等。
基因工程药品是制药工业上的重大突破。
胰岛素是治疗糖尿病的特效药。
一般临床上给病人注射用的胰岛素主要从猪、牛等家畜的胰腺中提取，每100 kg胰腺只能提取4～5 g胰岛素。
用这种方法生产的胰岛素产量低，价格昂贵，远远不能满足社会的需要。
1979年，科学家将动物体内能够产生胰岛素的基因与大肠杆菌的DNA分子重组，并且在大肠杆菌内表达获得成功。
生物信息学中的基因变异数据分析方法综述
生物信息学中的基因变异数据分析方法综述概述随着高通量测序技术的发展，生物学家们可以获取大规模的基因变异数据，这推动了生物信息学中的基因变异数据分析的研究。
基因变异是生物个体遗传信息的重要组成部分，对于理解疾病的发展机制，预测个体对药物的反应以及进行个性化医疗具有重要意义。
本文将综述生物信息学中的基因变异数据分析方法，介绍常用的数据处理流程和分析方法。
1. 数据预处理在基因变异数据分析之前，需要进行一系列的数据预处理。
首先，对原始的测序数据进行质量控制和去除低质量的碱基，通常使用工具如FastQC和Trimmomatic实现。
接下来，进行对齐操作，将测序reads与参考基因组进行比对，主要使用的对齐工具有BWA和Bowtie。
此外，还需要进行去重操作，剔除PCR复制产生的重复片段。
以上步骤的目的是为了减少后续分析中的假阳性和假阴性情况。
2. 变异检测基因变异检测是基因组数据分析的核心环节。
常用的变异检测方法包括单核苷酸变异（SNVs），小片段插入或删除（indels），结构变异和复杂变异等。
SNVs是最常见的基因序列变异，通过和参考基因组的比对，找出个体与参考基因组不同的位点。
本地重组（local realignment）和数基因组（multi-genome）比对是提高SNVs检测准确性的重要工具。
Indels通常对参考基因组序列产生较小的插入或缺失，使用工具如GATK、SAMtools等进行检测。
结构变异通常包括基因内的重复序列插入、删除和基因间的重排等，通过分析测序数据中的拆分对和转座子移动等特征进行检测。
复杂变异是指在基因组中较为罕见的结构重排和序列混合等事件，其检测需要更复杂的流程和工具。
3. 功能注释对于检测到的基因变异，进行功能注释是为了理解其对基因和蛋白质功能的影响。
功能注释根据变异位点的位置和旁系的基因组信息进行分类。
常用的注释工具有ANNOVAR、Variant Effect Predictor (VEP)等。
TCF4基因突变致皮特-霍普金斯综合征2例报告并文献复习
TCF4基因突变致皮特-霍普金斯综合征2例报告并文献复习陶茜;霍洪亮;夏秦;吉永春;张何威;曹徐君;顾琴【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2024(30)14【摘要】目的总结分析2例特殊皮特-霍普金斯综合征(PTHS)患儿的临床特征和基因突变。
方法对2例PTHS患儿的临床资料和基因测序结果进行回顾分析,并复习典型临床表现相关的病例报道及相关文献。
结果2例PTHS患儿均为男性,表现为特殊面容,发育迟缓。
头颅磁共振成像、脑电图、血液生化检查、外周血染色体、血尿遗传代谢筛查均无异常。
第1例患儿2岁,基因测序结果显示转录因子4(TCF4)基因17外显子区域杂合变异,为首次报道致病的新发突变c.1504C>T,可导致氨基酸p.Q502*改变。
第2例患儿10岁,基因测序结果显示TCF4基因12外显子区域新发变异,c.990G>A,可导致氨基酸p.Ser330=改变。
检索到相关文献110篇,纳入文献复习15篇,报道40种TCF4基因突变,分别位于外显子7~19,涉及缺失突变、插入突变、无义突变、剪切突变和错义突变。
结论2例首次报道的TCF4基因突变位点丰富了PTHS的基因变异谱,为临床诊断和遗传咨询提供依据。
【总页数】6页(P1781-1786)【作者】陶茜;霍洪亮;夏秦;吉永春;张何威;曹徐君;顾琴【作者单位】苏州大学附属儿童医院康复科【正文语种】中文【中图分类】R729【相关文献】1.ZMPSTE24基因突变致限制性皮病1例病例报告并文献复习2.SLC35A2基因突变致马凡综合征家系中West综合征患儿1例报告并文献复习3.TCF4基因突变所致皮特-霍普金斯综合征1例4.基因NEB、TCF4及PCSK9变异合并皮特-霍普金斯综合征3例报告因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
生物信息学中的DNA序列分析技术综述
生物信息学中的DNA序列分析技术综述DNA序列分析技术是生物信息学领域中非常重要的一项技术，在生物学研究中起着至关重要的作用。
本文将从DNA序列的获取、存储、预处理和分析等方面进行综述，以帮助读者全面了解DNA序列分析技术的研究进展和应用。
首先，DNA序列的获取是DNA序列分析的基础。
DNA测序技术的发展使得获取大规模DNA序列数据成为可能。
经典的Sanger测序技术已经进化到高通量测序技术如Illumina HiSeq、Pacific Biosciences和Oxford Nanopore等。
这些技术大大提高了序列获取的效率和准确性。
通过这些高通量测序技术，科学家们可以获得大量的DNA序列数据以支持后续的生物信息学分析。
其次，DNA序列的存储是DNA序列分析不可或缺的一环。
DNA序列数据通常以FASTQ、SAM/BAM和VCF等格式进行存储。
FASTQ是存储原始测序数据的一种格式，包含了读取序列和质量信息。
SAM/BAM格式是对测序数据进行比对和对齐后的结果进行存储的格式。
VCF是对SNP（单核苷酸多态性）和INDEL （插入/缺失）等变异信息进行存储的格式。
这些格式的选择依赖于具体的研究需求和分析软件的要求。
针对DNA序列数据的预处理，主要包括数据清洗、质量控制和序列比对等步骤。
数据清洗是删除原始测序数据中的接头序列、低质量序列和低复杂度序列等无效信息的过程。
质量控制是对清洗后的数据进行质量评估和修剪，以保证后续的分析结果的准确性。
序列比对是将清洗和修剪后的数据与参考基因组进行比对，以寻找序列数据中的变异信息。
在DNA序列分析的过程中，常用的分析方法包括基因组重测序、转录组测序和外显子测序等。
基因组重测序是对整个基因组进行高通量测序的一种方法，可以揭示个体基因组的整体信息，如基因组结构和变异分布等。
转录组测序则是对转录本进行测序，可以帮助研究者了解基因在转录水平的表达情况和转录变异等信息。
外显子测序则是对编码蛋白质的外显子区域进行测序，可以帮助寻找与遗传疾病相关的突变。
遗传学-基因突变病例综述
COQ4基因突变与原发性辅酶Q10缺乏症摘要：原发性辅酶Q10缺乏症是一种临床罕见的常染色体隐性遗传病，是由直接参与合成的辅酶Q基因编码的蛋白质的突变引起的。
辅酶或泛醌是一个移动的亲脂性关键的电子载体，线粒体内膜呼吸链的电子传递中起关键作用。
辅酶Q4基因是编码辅酶Q生物合成途径的重要组成部分,催化辅酶Q10生物合成,该基因变异可导致辅酶Q10缺乏，从而引起神经、肌肉等多系统受累。
本文通过案例分析及有关病例报道介绍COQ4基因突变所致原发性辅酶Q10缺乏症的临床问题。
关键词：COQ4基因原发性辅酶Q10缺乏症基因突变Abstract: Primary Coenzyme Q10 deficiency is a rare clinical autosomal recessive genetic disorder caused by the mutation of the protein encoded by the coenzyme Q gene directly involved in the synthesis. Coenzyme or ubiquinone is a mobile lipophilic key electron carrier, which plays a key role in the electron transport of the mitochondrial endointima respiratory chain Coenzyme Q4 gene encoding coenzyme Q biosynthetic pathway is an important component of catalytic coenzyme Q10 biosynthesis, the gene mutations can lead to the lack of coenzyme Q10, causing neuromuscular system more involvement Were reported in this paper, through case analysis and related introduction COQ4 mutations caused by primary coenzyme Q10 deficiency clinical problems. Keywords: Primary Coenzyme Q10 deficiency; COQ4 gene; gene mutation本次遗传案例的病例分析中，患儿的生化检查发现存在高血糖、高血氨、高乳酸盐血症。
基因突变与遗传疾病关联分析方法综述
基因突变与遗传疾病关联分析方法综述引言：基因突变是遗传疾病的主要原因之一。
综合应用各种生物信息学和生物技术方法，对基因突变与遗传疾病之间的关联进行分析，可以为遗传疾病的预防、诊断和治疗提供重要的理论依据和实际应用价值。
本文就基因突变与遗传疾病关联分析的各种方法进行综述，包括基于生物信息学和遗传流行病学的方法。
一、基于生物信息学的方法1. 基于DNA序列的分析方法：基于DNA序列的方法是研究基因突变与遗传疾病关联的重要手段之一。
它可以通过比对突变位点和正常人群的DNA序列来鉴定潜在突变位点，并进一步确定其与特定遗传疾病之间的关联。
在这方面，测序技术的发展为我们提供了强大的工具，例如全基因组测序、外显子组测序和全外显子捕获测序等技术。
此外，通过比对个体的转录组、蛋白质组和代谢组等信息，也可以进一步研究基因突变导致的功能改变，从而揭示遗传疾病发病机制。
2. 基于蛋白质结构的分析方法：蛋白质结构是基因突变与遗传疾病关联分析的重要依据之一。
通过分析基因突变对蛋白质结构和功能的影响，可以揭示遗传疾病的发病机制。
在这方面，结构生物学和蛋白质工程技术的进展为我们提供了强大的工具。
例如，通过核磁共振谱学（NMR）和X射线晶体学等技术，可以解析突变蛋白质的三维结构，从而揭示突变对蛋白质的结构和功能造成的影响。
同时，通过蛋白质工程技术，可以合成突变蛋白质，并研究其生物学活性和与遗传疾病之间的关联。
二、基于遗传流行病学的方法1. 关联分析方法：关联分析是一种常用的遗传流行病学方法，用于研究基因突变与遗传疾病之间的关联。
关联分析可以通过比较病人和正常人群的遗传变体频率来确定某个基因突变与特定遗传疾病之间的关联。
在这方面，单倍型和基因型关联分析是最为常用的两种方法。
单倍型关联分析通过比较病人和正常人群的单倍型频率来确定特定单倍型与遗传疾病之间的关联。
而基因型关联分析则通过比较病人和正常人群的基因型频率来确定特定基因型与遗传疾病之间的关联。
无创基因检测文献综述范文
无创基因检测文献综述范文一、引言随着基因组学研究的深入，基因检测已经成为医学诊断、疾病预防和治疗的重要手段。
其中，无创基因检测作为一种新型的检测技术，因其无创、无痛、无辐射等优点，受到广泛欢迎。
本文将对无创基因检测的相关文献进行综述，介绍其研究进展、应用领域和未来发展方向。
二、无创基因检测技术无创基因检测是指通过采集个体外周血或其他体液样本，利用基因组学技术对其中包含的游离DNA进行检测和分析，以实现对个体的基因信息进行快速、准确检测的技术。
目前，无创基因检测主要涉及的技术包括全基因组测序、目标序列捕获和高通量测序等。
三、无创基因检测的应用1.胎儿染色体异常筛查：无创基因检测最广泛的应用之一是胎儿染色体异常的筛查。
通过检测孕妇外周血中胎儿游离DNA的拷贝数变异，可以快速、准确地诊断胎儿是否存在染色体异常，如唐氏综合征、威廉姆斯综合征等。
2.肿瘤诊断与治疗：无创基因检测在肿瘤学领域也具有广泛的应用价值。
通过对肿瘤细胞基因突变的分析，可以协助医生制定个性化的治疗方案，预测患者对特定药物的反应，从而提高治疗效果和患者的生存率。
3.遗传性疾病：无创基因检测还可以用于遗传性疾病的筛查和诊断，如囊性纤维化、镰状细胞贫血等。
通过对相关基因突变的检测，可以为患者提供针对性的治疗方案和预防措施。
4.其他应用：除了上述应用领域外，无创基因检测在感染性疾病、药物代谢等方面也有广泛的应用前景。
例如，通过对病毒基因的检测，可以快速诊断病毒感染；通过对药物代谢相关基因的检测，可以预测患者对药物的反应和剂量需求。
四、展望与未来发展方向尽管无创基因检测在多个领域已经得到了广泛应用，但仍存在一些挑战和局限性，如检测灵敏度和特异性、数据分析与解读的准确性等。
未来，随着技术的不断进步和研究的深入，无创基因检测有望在以下几个方面取得更大的突破：1.检测灵敏度和特异性：随着测序技术的不断改进和数据分析方法的优化，未来无创基因检测有望实现更高的灵敏度和特异性，进一步提高诊断的准确率。
检测耐药基因突变的金标准
检测耐药基因突变的金标准1. 引言检测耐药基因突变是现代医学中的重要课题，对于指导临床治疗和预测疾病发展具有重要意义。
然而，由于耐药基因突变的复杂性和多样性，寻找一种可靠的金标准成为了当前研究的焦点。
本文旨在探讨检测耐药基因突变的金标准，并对当前相关研究进行综述。
2. 耐药基因突变的意义耐药基因突变是指在治疗过程中，细菌、病毒或肿瘤细胞发生了具有抵抗特定药物作用的遗传变异。
耐药基因突变是导致抗生素、抗逆转录病毒和抗肿瘤治疗无效或失效的主要原因之一。
准确检测耐药基因突变可以帮助医生选择更合适的治疗方案，提高治愈率和预后。
3. 目前常用方法目前常用于检测耐药基因突变的方法包括传统文化方法、PCR技术、高通量测序技术和基因芯片技术等。
传统文化方法是最早被使用的方法，通过培养细菌或细胞，观察其对药物的敏感性来判断耐药性。
然而，这种方法耗时且对于复杂样本不敏感。
PCR技术通过扩增特定基因片段来检测突变，具有高灵敏度和特异性。
高通量测序技术可以同时检测多个基因的突变情况，但其成本较高且数据处理较为复杂。
基因芯片技术则可以快速检测多个位点的突变情况，但其受限于已知位点的限制。
4. 金标准的定义金标准是指在特定领域中被广泛接受和认可的最可靠、最准确、最具权威性的标准或方法。
在检测耐药基因突变中，金标准应能够对不同类型、不同位点的突变进行准确、快速、经济有效地检测，并能够预测治疗效果和疾病预后。
5. 金标准存在的挑战寻找一个统一适用于所有耐药基因突变类型和位点的金标准是一个巨大的挑战。
首先，耐药基因突变的类型和位点多种多样，不同类型的突变可能对不同药物产生不同程度的耐药性。
其次，金标准需要具备高灵敏度和高特异性，以确保对突变的准确检测。
此外，金标准还需要具备较低的成本和较短的检测时间，以便在临床实践中得到广泛应用。
6. 基于PCR技术的金标准PCR技术是目前最常用于检测耐药基因突变的方法之一。
通过设计特异性引物和探针，PCR技术可以在短时间内扩增目标基因片段，并通过比对序列来检测突变。
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基因突变分析技术综述湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室 (长沙 410087)阮庆国 陆春叶综述 夏家辉审校提要 基因突变分析是确定某一未知基因与某遗传病之间关系的关键步骤,也是临床上对病人进行基因诊断的重要手段,本文对19种基因突变分析技术进行了分类综述,特别对近几年发展起来的几种新技术进行了详细介绍,并讨论了毛细管电泳在基因突变检测中的应用。
于1990年10月正式启动的人类基因组计划到今年已正式实施了八年,该计划的目标可概括为两点,即: 人类3×109bp的全序列分析; 全部基因的识别及功能分析。
据估算人类基因组中约包括5～10万个基因,它们分布在24个不同染色体和线粒体上,到1998年1月为止,已克隆的人类功能基因达到5052个,但确定与某一特定遗传病相关的基因只有821个,目前已被认定的孟德尔遗传病有1402种,这些病都至少与一个或几个基因的突变相关。
研究人类的全部基因,特别是与疾病相关的基因的结构、功能以及各种基因突变与疾病的关系,是人类认识遗传病的发病机理,并最终达到对遗传病进行基因诊断和基因治疗的重要环节。
从20世纪80年代开始,一系列寻找新基因的方法得以应用,如消减杂交,mRNA差异显示,外显子捕获等,基因克隆的策略也从最初的功能克隆法,候选基因法发展到今天的定位克隆法以及定位候选克隆法,并且染色体上已定位和测序的cDN A越来越多,表达图谱的内容越来越丰富,这就给发现新的未知基因,了解各基因的功能及其突变导致的疾病创造了极为有利的条件,从而大大加快了人类遗传病致病基因克隆的步伐。
但是在找到了一系列的候选基因之后,要确定哪一个基因是该病的致病基因,还需在相应的病人中进行突变检测。
在过去的十几年中,虽然已有19种突变分析的技术得到发展,但总的来说,寻找一种快速、高效而又经济的方法仍然是很多科研工作者的研究目标。
本文对突变分析的种种方法进行了分类综述,特别对近期出现的几种新技术进行了详细的讨论。
突变分析技术按其研究对象主要分为两大类,即: 对未知突变进行分析,即确定某一未知基因与某遗传病的关系; 对已知突变进行分析,即在临床上对致病基因已克隆的遗传病进行基因诊断。
在实际应用中许多检测未知突变的方法也可用来对已知突变进行检测。
一、对未知突变进行分析的方法1.RNA酶A切割(Rnase A cleavage)在一定条件下,异源双链核酸分子RNA: RN A或RNA:DN A中的错配碱基可被RNase A切割,切割产物可通过跑变性胶得到分离。
RN A探针可通过将相应的DNA片段克隆至含有SP6或T7启动子的载体中得到,当RNA 探针上错配的碱基为嘌呤时,RNase A在错配处的切割效率很低甚至不切割,而当错配碱基为嘧啶时,则其切割效率较高。
所以如果仅分析被检DNA的一条链,其突变检出率只有30%,而如果同时分析被检DNA的正义链和反义链,则有效率可达到70%[1]。
尽管RNase A切割法有其局限性,如需使用同位素,需将PCR 产物克隆至表达载体上,从而增加了操作的复杂度,但由于它能对1～2kb的片段进行检测,并能确定突变位置,且无需使用有害化学试剂,故仍被频繁使用。
2.变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradi-ent Gel Electro phoreris,DGGE)该方法的原理是:双链DNA分子在一定变性剂浓度的凝胶上电泳时,会在一定的时间・225・发生部分解链,导致电泳迁移率下降,当正常的DNA分子和发生突主的DNA分子之间即使只有一个碱基对的差异时,也会在不同时间发生部分解链,从而被分离成两条带。
为了提高检出率,还可将突变的DNA和正常人的DNA混合变性再变性,然后再在上述条件下电泳,则会形成四条带,即突变的DNA分子,正常的DNA 分子和两种发生错配的DNA分子,检测某种突变所需的特定的变性剂浓度可通过变性梯度凝胶电泳来确定[2]。
在两个同源双链DNA分子间有一个碱基对不同时,其T m值就相差1℃或更高,有一个碱基错配的异源双链DNA分子与同源双链DNA分子比较,其T m值可相差6℃以上,由于其T m值不同,这些有一个碱基错配或一个碱基对不同的双链DNA分子中发生突变的区域就会在不同的时间发生解链,从而被分离。
利用DGGE技术检测突变时应考虑的一个问题是当突变发生在高熔点区时则难以检测到突变,原因有二个: 随着熔解区域(T m值不同)的增加,迁移率的变化减少,难以将正常DNA分子和突变DNA分子分开,而当整个DNA分子完全解链时,其迁移率只取决于单链的长短; 突变区域发生解链需要较长时间,故检测所需的时间较长。
为了检测到所有可能的突变,在进行DGGE之前将所需检测片段的序列输入计算机,利用相应软件(如Bio-Rad公司的M acM elt So ftw are)进行分析,如发现突变位于高熔点区,则最好在一个PCR引物的5′末端加上一段约40～50bp的GC夹[3],但如果突变发生在GC富集区(如CpG岛),仍难以检测到,同时,该方法对肿瘤的突变检测有困难,尤其是对实体瘤,且该法不能确定突变位置。
该方法的优点是如果突变发生在最先解链的DNA区域,则其检出率可达到100%,其检测的片段可达1kb,尤其适于100～500bp的片段。
3.杂合双链分析法(H eteroduplex analy-sis,HA)由突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一个凸起,在非变性胶中电泳时,会产生与相应的同源双链DNA 不同的迁移率,从而使两者被分离开。
该方法原理与单链构象多态性(SSCP)相似,只不过SS-CP分离的是单链,而HA法分离的是双链。
HA 法简单迅速,但只适用于200～300pb的片段,且不能确定突变位置,检出率只有80%左右,有人建议将H A法和SSCP法联合使用,可能将检出率提高到接近100%[4],也有科研工作者建议使用缺失的野生型等位基因来提高该方法的灵敏度[5]。
4.化学切割错配(chemical cleavage of mismatch,CCM)化学切割错配是在Max am-Gilbert测序的基础上发展起来的一项突变检测技术,在DNA ∶DNA或DNA∶RNA异源杂合双链核酸分子中,错配的C能被羟胺(hydrox ylamine)和哌啶(piperidine)切割,错配的T能被四氧化锇(Osm ium tetro xide)所切割,切割产物跑变性胶电泳即可确定是否存在突变[6]。
只要操作得当,不会发生非特异性切割,如果对正义链和反义链都进行分析,可使检出率达到100%;使用荧光检测系统将会大大增强该方法的灵敏度,从而可检测出十个细胞中的一个突变细胞[7]。
该方法的最大优点是能对长至2kb的片段进行分析,并能确定突变位置,缺点是步骤多,费时,且需接触有毒的化学物质。
5.碳化二亚胺检测(Carbodiim ide,CDI)与CCM法相似,CDI能够对错配的G和T进行修饰,当用标记的引物对CDI修饰过的双链DNA进行DNA合成时,延伸会在修饰过的碱基处终止下来,合成产物跑变性聚丙烯酰胺凝胶电泳即可检测出是否有突变。
该方法的最大优点也是能对1～2kb的片段进行分析,突变检出率达到100%,能确定突变位置,并且CDI是一种没有毒性的物质[6],有报道曾用该法检测出了7.2kb DNA片段中的一个点突变[7],但当一个DNA片段中存在多个突变时,该方法就不适用。
6.酶促切割错配(Enzym e M ismatch Cleav age,EMC)・226・ EM C是一种与RNase A切割相类似的方法,T4核酸内切酶Ⅶ是一种分解酶(reso lvase),能够识别12种错配的碱基并在错配碱基的附近进行切割,酶切产物跑变性胶或中性胶即可检测出是否有突变[9],电泳产物的检测可用放射自显影,也可用银染。
由于该法能对DNA∶DNA异源杂合分子进行分析,因而省去了体外转录的步骤,其最长检测片段可达到1.5kb,该法的缺点是存在非特异性切割现象,并且对有些错配碱基的识别不是100%,因此在每次检测时都必须设有一个内对照。
7.单链构象多态性(Single-Str and Con-fo rmational Polymor phism,SSCP)该方法的原理是[10]:单链DNA在中性条件下会形成二级结构,这种二级结构依赖于其碱基组成,即使是一个碱基的不同,也会形成不同的二级结构并引起在非变性电泳条件不同的电泳迁移率。
由于SSCP法简单快速,因而被广泛应用于未知基因的突变分析和临床检测。
该方法最主要的问题是不能检测到所有的突变,由各实验室报导的突变检出率从99%到35%不等。
由于随DNA片段大小的增加,迁移率的改变明显减小,故而该方法只适合用来检测150～200bp的DNA片段[11]。
一般来说对小于200bp的片段其检出率可达90%,而对大至400bp的片段,其检出率可能只有70%～80%。
同时该方法要求多次摸索条件,如电泳温度,胶中甘油浓度以及胶联度等均可影响检测的灵敏度。
至于突变类型,除G到T的置换外,似乎对其检测的灵敏度并无大的影响,此外,该方法不能确定突变的精确位置。
尽管如此,由于SSCP 的使用简单便利,科研工作者在应用中对其进行了不断地改进,这些改进包括:优化电泳条件,多重PCR的使用,对较大片段的PCR产物先进行酶切消化再跑电泳,毛细管电泳取代普通胶电泳以及自动测序仪的使用等。
尽管这些改进增加了该方法的复杂度和花费,但却使SSCP的检出率大大提高,接近于100%。
此外,使用RNA分子来做SSCP会提高其灵敏度,尤其是对大于200pb的片段[12]。
8.切割片段长度多态性(Cleavage Frag-ment Length Polym orphism CFLP)CFLP技术是在限制性酶切片段长度多态性(RELP)和SSCP基础上发展起来的一种基因突变检测技术,其原理是:双链DNA变性后形成的单链在中性条件下形成二级结构(包含多个折叠的发夹状结构),正如SSCP一样,这种二级结构取决于DNA的核苷酸组成和顺序,即使有一个碱基的差异,也会形成不同数目的折叠状发夹结构,而Cleavase I外切酶能识别这种发夹结构,并在该结构的附近进行切割,切割产物跑变性聚丙烯酰胺凝胶检测,突变的DNA将出现与正常对照不同的酶切图谱[13]。
目前已有厂家生产了专门的试剂盒来进行这方面的工作,如Boehringer M annheim(BM)公司提供的CFLP Scan kit。
从理论上来说,该方法比较简单,能同时处理大量的样品,灵敏度也比SSCP高,但M addox LO等通过检测Iduronate 2-sulfatase(IDS)基因第八外显子中已知的六种突变,发现SSCP技术能检测到全部的六种突变,而CFLP技术仅能检测到六种突变中的三种[14]。