瑞氏染液配制、使用方法及注意事项
瑞氏吉姆萨复合染色液
外周血涂片的制作方法1、采血：胶头滴管吸取血液，血液直接滴加到洗净烘干并且硅化过的载玻片的一头。
2、推片：将推片的平齐端置载玻片上血滴的稍前方，将推片略向后移使与血液相接触，血液遂于推片与载玻片的夹角间散开。
以约30度的夹角向前均匀地推动推片即可制成血涂片。
其薄厚度要适中，分布均匀而无空泡，边缘整齐。
3、固定：推片做好后，涂片后潮干固定，以免细胞漂落太多，影响制片质量，甲醇固定液固定：涂片直接浸入固定液内，因固定液充足，固定效果较好。
但细胞易脱落而发生交叉污染，因此应该分瓶固定，固定液回收时应过滤。
多数标本用此法固定，固定时间15-30分钟。
4、染色：瑞氏-基姆萨双染1）从固定缸里取出载片后，在室温下通风晾干。
将载片平放在玻璃板上准备染色。
2）所用的两种染料事先过滤好（染料中有颗粒物，会沉淀在载玻片上影响载片的质量）3）将染料滴加到载玻片上以后，让其均匀覆盖住载片上的血细胞，染色时间约为2到3分钟。
等瑞氏染液有变红的趋势时，迅速滴加与瑞氏染液等量的PBS溶液。
继续染色2到3分钟。
4）染色时间到后，用PBS溶液冲片，小股水流，防止将大量的细胞从载片上冲落下来从而影响以后的观察。
冲片结束后将载片放到阴凉处风干。
5）在玻璃板上放好牙签，将风干的载片倒扣在一根牙签上，从背面滴加基姆萨染液进行扣染。
染色时间约为10分钟。
时间到后用蒸馏水冲片，洗净染液后常温下风干。
5、封片：中性树胶封片，制作成永久涂片。
6、显微观察：将干燥后的血涂片置显微镜下观察。
用低倍镜观察血涂片体、尾交界处的血细胞。
在显微镜下，成熟红细胞染成粉红色；血小板染成紫色；中性粒细胞胞质染成粉红色，含紫红色颗粒；嗜酸性粒细胞含大的桔黄色颗粒；嗜碱性粒细胞胞质含有大量深紫蓝色颗粒；单核细胞胞质染成灰蓝色；淋巴细胞胞质染成淡蓝色。
所需材料：硅化过的载玻片，推片，甲醇瑞氏-基姆萨双染，过滤，PBS，牙签，蒸馏水，中性树胶，显微镜，吸耳球1．载玻片使用前，必须仔细清洗，并用乙醇或软布清洁。
瑞氏染液
新离解。 ○缓冲液须保持一定的 pH 使染色稳定，PBS 的 pH 一般在 6.4~6.8， ○偏碱性染料可与缓冲液中酸基起中和作用，偏酸性染料则与缓冲液中的碱基起中和作用，使
pH 定。 缓冲液配制
（pH6.4~6.8，弱酸性）： 配方 1 ： 配方 2： 1% KH2PO4 30ml M/15 KH2PO4 73.5 ml 1% Na2HPO4 20ml M/15 Na2HPO4 26.5ml H2O(新鲜) 加至 1000ml 置室温黑暗处，瓶口密封，防止霉菌污染，如有污染则应报废。 姬姆萨（Giemsa's stain；天青-伊红）染色 1．姬姆萨染料是伊红(AzurII Eqsin)和天青（蓝）2 号合成的。 2．姬姆萨染料（ Giemsa, 天青-伊红）染液配制： 姬姆萨染料（粉末） 0.5g 或 7.5g 甲醇（AR） 33ml 或 500ml 甘油（AR） 33ml 或 500ml ●先将姬姆萨染料放入乳钵中，逐渐倒甘油研磨溶于甘油中，置于 56℃水温箱内，90～120 分 钟，然后加入甲醇，摇匀后放置数天，过滤后或不过滤即可使用。此染液放置室温阴暗处，时间越 长越好。 ●使用染液可临时配置）：姬姆萨染液 1ml，加 DDH2O10ml 混匀。即可使用。 染色步骤 （1）先用甲醇固定 2～3 分钟。 （2）将血或骨髓涂片放置姬姆萨使用液 15～30 分钟。 （3）涂片用自来水冲洗，在室温中干燥待查。 染液鉴定 瑞氏或姬姆萨染色液鉴定：刚配好或放置一个月以上的染液可进行下列鉴定： 1．取 1 滴染液于乳白玻板上，自行迅速扩散开，其颜色变紫红色，且有伪足形成。 2．取 1 滴染液加 1 滴缓冲液，染液由深蓝色立即变为紫红色。 3．取血片或骨髓片进行试染检查，观察染色后各类细胞的胞核、胞浆及颗粒着色情况，pH 是 否合适及染色合适时间。如有上述变化，表明染液合格，可供使用。 混合染色 瑞氏染色(Wright's)-姬姆萨（Giemsa's）混合染色： ●瑞氏染色的染料配方浓度对细胞核着色程度适中,细胞核结构和色泽清晰艳丽,对核结构的识 别较佳,但对胞浆着色偏酸,色泽偏红,对细胞浆内颗粒特别是嗜天青颗粒及嗜中性颗粒着色较差。 ●姬姆萨染色对胞浆着色能较好的显示胞浆的嗜碱性程度,特别对嗜天青、嗜酸性、嗜碱性颗 粒着色较清晰, 色泽纯正,而对胞核着色偏深,核结构显示较差。 ●故采用以瑞氏染液为主，姬姆萨染液为辅的混合染色。 染色步骤： 1. 先用瑞氏染液将涂膜面充分覆盖； 2. 稍等片刻再加姬姆萨染液 2-3 滴加减(根据涂片上细胞多少及增升程度酌情而定)； 3. 稍等 1-2 分钟后,再加磷酸盐缓冲液,加时应缓慢地一滴一滴加在涂片膜上,直至膜面上染色液 形成表面张力而终止染色液加入； 4. 染色 30-40 分钟； 5. 分色：用自来水缓缓冲洗至少 3 分钟以上,待干，勿用滤纸吸干,以免滤纸纤维污染涂片。
瑞氏吉姆萨染色步骤
瑞氏吉姆萨染色步骤瑞氏吉姆萨染色是一种常用的细胞染色技术，它能使细胞的形态、结构和功能等方面的信息得到更加清晰的展现。
下面将介绍瑞氏吉姆萨染色的步骤。
一、制备细胞涂片首先需要制备细胞涂片，即取一定数量的细胞，将其分布均匀地涂在载玻片上。
制备细胞涂片时需要注意，要使细胞分布均匀，不要有过多的交叉和重叠现象。
二、固定细胞细胞涂片制备好后，需要进行固定。
固定的目的是防止细胞在染色过程中失去其原有形态和结构。
固定液可以用4%的乙醛或乙醇，也可以用甲醛进行固定。
三、染色在固定液起作用后，需要进行染色，这是瑞氏吉姆萨染色的核心步骤。
染色液的配方为：甲基绿、甲基红和亚甲蓝各1克，乙酸1毫升，蒸馏水100毫升。
将染色液滴在细胞涂片上，静置10-15分钟。
四、洗涤染色液静置后，需要用蒸馏水进行洗涤。
洗涤的目的是去除多余的染料和固定液。
五、脱水洗涤完成后，需要将细胞涂片进行脱水。
脱水的目的是使细胞涂片逐渐失去水分，加强细胞涂片的硬度和稳定性。
脱水可以用70%、80%、95%和绝对酒精进行，每种酒精浸泡时间为2-3分钟。
六、透明化脱水后，需要进行透明化处理。
透明化的目的是使细胞涂片变得透明，方便观察和保存。
透明化液可以用苯酚、苯酚-氯酸-甘油溶液等。
七、封片透明化完成后，需要进行封片，即用封片胶封住细胞涂片。
封片胶可以用环氧树脂或丙烯酰胶进行。
总结瑞氏吉姆萨染色是一种常用的细胞染色技术，能够使细胞形态、结构和功能等信息得到更加清晰的展现。
其步骤包括制备细胞涂片、固定细胞、染色、洗涤、脱水、透明化和封片。
不同的步骤需要注意不同的细节，只有每个步骤都严格按照要求操作，才能得到满意的染色结果。
瑞氏染色操作步骤
瑞氏染色操作步骤瑞氏染色是一种常用的细胞染色方法，主要用于观察细胞核形态和染色体结构。
下面将详细介绍瑞氏染色的操作步骤。
一、实验前准备1.1 材料准备瑞氏染色所需的材料有：0.075mol/L KCl、甲醛、乙酸、96%乙醇、苯酚红溶液、甲基绿溶液和天然丝。
1.2 设备准备实验所需的设备有：离心机、恒温水浴器和显微镜等。
二、样品制备2.1 细胞培养首先需要培养好待检测的细胞，使其达到适当生长状态。
在培养过程中，应注意避免污染和过度生长等问题。
2.2 细胞处理将待检测的细胞收集到离心管中，并加入0.075mol/L KCl缓冲液进行离心。
将上清液倒掉，再加入甲醛进行固定处理。
2.3 固定处理将含有甲醛的离心管放置在恒温水浴器中，在37℃下固定处理30分钟，使细胞膜破裂并释放染色体。
2.4 滴定染色将固定后的细胞加入苯酚红溶液，再滴入甲基绿溶液，使染料均匀地覆盖在细胞上。
三、显微镜观察将染好色的细胞片放置在显微镜下进行观察。
可以通过调节显微镜的焦距和光源亮度等参数来获得更清晰的图像。
四、实验注意事项4.1 操作过程中应注意保持无菌环境，避免污染样品。
4.2 在固定处理时，应控制好温度和时间，避免过度固定或过短固定导致样品失真。
4.3 在滴定染色时，应注意均匀地覆盖在细胞上，并避免出现气泡等问题。
总结：瑞氏染色是一种常用的细胞染色方法，其操作步骤包括实验前准备、样品制备、显微镜观察和实验注意事项等方面。
在操作过程中需要注意保持无菌环境、控制好温度和时间、均匀地覆盖染料等问题，以获得更准确的实验结果。
瑞氏染液制作血涂片
清洁液（洗液）重铬酸钾（工业品纯）300g浓硫酸（工业品纯）300ml自来水3000ml实际上重铬酸钾、硫酸和自来水之比为1：1:10。
先将重铬酸钾溶于水，如加热须待冷后，再缓慢加入浓硫酸，边加边搅。
不准将水倒入浓硫酸内！！！另外，清洁液只能用于玻璃仪器的清洗，不能浸泡金属器械。
血涂片的制备：1、载玻片及盖玻片泡酸时间大于24小时，一张一张放，保证每一张都浸湿2、冲洗，先用自来水冲净至没有颜色，再用流水冲洗一夜3、放在95%的酒精中浸泡过夜4、取出后用棉布擦干，涂片，并用甲醇固定，竖直干燥。
Wright染色法制作血涂片1、取涂好的血片，用玻璃笔划出染色区，以防染液滴落后溢流。
2、将涂片平放桌上或者架上，滴加Wright染液至恰好布满所划范围的血膜，混动使混匀，染色约3分钟。
Wright染液配法:Wright粉剂0.1g，加甲醇60毫升。
将Wright粉剂放在乳钵内，充分研磨，越细越好。
然后取甲醇逐步加入乳钵内，边加边研磨，直至染料全部溶解，置试剂瓶中密封，以后走后可用，以放置一个月后再用最佳。
3、加入等量磷酸盐缓冲液（pH6.8~7)，不断晃动，染色约12分钟，直接放与流水下冲洗。
4、染色后甩干或者直立晾干，用中性树胶或者合成树脂或香柏油封片，或不封片直接镜检。
时间：温度较低时约15分钟（染3分钟，加缓冲液不断晃动12分钟。
温度较高时，总时间约5分钟。
剂量：染液与缓冲液剂量之比为1:1如果染色不够，蒸馏水冲洗后，在按照原步骤重新染封片：干燥后的血涂片，浸入二甲苯中后在其干燥前，擦去蜡线，滴明胶与血涂片的一边（半滴至一滴），眼科镊捏住盖玻片正面在酒精灯上烘烤一下后反面贴于载玻片上。
结果：红细胞呈橘红色；中性粒细胞颗粒蓝紫色至紫红色；嗜酸性粒细胞鲜红色至橘红色；嗜碱性粒细胞颗粒深蓝紫色；淋巴细胞核深蓝紫色，胞质天蓝色；单核细胞核蓝紫色，胞质灰蓝色。
、注：①Wright染料对pH较敏感，因此用缓冲液稀释染液，可使染色作用稳定，便于识别和比较细胞的变化。
瑞氏染液说明书
北京索莱宝科技有限公司
瑞氏染液说明书
货号：G1040
规格：50mL/100mL
保存：室温避光保存，有效期至少2年。
产品说明：
瑞氏染料是由碱性染料美蓝（methylene blue）和酸性染料伊红（Eosin Y）组成的复合染料，溶于甲醇。
伊红通常为钠盐，有色部分为阴离子。
美蓝通常为氯盐，有色部分为阳离子。
甲醇的作用：一是溶解美蓝和伊红，使其解离为有色美蓝正离子的和伊红负离子。
后两者可以选择性地吸附于血细胞内的不同成分而使其着色；二是固定细胞形态，加速染色反应，增强染色效果。
使用方法：
本产品可作为多种组织或细胞的染色使用，不同组织、细胞，不同的用途可以有不同的使用方法。
具体方法请根据自己需求参考既有文献，本产品以涂片为例，举例说明，仅供参考。
1、取涂片、自然干燥。
2、滴加瑞氏染液染3分钟,使标本被其中甲醇所固定。
3、加等量PH6.4的磷酸盐缓冲液(或等量超纯水)轻轻晃动玻片,与瑞氏染色液混匀，静置5分钟。
4、水洗、吸干、镜检。
5、细菌染成蓝色，组织细胞胞浆红色，细胞核蓝色。
注意事项：
1、涂片厚薄适宜，涂片干透后固定，否则细胞在染色过程中容易脱落。
2、所加染液不能过少，以免蒸发而使染料沉淀。
冲洗时间不能过久，以防脱色。
3、染色对pH十分敏感，稀释染液必须用缓冲液，冲洗用水应接近中性，否则可能会导致细胞染色异常，形态难以识别，甚至错误。
4、染色过淡可以复染，复染时应先加缓冲液，然后加染液。
染色过深可用流水冲洗或浸泡，也可用甲醇脱色。
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瑞氏染色
瑞氏染色瑞氏染色是目前最常用而又最简单的染色方法。
1原理：瑞氏试剂中之酸性伊红和碱性美篮混合经化学作用后，变成中性之伊红化美蓝，久置后，经氧化而含有天青。
此三种染料分别和细胞核及浆中的NH3+和COO-等结合，使细胞核及胞浆着色。
由于系中性染料，又有缓冲液调节酸碱度，所以细胞受染后，蓝红等颜色都较适中，核染质、胞浆及其中之颗粒显色较为清楚。
2 试剂配制：1、瑞氏试剂瑞氏染料〔粉〕1克，加不含醋酮之甲醇600毫升溶解过滤后即成。
混合方式可将瑞氏染料置于研钵内，加适量甲醇混合研磨，使染料溶解，将已溶解的液体倒入清洁玻瓶，再放入甲醇继续溶解剩下染料，直至染料及甲醇均用完为止，然后过滤，以深色中性之玻璃瓶储藏待用。
亦可将1克染料一次参加600毫升甲醇中，盛深色玻璃瓶内，塞好瓶口，置于温暖而黑暗之处或37度温箱内，每日振荡5min，连续7天以上，然后过滤储藏用。
染液宜久置后使用，通常存放愈久，染色效果愈好。
2、缓冲液由1%的磷酸氢二钠和1%的磷酸二氢钾各30毫升加蒸馏水1000毫升配成，或以上两药各1克加2500毫升左右蒸馏水制成。
以石蕊试纸检验、调整酸碱度，使PH在6.5-7之间即可。
缓冲液亦可永新鲜蒸馏水或煮沸后密闭保存的蒸馏水。
如蒸馏水与空气过多接触，那么可因吸收空气中之二氧化碳而使PH值变低，影响染色，故不宜使用。
3、染色步骤1 将已编号之涂片水平置于染色板或者染色架上，涂片两端各划一道蜡笔线，主要防止染液外溢。
2 滴加瑞氏染色液。
其多少依标本所占面积大小而定，一般为4-8滴，至染液将标本完全盖住为止。
染液不宜过少，否那么，甲醛挥发后，易产生沉淀；不可过多，以免因过盛而流失，影响染色。
3 1-2分钟后，滴入缓冲液〔染液与缓冲液的比例约为1：1.5，冬季1：1，夏季1：2〕。
以气囊向玻璃片上轻轻打气，使染液和缓冲液混合均匀，一般不宜口吹起，以免呼出二氧化碳改变缓冲液酸碱度而影响染色。
4 自缓冲液滴入10-15分钟后，用自来水冲洗。
瑞氏染色操作流程
瑞氏染色操作流程一、瑞氏染色实验前准备1.1准备染色液和显影液针对瑞氏染色实验，首先要准备染色液和显影液，染色液由25mL的瑞氏染料，90mL的盐酸溶液（浓度为5％），以及1mL的激发剂混合而成。
而显影液则是在10mL的9N的硫酸、10mL的5％的NaOH溶液、10mL的1％的苯甲醇和10mL的1％的芳香族醇基乙醇混合而成。
1.2准备染色木质菌梗在预先准备瑞氏染色液和显影液后，接下来要准备染色用的木质菌梗才能开始瑞氏染色实验。
首先，用洗碗笠将要染色的木质菌梗洗淨，然后用医用刀在木质菌梗中切出厚约2mm的薄片，最后用蒸汽–水泼淋法将木质菌梗片浸湿，方可准备瑞氏染色实验。
二、瑞氏染色实验操作2.1放置染色片在准备好染色液和显影液，以及木质菌梗薄片后，此时要把准备的的木质菌梗薄片放置在染色槽内，以留出表面空间，方便染色液充分浸渍。
2.2加入染色液之后将准备的瑞氏染色液加入染色槽，在实验室内控制温度为37℃，放置20分钟后，可以观察菌梗表面是否呈染色，一般都可以看到浅色到深色之间的蓝色或紫色染色，这说明瑞氏染色已经取得成功。
2.3加入显影液如果瑞氏染色实验成功，那么接下来可以准备将木质菌梗片洗净后加入显影液了，而此时温度需要将控制在22℃，放置5-10分钟后，可以发现菌梗片变淡，并且半透明，证明显影液已经取得成功。
2.4用x网影像再接着，用X网影像观测染色后的木质菌梗，当观测到菌梗表面开始出现斑斑点点发亮时，这表明染色实验结束，在此基础上对木质菌梗进行另一个体系的判断，也就是对菌梗的形态和染色的准确性进行分类、认定和鉴定。
三、瑞氏染色实验结束完成上述瑞氏染色实验操作后，就可以对经过染色后的木质菌梗进行分析、鉴定，完成木质菌梗的离子吸收率、分子斑点和染色效果等等内容，通过瑞氏染色实验把细菌聚集在一起，以便进行实验分析，这正是瑞氏染色实验取得成功的原因。
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瑞氏染液配制、使用方法及注意事项
南宁市二医院检验科马升俊
1.瑞氏染色的原理：
瑞氏染色法使细胞着色既有化学亲和反应，又有物理吸附作用。
瑞氏染料由酸性染料伊红和碱性染料美蓝的氧化物（天青）组成,其深于甲醇后,解离为带正电的美蓝和带负电的伊红离子。
各种细胞由于其所含化学成分不同，对染料的亲和力也不一样，因此，染色后各种细胞呈现出各自的染色特点。
2.试剂的配制：
2.1 瑞氏染液的配制：
2.1.1 自配染液:瑞氏染粉0.1g，甲醇（AR）60ml。
将瑞氏染粉放入清洁干燥研钵中，先加少量甲醇，充分研磨使染料溶解，将巳溶解的染料倒入棕色试剂瓶中，未溶解的再加少量甲醇研磨，直至染料完全溶解，甲醇全部用完为止。
染液配好后放于室温下，一周后即可使用。
新配制染液效果较差，放置时间延长，染色效果越好。
久置应密封，以免甲醇挥发或氧化成甲酸。
染液中也可加中性甘油2～3ml，除可防止甲醇过早挥发外，也可使细胞着色清晰。
2.1.2 成品瑞氏染液:
现巳有成品瑞氏染液，如四川迈克科技公司出的快速瑞氏染色试剂（500ml/瓶）其只需室温密闭储存，可长期稳定，染色效果好。
2.2 缓冲液的配制: 称取磷酸二氢钾（无水）0.3 g，磷酸氢二钠（无水）0.2 g；加蒸馏水至1000 ml使其溶解。
配好后磷酸盐缓冲溶液应校正PH值，其范围在PH6.4～6.8即可，后塞紧瓶口备用。
3. 瑞氏染色的使用方法：
（以血涂片为例）：
3.1把制好的血涂片编好号，然后将血片平放在染色架上；
3.2加瑞氏染液数滴，使其覆盖整个血膜，固定细胞约1分钟；
3.3滴加等量或稍多的缓冲液（可按1：2滴加），使染液充分混匀，染色5～10分钟；
3.4用流水冲洗去染液,待干后镜检。
4.染色结果判断：在正常情况下，血膜外观染成淡紫红色。
显微镜下，红细胞呈粉红色，在厚薄均匀处，略有碟状感。
白细胞浆中颗粒清楚，并显示出各种细胞特有的色彩。
细胞核染紫红色，核染色质结构清楚。
5.注意事项:
5.1 PH对细胞染色有影响。
由于细胞中各种蛋白均为两性电解质，所带电荷随溶液PH而定。
对某一蛋白质而言，如环境PH<PI（蛋白质的等电点），则该蛋白质带正电荷，即在酸性环境中正电荷增多，易与酸性伊红结合，染色偏红；相反，则易与美蓝天青结合，染色偏蓝。
为此，应使用清洁中性的玻璃片，稀释液必须用PH
6.4～6.8的确良缓冲液。
冲洗玻片必须用流水。
5.2未干透的血膜不能染色，否则染色时血膜易脱落。
5.3 染色时间与染液浓度、染色温度成反比；而与细胞数量成正比。
5.4 冲洗时不能先倒掉染液，应用流水冲去，以防染料沉淀在血膜上。
5.5 如血膜上有染料颗粒沉积，可加少许甲醇溶解，但需立即用水冲洗掉甲醇，以免脱色。
5.6 染色过淡，可以复染。
复染时应先加缓冲液，创造良好的染色环境，而后加染液，或加染液与缓冲液的混合液，不可先加染液。
5.7 染色过深可用水冲洗或浸泡水中一定时间，也可用甲醇脱色。
5.8 染色偏酸或偏碱时，均应更换缓冲液再重染。