食品中常见病原菌微生物检验技术

～48 h。
▪ （4）观察菌落形态
▪
Baird-Parker 平板、血平板上挑取可疑菌落。
▪
金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker 平板上，菌落直径
为 2 mm～3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为 淡色，周
围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌
落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的
▪ 所有这些实验不能作为鉴别其产毒与否的依据。
血浆凝固酶试验：
吸取1:4新鲜兔血浆0.5 mL，放入小试管中， 再加入培养24 h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培 养物0.5 mL，振荡摇匀，置 36±1℃温箱或水浴 内，每半小时观察一次，观察6 h，如呈现凝块, 即将试管倒置或 倾斜时，呈现凝块者，被认为 阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及 肉汤作为对照。
宋内氏菌最强，福氏菌次之，志贺氏菌最弱。一
般56-60℃经10分钟即被杀死。在37℃水中存活20
天，在冰块中存活96天，蝇肠内可存活9-10天，
金黄色葡萄球菌的抗原构造和分型
对分型进行简单的了解。 １、血清学分型：
金黄色葡萄球菌水解，获得两种抗原成分：蛋白抗原和 多糖抗原。
蛋白抗原主要为葡萄球菌A蛋白（SPA)，是一种表面抗 原，90%以上金黄色葡萄球菌有此抗原，无特异性。
多糖抗原为半抗原，有型特异性。 ２、噬菌体分型。 ３、根据肠毒素分型。 ４、根据血浆凝固酶分型。
基红反应阳性，VP反应弱阳性。
▪
许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化
明胶。
▪
具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉
素、红霉素等高度敏感。
致病性
金黄色葡萄球菌是人 类化脓感染中最常见的 病原菌，临床表现多种 多样，可引起局部化脓 感染，也可引起肺炎、 胃肠炎、心包炎等，甚 至败血症、脓毒症等全 身感染。
急性胃肠炎
猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌 鼠伤寒杆菌、肠炎杆菌
败血症
二、检验所需器材
三、检验程序
沙门氏菌检验程序2010
四、操作方法
▪ 分五个步骤：
1.前增菌 ▪ 2.选择性增菌 ▪ 3.选择性平板分离 ▪ 4.生化实验 ▪ 5.血清型分型鉴定 ▪
▪ <国标>检测沙门氏菌方法分5个步骤：
▪ 1.前增菌： 在含有营养的非选择性培养基 中增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的
生理状态。
▪ 沙门氏菌检测中前增菌的目的是使沙门氏菌 恢复其活力。
▪ 检测经过加工的食品中的沙门氏菌需要前增 菌主要因为加工过程中沙门氏菌受到损伤而处于 濒死状态。
2.选择性增菌
▪ 在含选择性抑制剂的培养基中，样品进 一步增菌。
▪ 沙门沙门氏菌检测中增菌的目的是使沙门氏 菌以外的细菌（主要是艾希氏菌属）受到抑 制，而使沙门氏菌得到一定的增殖，提高沙 门氏菌的检出率。
金黄色葡萄球菌的致病性
致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶： a.溶血毒素：外毒素，分甲、乙、丙、丁、戊五种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引 起肌体局部缺血和坏死； b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞； c.血浆凝固酶：侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固 ，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。 葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关； d.脱氧核糖核酸酶：产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色 葡萄球菌； e.肠毒素：产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，现已鉴定出葡萄球菌肠毒素 有A、B、C1～C3、D、E、G、H共9种。肠毒素A是最常见的。
适用于检测可能含 有少量金黄色葡萄 球菌，却带有大量 竞争菌的样品
BP平板
36± 1℃ 45-48h
血浆凝固酶 实验
第三法 金黄色葡萄球菌MPN检验程序
查MPN表
报告结果
金黄色葡萄球菌的检测－－测定方法
➢ 国标方法注意事项
• 现象观察：染色镜检（形态、染色）
•
表面光滑的菌落，菌落色素不稳定，但多数gella）是人类细菌性痢疾最
为常见的病原菌，通称痢疾杆菌。 通常志贺氏杆
菌(Bacillus，shigae)仅指I型痢疾志贺氏菌。
▪ 志贺氏杆菌是日本志贺诘在1898年首次分离 得到的，因此而得名。
▪
本属细菌对理化因素的抵抗力较其他肠道杆
菌为弱。对酸敏感，在外界环境中的抵抗力能以
HE琼脂上典型特征
4.生物化学试验筛选
▪ 挑取选择性琼脂平板上的可疑菌落， 接种于三糖铁琼脂培养基中。
▪ 排除大多数非沙门氏菌。也提供了 沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定。
TSI(三糖铁)培养基 大肠杆菌和沙门氏菌
沙门菌常用生化试验
尿素酶试验 阴性（黄）阳性（红）
靛基质
对照管 阴性(－) 阳性(＋)
▪ 我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌
落总数、大肠菌群和致病菌三项。 ▪ 致病菌：能够引起人类发病的细菌。对不同
的食品和不同的场合，应该选择一定的参考 菌群进行检验。
第一节 沙门氏菌检验技术
一、生物学特性 是一大群在血清学上相关的革兰氏阴性杆菌，无芽孢、 无荚膜，周身鞭毛，能运动的需氧或兼性厌氧短杆菌。
▪ （2）增菌培养 吸取液体检样5ml，接种于50mL7．5 ％氯化钠肉汤50ml进行增菌。
▪ （3）分离培养 将上述培养物，分别划线接种到 BairdParker 平板和血平板。
▪ 血平板 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。 ▪ Baird-Parker 平板 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h 或 45 h
黄色葡萄球菌的计数； ▪ 第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量
较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。
第一法
定性 检测
检样
25g样品+ 225ml 7.5%NaCl肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤
36± 1℃ 24hr
血平板
BP平板
36± 1℃ 24hr
镜检 营养肉汤
36± 1℃ 24hr
血浆凝固酶 实验
36± 1℃ 6hr
报告结果
第一法
第二法 Baird-Parker平板法检验程序
定量检测 （平板法）
适用于检测金黄色 葡萄球菌数不小于 10/g（mL）的食品
定量 检测
（MPN法）
25g样品+ 225ml 生理盐水
梯度稀释
选三个连续梯度，每个梯度各取3mL加入3管胰酪胨大豆肉汤
36± 1℃ 45-48hr
类似菌落；但无混浊带及透明圈。
▪
在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿
润、 金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶
血圈。
B-P平板
￥7（90mm)
Baird－Parker(BP培养基/贝尔德帕克平板) 用于凝固酶阳性葡萄球菌的分离和菌落计数用。
▪ 血平板：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素 ，因此在血平板上产生明显的溶血环。
▪ 【方法】 ▪ （1）玻片法 ▪ （2）试管法
▪ 【结果判断】 ▪ （1）玻片法：5～10s内出现凝集者为阳性。 ▪ （2）试管法：如有凝块或整管凝集出现为阳
性。4h后无上述现象出现，则放置过夜后再 观察。 ▪ 【应用】 ▪ 本试验仅用于致病性葡萄球菌的鉴定。
金黄色葡萄球菌肠毒素的检测
一、动物学试验 主要用幼猫和猴。 二、血清学试验 肠毒素作为抗原，可以 和特异性抗体发生结合性反应，产生可见沉淀 用血清学反应检验金黄色葡萄球菌肠毒素 方法主要有： 1.免疫琼脂扩散法 2.反向间接血凝试验 3.免疫荧光法 4.酶联免疫吸附法
葡萄球菌皮肤感染
二、检验所需培养基
▪ 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤 ▪ 7.5 %氯化钠肉汤 ▪ 血琼脂平板 ▪ Baird-Parker 琼脂平板 ▪ 脑心浸出液肉汤(BHI) ▪ 兔血浆 ▪ 磷酸盐缓冲液 ▪ 营养琼脂小斜面 ▪ 革兰氏染色液 ▪ 无菌生理盐水
三、检验程序
▪ GB 4789.10-2010标准 ▪ 第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验； ▪ 第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金
醇发酵试验
邻硝基酚β－半乳糖苷酶试验（ONPG试验）
阳性（黄） 阴性
5.血清学分型鉴定
提供培养物菌种的鉴定。 用分离出的沙门氏菌与已知A-F多价O 血清及H因子进行玻片凝集试验。 1）抗原的准备 2）O抗原的鉴定 用A—F多价O血清做玻片凝集试验，以生理 盐水做对照。 3）H抗原的鉴定 4）Vi抗原的鉴定
▪ P150 ▪ （1） A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、氰化钾和赖氨
酸脱羧酶3项中有1项异常，按表可判定为沙门氏菌属。如有2项 异常，为非沙门氏菌属。 （2）A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体 两项实验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。 （3）A3：补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱 羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。 （4）必要时进行沙门氏菌生化群的鉴别。
第二节 金黄色葡萄球菌检验技术
金黄色葡萄球菌
金黄色葡萄球菌的流行病学
近年来，美国疾病控制中心报告， 由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位， 仅次于大肠杆菌。
金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫 生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素 引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的 33%，加拿大则更多，占45%，我国每年
发生的此类中毒事件也非常多。
金黄色葡萄球 葡萄球菌 表皮葡萄球菌 属分类： 腐生葡萄球菌
金黄色葡萄球菌食物中毒系 毒素型食物中毒。是由于进食 含有一种或多种含葡萄球菌肠 毒素的食物所引起。常见的菌 为金黄色葡萄球菌。
一、生物学特性
▪ 革兰氏阳性需氧或兼性厌氧菌 ，为球菌，排列成葡萄状，无芽 孢、鞭毛，不运动；大多数无荚 膜。