血块DNA提取步骤2015.8.20
DNA提取流程及PCR体系
DNA提取流程及PCR体系一、DNA提取流程：1.样本准备：选取合适的样本，如血液、组织、细胞等，并进行预处理，如洗涤、破碎等操作。
2.细胞破碎：将样本中的细胞壁和细胞膜破碎，以释放细胞内的DNA。
可以采用机械方法（如刮刀、搅拌器）或化学方法（如洗涤溶液、裂解酶）进行破碎。
3.蛋白质沉淀：通过加入蛋白酶K等蛋白质降解酶，将样本中的蛋白质降解沉淀，以便后续步骤中分离DNA。
4.DNA沉淀：通过加入冷醇（如乙醇）或盐溶液，使DNA分子形成可见的沉淀，然后用离心来分离沉淀。
5.洗涤：用盐溶液或酒精洗涤DNA沉淀，去除杂质，可以进行多次洗涤以提高纯度。
6. 重溶解：用适当的缓冲液（如Tris-EDTA）重溶解沉淀，得到高浓度的DNA溶液。
7.检测：对提取的DNA进行质量和纯度的检测，如使用比色法、凝胶电泳、荧光定量等方法来检测。
二、PCR体系：PCR（聚合酶链反应）是一种体外DNA复制的技术，它能迅速扩增少量DNA。
PCR体系的组成主要包括模板DNA、引物、聚合酶、四个dNTP、缓冲液和水。
1. 模板DNA：PCR的起始物质，可以是DNA提取物、基因库、克隆体等。
一般情况下，PCR需要1-100ng的模板DNA。
2.引物：PCR需要两种引物，分别位于模板DNA的两侧，起到引导DNA扩增的作用。
引物的浓度通常为0.2-1μM。
3. 聚合酶：PCR中常使用热稳定的DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶），它能耐受高温，保证PCR反应的稳定性。
通常为1-2.5 units。
4.dNTP：四个脱氧核苷酸，即dATP、dCTP、dGTP和dTTP，用于合成新DNA链的碱基。
通常浓度为0.2-0.4mM。
5.缓冲液：PCR反应需要具有适当的pH和离子强度的缓冲液，以维持反应中的酶活性和稳定性。
6.水：PCR反应中的水用于稀释和稀释试剂。
PCR反应一般分为三个步骤：变性、退火和延伸。
变性时，反应体系升温至94-95℃，使DNA融解成单链。
提取dna的实验步骤原理
提取dna的实验步骤原理DNA提取是一项重要的实验技术，用于从细胞中分离纯净的DNA。
它在生物学、医学、犯罪学等领域具有广泛的应用。
DNA提取的过程可以分为以下几个步骤：样品收集、细胞破碎、蛋白质消化、DNA分离、洗涤、溶解和纯化。
首先，样品收集是DNA提取的第一步。
样品可以来自不同的来源，如血液、唾液、组织样本等。
对于血液样品，静脉采血是最常见的方式。
收集的血液样品需要采用抗凝剂进行预处理，以防止凝血。
细胞破碎是DNA提取的关键步骤之一。
细胞破碎的目的是将细胞膜以及核膜破坏，释放细胞内的DNA。
常用的细胞破碎方法有物理破碎、化学破碎和酶解法。
物理破碎一般采用高速离心仪或超声波处理，通过机械力量破坏细胞结构。
化学破碎使用适当的溶液，如细胞裂解液（例如EDTA、SDS、蛋白酶K等）来分解膜脂质和蛋白质。
酶解法则通过酶的作用来降解膜和核酸。
蛋白质消化是为了去除提取过程中的蛋白质杂质。
蛋白质会干扰DNA的纯化和测定。
在蛋白质消化过程中，常用的方法是加入蛋白酶K或肾脏酸性蛋白酶等蛋白水解酶，通过其酶解作用将蛋白质降解。
DNA分离是将DNA与其他细胞组分分离的过程。
DNA在细胞破碎后呈现为线性或环状的形态。
为了分离DNA，一般采用盐溶液和有机溶剂共同作用的方案，如添加高浓度的盐类（如NaCl）和异丙醇。
这些溶剂会沉淀细胞残渣和蛋白质，而DNA则溶于水相中。
洗涤过程是为了去除残留的蛋白质和盐类。
洗涤液一般为酒精溶液，如酒精和醋酸盐。
洗涤时，将沉淀的DNA加入洗涤液中，通过离心使DNA沉淀，然后去除上清液。
此过程重复一至三次可以有效去除杂质。
溶解是将沉淀的DNA重新溶解于缓冲液中，以便于后续的操作。
溶解液可以是Tris-EDTA缓冲液、无菌纯水等。
在加入缓冲液后，将溶液置于水浴中进行搅拌和温度控制，使DNA彻底溶解。
纯化是最后一步，目的是去除DNA提取过程中的杂质，获得纯净的DNA。
常见的纯化方法有酚-氯仿抽提法和硅胶纯化法。
人全血DNA的提取实验步骤
人全血DNA的提取实验步骤
取2ml抗凝血于无菌15ml离心管
↓3000r/min 离心5min
弃上清，加入适量生理盐水
↓上下颠倒混匀
3000r/min 离心5min
↓
弃上清，加入约5倍体积的无菌ddH2O
↓上下颠倒混匀
室温静置5分钟，4000r/min 离心10min
↓
弃上清，加入约5倍体积的无菌ddH2O重悬白细胞沉淀
↓上下颠倒混匀
4000r/min 离心10min
↓
弃上清，加入STE至2毫升
↓上下颠倒混匀
再加10%SDS 200μl和10mg/ml 蛋白酶K 20μl 混匀
↓置56℃水浴震荡3h
取出观察白细胞消化情况（无可见沉淀），冷却至室温
↓
加入等体积饱和酚，缓慢摇动20min
↓4000r/min 离心10min
小心吸出上清转于另一无菌15ml离心管中
↓
加入等体积氯仿：异戊醇（24：1）缓慢摇动20min
↓4000r/min 离心10min
小心吸出上清转于另一无菌15ml离心管中
↓
向上清中加入1/10体积的3M NaAC（pH5.2），混匀
↓
再加入2倍体积的无水乙醇，缓慢摇动即可见DNA丝状体
↓
用无菌吸管吸出DNA丝状体移至装有1ml70%乙醇的Epp管内
↓
12000r/min 离心3~5min，弃上清。
沉淀用1ml 70%乙醇洗涤1~2次
↓
12000 r/min 离心3~5min，弃上清。
↓
室温风干或DNA风干机抽干
↓
用100μl TE溶解DNA 沉淀。
血样DNA提取方法
酚-氯仿法从全血中分离DNA二、操作步骤第一阶段：裂解与消化1、冰冻的血样在室温水浴中融化；2、将2 mL全血转入一个无菌的2 mL离心管中；3、4 ℃12000rpm离心10 min；4、弃掉液体，保留沉淀，加入1.5 mL的PBS缓冲液，涡旋震荡使沉淀悬浮起来，冰上温和摇动15 min；(2、将1 mL全血转入一个无菌的2 mL离心管中；3、加入等体积（1 mL）的PBS缓冲液，温和摇动15 min；)5、4 ℃12000rpm(3500 g)离心10 min，弃掉液体，保留沉淀；6、重复步骤4、5一次；至上清液透明，沉淀无色；6、用蓝枪头将沉淀捣碎，呈絮状（关键步骤，越碎越好）；7、离心管中加DNA提取液500μL-1 mL, 37 ℃水浴1 h,加蛋白酶K 3 μL -6 μL；（终浓度为60 μg/mL），混匀；8、在恒温水浴箱中37 ℃（55 ℃）温育过夜（16 h左右），至细胞沉淀物被完全消化，溶液澄清；10、反应液冷却至室温，加入1 mL的Tris饱和酚，放置冰上温和摇动20 min；11、4 ℃，12000 rpm离心10 min；12、将上层水相用移液器移到另一2.0mL灭菌离心管中；13、加入0.5 mL的饱和酚和0.5 mL的氯仿，放置冰上温和摇动20 min；14、4 ℃，12000 rpm离心10 min；15、将上层水相用移液器移到另一2.0mL灭菌离心管中；16、加入1 mL的氯仿，放置冰上温和摇动20 min；17、4 ℃，12000 rpm离心10 min；18、将上层水相用移液器移到1.5mL离心管中；19、加入1mL预冷无水乙醇（−20 ℃），轻轻口底摇晃多次至DNA析出，然后−20 ℃放置30 min（-20或-40均可）；20、用玻璃钩将DNA团钩出转入一新的灭菌离心管中，或4 ℃，12000 g离心10 min，弃去乙醇；或者4 ℃，12000 rpm离心10 min，弃去乙醇；21、加入70% 乙醇1 mL，温和摇动10 min；22、4 ℃，12000 rpm离心10 min，弃乙醇，重复漂洗一次（用移液枪将管底剩余酒精吸出）；23、真空干燥或室温下使乙醇挥发干净；或者，室温放置30min，60℃烘箱30s，使乙醇挥发干净；24、根据DNA的量，加入超纯水50-300 μL，4 ℃保存至DNA完全溶解，分光光度计测定浓度后，-80 ℃保存。
dna提取的基本步骤
DNA提取的基本步骤概述DNA提取是分子生物学和遗传学研究中的重要步骤，它可以从生物样本中分离出纯净的DNA。
DNA提取的基本步骤包括样本收集、细胞破碎、DNA溶解、纯化和保存等过程。
本文将详细介绍DNA提取的基本步骤及相关注意事项。
样本收集DNA提取的第一步是收集样本，样本可以是动物组织、植物组织、微生物或血液等。
在收集样本时，需要注意以下几点： 1. 使用无菌工具和容器，避免污染样本。
2. 样本应尽量新鲜，以保证DNA的完整性。
3. 样本应保存在低温环境中，如冰箱或液氮。
细胞破碎细胞破碎是DNA提取的关键步骤，它将细胞膜破坏，释放出细胞内的DNA。
常用的细胞破碎方法有机械破碎、化学破碎和酶解等，选择适合的方法取决于样本类型和实验需求。
下面是常用的细胞破碎方法： 1. 机械破碎：通过高速离心、搅拌或振荡等方法，将细胞破碎成碎片。
常用的机械破碎设备有超声波破碎器和珠磨机。
2. 化学破碎：使用化学试剂破坏细胞膜，使DNA释放。
例如，使用盐溶液或洗涤剂等。
3. 酶解：利用特定的酶降解细胞壁或细胞膜，释放DNA。
常用的酶有蛋白酶K和胰蛋白酶等。
DNA溶解细胞破碎后，DNA通常以DNA片段的形式存在于提取液中。
为了使DNA溶解在水溶液中，需要进行适当的处理。
下面是常用的DNA溶解方法： 1. 高盐溶解：通过加入高盐溶液，如Tris-HCl缓冲液和EDTA溶液，使DNA溶解。
2. 热溶解：将DNA样本加热至适当温度，使DNA片段解开，然后迅速冷却。
DNA纯化DNA溶解后，需要将其他杂质物质（如蛋白质、RNA和酶等）从溶液中去除，以获得纯净的DNA。
常用的DNA纯化方法有以下几种： 1. 酚/氯仿提取：通过酚/氯仿混合溶液，将DNA从溶液中提取出来。
酚可以溶解蛋白质，氯仿可以溶解脂质。
这种方法可以去除大部分的蛋白质和脂质。
2. 硅胶柱纯化：利用硅胶柱或硅胶磁珠，将DNA与其他杂质分离。
硅胶可以选择性地结合DNA，而其他杂质则不结合。
血液中DNA的提取
1、基因组提取的主要试剂配制1M Tris•Cl：121.14g Tris碱溶于800ml双蒸水中，用盐酸调pH值至8.0，定容至1L，高压灭菌。
高压灭菌条件为1.034×105Pa，20min。
0.5M EDTA：EDTA 186.1g溶于800ml双蒸水中，用NaOH调pH值至8.0，定容至1L，高压灭菌。
10%SDS：SDS 100g溶于900ml双蒸水中，加热至68℃助溶，用HCl调pH值至7.2，定容至1000ml。
TE缓冲液：量取1ml 1M Tris•Cl（pH8.0），加上0.2ml 0.5M EDTA（pH8.0），定容至100ml，高压灭菌（终浓度10mM Tris•Cl（pH8.0），1mM EDTA（pH8.0））。
20×SET缓冲液：17.532gNaCl，12.114gTris碱，0.7444gEDTA，溶于50ml双蒸水中，用盐酸调pH值至8.0，定容至100ml，高压灭菌。
（终浓度3M NaCl，1M Tris•Cl（pH 8.0），20mM EDTA（pH 8.0））。
蛋白酶K贮存液：10mg蛋白酶K溶于1ml的灭菌水中，于-20℃冰箱中贮存。
酚/氯仿/异戊醇：将其按24：23：1的比例混合放入棕色瓶中，于4℃贮存。
氯仿/异戊醇：将氯仿和异戊醇按规定的23：1混合，在棕色瓶中室温下贮存。
2、样品的采集及血液DNA提取（1）样品的采集将10ml的玻璃瓶及塑胶盖洗净灭菌，翅静脉抽取鹌鹑血液放入小瓶中（小瓶内事先加入肝素钠抗凝），注意在采集鹌鹑血的时候要尽量减少污染，动作应迅速。
（2）血液DNA提取步骤⑴用灭菌的1ml枪头从小瓶中吸取500μl血样，放入1.5ml的EP管里。
⑵向管内加445μl 1×SET、25μl蛋白酶K（10mg/ml）、25μlSDS（10%），混匀。
⑶55℃空气浴振荡过夜。
⑷加500μl Tris饱合酚，上下颠倒10min。
从全血和体液中提取基因组DNA的操作步骤(精)
从全血和体液中提取基因组DNA 的操作步骤提取DNA 需要的仪器和试剂：⑴ 1.5ml 离心管⑵ 移液管: 1000ul, 200ul, 40ul 各一支和移液管尖头: 100-1000ul, 1-200ul 各一盒⑶ 微型滤柱（备用）⑷ 小型旋转混合器一台⑸ 小型离心机: 可放入1.5ml 离心管和2ml 收集管.⑹ 恒温水浴⑺ 电冰箱: -20 C, 4 C⑻ 无水乙醇(自备)⑼ 70% 乙醇(自备)⑽ 利普生DNA 提取试剂盒。
内含: ⑴ 裂解液1 ⑵ 裂解液2 ⑶消化液 ⑷纯化液⑸弥散液 ⑹蛋白酶K ⑺ 带钩细玻棒一盒 ⑻ 微型滤柱若干。
提取DNA 前注意：⑴ 使血样品内容物达到室温（15 – 25 C ）。
⑵ 预热水浴到58 C ， 为步骤3作准备。
⑶ 置弥散液于58 C 内，为步骤4或步骤7作准备。
⑷ 所有的离心步骤均在室温下进行。
⑸ lml 全血可提得15-60ug DNA 。
一．从1ml 全血或体液中提取DNA 的步骤：⑴ 裂解1： 取1ml 全血，血桨，血清，淋巴细胞放入到1.5ml 的离心管中，加入400ul 裂解液1。
上下翻转，使沉淀物分散，旋转脉动15秒后放入离心机中离心，离心速率为8000rpm ，1min.。
倒掉上层液，可见离心管底部有血色沉淀。
重复此裂解步骤一次，这次是加入1ml 裂解液1。
最后用移液管吸净所有上层液弃去, 以使离心管底部的血色沉淀不再残留有裂解液1。
⑵ 裂解2: 在上面离心管中加入1ml 裂解液2。
上下翻转，务必使沉淀物分散， 旋转脉动15秒后放入离心机中离心，8000rpm ，1 min.。
倒掉上清液，可见离心管底部有微量淡红色沉淀。
重复此裂解步骤一次，这次仍然是加入1ml 裂解液2，最后用移液管吸净所有上清液弃去，以使离心管底部的灰白色沉淀不再残留有裂解液2。
⑶ 消化： 吸取蛋白酶K 10ul ( = 0.2mg )加入到上面的离心管中，用移液管尖头反复吹打， 使蛋白酶K 与沉淀物均匀接触后， 加入320ul 消化液，上下翻转离心管， 务必使沉淀物分散于消化液中。
实验一、血液标本提取DNA(蛋白酶K-酚抽提法)
实验一、血液标本提取DNA（蛋白酶K-酚抽提法）一、实验原理离心分离到外周血的白细胞层；用细胞裂解液溶解细胞膜、核膜，使组蛋白与DNA分离，再用酚、三氯甲烷/异戊醇抽提去除蛋白质，最后经乙醇沉淀即可得到基因组DNA片段。
二、实验步骤：1、血液标本处理 1.0ml抗凝全血(ACD、EDTA抗凝均可)2000rpm离心10min（1.5mlEP管）。
轻轻去上清液（血浆），吸出淡黄色悬浮液（白细胞层）置于另一2.0mlEP管中。
（约50μl）2、细胞裂解加入10倍体积组织细胞裂解液，37℃1h，3、加入蛋白酶K消化加入蛋白酶K至终浓度100μg/ml（约4μl），充分混匀，37℃震荡12-24h或37℃1h后，56℃水浴3h。
保温过程中不时摇动，混匀反应液。
液体逐渐变粘稠，表明已有DNA释放出来，操作应轻柔。
4、酚抽提：将上述溶液冷却至室温，加等体积的Tris饱和酚（pH8.0）溶液，温和缓慢颠倒离心管10min，混匀两相成乳液。
12000rpm 5分钟，两相分层。
用宽口径移液管小心吸出上层粘稠的水相，移至一新的2.0mlEP管中。
（小心一点，不要吸入蛋白层。
如交界处有白色沉淀，需重新抽提有机相，用酚重新抽提两次，合并水相）5、三氯甲烷/异戊醇抽提上清液加等体积三氯甲烷：异戊醇（24：1），倒转混匀10分钟，12000rpm5分钟，取上层水相0.5ml入另一新的2.0mlEP管；6、DNA沉淀上清液中加0.2倍体积3.0mol/L 醋酸钠，再加2倍体积的4℃冰箱冷却后的无水乙醇，轻柔振摇，充分混匀；应可看到白色絮状物（DNA）。
12000rpm 5分钟，弃上清液；7、纯化：加1ml 70%乙醇洗涤，12000rpm 离心5分钟，去上清夜，重复1次；（此过程不得振荡摇动）8、溶解：弃上清液后，自然干燥（挥发痕量乙醇）后，用30μl pH8.0TE完全溶解，保存在-20℃备用。
三、注意事项1、加样准确，操作轻柔；微量加样器绝对不能超过最大量程；2、加酚试剂时，不要接触到皮肤上，有腐蚀性；如不小心弄到，立即用清水冲洗；3、取上清液时，不可吸到下层溶液；4、加TE液后轻摇10min溶解DNA或-4˚C保存待用。
DNA抽提的操作步骤
DNA抽提的操作步骤试剂准备：蛋白酶K、白细胞裂解液、苯酚、氯仿、无水乙醇、70%乙醇1.从冰箱取出冰冻的白细胞，将编号和姓名写在登记本上。
待白细胞融化后，向管内加入5ml白细胞裂解液和50ul蛋白酶K（20mg/ml）。
将管内液体摇匀，或者借助移液枪反复吹打混匀。
然后将管子放入60℃水浴锅内，过夜（可以根据孵育的时间长短适当调整温度）。
在水浴的过程中，每隔2-3小时将试管震荡摇匀一次。
2.把水浴锅内的试管取出，将其中的液体转移到15ml试管内（15ml的试管事先做好标记），并依次向试管内加入等体积（即5ml）的酚-氯仿，然后将盖子拧紧。
轻轻上下颠倒混匀（20次左右），然后离心3000rpm，15min。
离心时将离心机的温度调至室温，温度过低会导致有机溶剂凝固。
离心结束后，可以看到试管内的液体分为三层，上层为水相，中间为变性的蛋白质，下层为有机溶剂（酚氯仿）。
3.然后用钝口Tip吸出上层水相转移到干净的试管中（注意：将1ml的Tip尖端减去2-3mm即可得到钝口的Tip，在吸取上层水相的过程中要尽量避免混入蛋白相，动作要缓慢）多分几次转移），然后再加入等体积的酚氯仿，拧紧盖子，颠倒混匀，离心3000rpm，10min。
4.再次用钝口Tip把上层水相转移到干净的试管中，然后向试管内加入2倍体×2），拧紧盖子，缓慢颠倒，积的无水乙醇（无水乙醇的体积=V所吸出的上清的体积即可看到絮状的DNA沉淀析出。
（如果抽提的数量较少，可以将管子放到Cold Room，等数量多了再一起进行下面的操作）5.用黄色Tip把白色絮状的DNA沉淀挑出来，放到70%乙醇（预先准备0.5ml的小管子，加入400ul70%的无水乙醇，洗涤用）中洗涤，重复两次。
6.最后用黄色Tip将DNA沉淀挑出，将DNA连同枪头一同打到1.5mlEP管中。
敞开盖子，室温放置直到乙醇完全挥发，向EP管内加入400ulTE，用Tip头反复吹打，使DNA完全溶于TE，得到DNA溶液。
全血DNA提取步骤
从全血中抽提基因组DNA的方法1、取全血700µL离心，5000rpm，5min，弃去上清液。
2、沉淀物用1mL的红细胞裂解液洗涤3次，5000rpm，5min，弃去上清液，倒干。
3、加入450µL细胞裂解液和6µL蛋白酶K（20mg/mL），55℃～66℃水浴4小时。
4、用等体积的酚、氯仿、异戊醇（25︰24︰1）抽提2次，12000rpm，5min。
5、用2倍体积冰预冷的无水乙醇沉淀（无水乙醇），有絮状沉淀后置于―20℃，沉淀30min。
6、沉淀结束后，12000rpm，5min，弃上清液。
7、用800µlL70%的乙醇洗涤沉淀，12000rpm，3min。
8、弃上清液，干燥。
9、加入50µL 1×TE缓冲液溶解，―20℃保存备用。
附：DNA提取相关试剂配制1、红细胞裂解液（PH 7.4）配制量：1L配制方法：（1）、称量NH4CL 0.802g、NaHCO3 0.84g、Na2EDTA·2H2O37.22g，置于1L烧杯中。
（2）、向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。
（3）、加去离子水将溶液定容至1L后，高压灭菌。
（4）、室温保存。
2、细胞裂解液（PH 8.0）配制量：500Ml配制方法：（1）、称量NaCL 2.92g、SDS 5g、Tris 0.61g，置于1L烧杯中。
（2）、向烧杯中加入约300ml的去离子水，搅拌溶解，在溶解过程中用1mL移液器加入10mL的TriTon-100。
（3）、溶解后加入20mg/mL的蛋白酶K 3µL.（4）、加去离子水将溶液定容至500mL后，高压灭菌。
（5）、室温保存。
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准备工作：
1.耗材：100ul黄色枪头；1000ul蓝色枪头（提前一天高压并烤箱烘干，装枪头，
枪头盒隔一段时间高压一次）；1000μL枪；100μL枪；卷纸； 2.0ml Ep
管、1.5ml Ep管、标签；废液瓶、乳胶手套、PE手套、记号笔、塑料插
板；50ml离心管；离心柱；计时器；垃圾盒、垃圾袋。
2.试剂：RBC（红细胞）裂解液、细胞核裂解液、蛋白沉淀液、DNA溶解液；
异丙醇、70%乙醇（棕色瓶无水乙醇，提前配好，35ml无水乙醇+15ml
去离子水）。
3.仪器：水浴箱—3楼309室；烤箱—4楼实验室前门外面。
4.血样。
血块提取DNA操作步骤：
1.取出血样，于37 ℃水浴30min融化，然后取出恢复室温后备用。
2.取1200μL红细胞裂解液到2.0ml 离心管（先做这一步）。
3.将血块转入离心柱，不要加太满！！！不然后续步骤会爆管，加多了就切点血
块回原先的管子中，尽量不要吸到血水，12,000 rpm 离心 1 min，若血块依然离不下来可再离1分钟。
4.将离心后的离心柱弃掉，过滤后的血样加到上述装有红细胞裂解液离心管中，
用力震摇20min，确保充分混匀。
5.12,000 rpm 离心2 min，小心倒弃红色上清，留下完整的管底白细胞团和大
约10μl的残留上清。
6.取1300μl红细胞裂解液于上述离心管中，弹散后，用力震摇20 min。
7.12,000 rpm 离心2 min，小心倒弃红色上清，在纸上倒扣后留下完整的管底
白细胞团。
8.在上述离心管中加一滴RBC裂解液（根据沉淀大小自己掌握，沉淀大的可
适当加多一些），弹管壁并涡旋振荡直至白细胞团充分分散。
9.沿管壁加500μl细胞核裂解液于离心管中（将管壁上残留的细胞冲下去），缓
慢吹打几次混匀以裂解白细胞，切记一定要吹匀，颠倒离心管10 次保证裂解液和所有的白细胞接触并裂解。
10.加入280μl蛋白沉淀液后，在涡旋振荡器上高速连续振荡混匀25 秒（一定
要看着确保整个管子里面的液体都涡旋起来）。
11.12,000 rpm 离心5 min。
上清液千万别倒。
12.（换手套）取新的1.5ml离心管加入700μl异丙醇，小心吸取上清液到新的
1.5ml离心管中，宁可有剩余也不要吸到沉淀！！！。
13.轻柔颠倒混匀直到出现棉絮状（丝状）白色DNA 沉淀。
14.9,000 rpm 离心2 min.小心倒弃上清液，在纸上倒扣后留下完整的沉淀。
15.加入1ml 70% 乙醇，颠倒混匀（手指弹至DNA悬浮于乙醇中），9,000 rpm
离心 2 min。
弃上清，离心前看一下确保沉淀在液体中。
16.加入0.5ml 70% 乙醇，颠倒几次漂洗DNA 沉淀，9000rpm 离心1-2min，，
离心前看一下确保沉淀在液体中，倒去上清（注意不要把DNA 沉淀倒掉了），倒置后在吸水纸上10min以控干残留乙醇，，空气晾干几分钟。
17.加入70-150 μl DNA溶解液重新水化溶解DNA 沉淀，一定要确保沉淀浮起
来放置在55℃温育24h。
18.取出定量后于-20℃保存备用。