9第二章凝胶色谱法
凝胶色谱法
凝胶色谱法添加摘要凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。
凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。
凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。
目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。
凝胶色谱法-分类根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC ）和凝胶渗透色谱（GPC ）。
凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。
凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。
凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。
近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。
化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。
凝胶渗透色谱技术原理凝胶色谱法-分子筛效益一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。
大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。
小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这Array种现象叫分子筛效应。
凝胶色谱法分离原理
凝胶色谱法分离原理
在凝胶色谱法中，样品溶液滴加在凝胶柱中，随后样品分子将自由扩散进入凝胶基质内，形成一定的扩散层。
扩散层内的样品分子将受到凝胶基质的孔道大小限制，较大分子会较快地被孔道阻断，无法进一步扩散，而较小的分子则能较容易地扩散到较深的凝胶基质内。
由于扩散系数和凝胶孔道大小的关系，不同分子尺寸的物质在固定时间内扩散距离不同。
因此，通过调节色谱柱的选择性和操作条件，可以分离目标样品和其他杂质。
凝胶色谱法还可通过改变溶剂系统中的组分来调节管柱内的溶剂力和吸附条件，以改变物质在凝胶色谱柱中的保留时间。
例如，可以通过改变聚丙烯酰胺凝胶中的丙烯酰胺浓度来调节凝胶孔道的大小，从而实现对特定分子尺寸的选择性分离。
此外，凝胶色谱法还可以根据分子的电荷性质进行分离。
例如，对于蛋白质的分离，可以使用聚丙烯酰胺凝胶和SDS-聚丙烯酰胺凝胶。
在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，SDS（阴离子型表面活性剂）可以使蛋白质分子全部带上负电荷，从而根据其电荷大小进行分离。
总的来说，凝胶色谱法的分离原理是基于样品分子在凝胶柱中的扩散和滤过作用，通过调节凝胶孔道大小、溶剂组分和电荷性质等因素，可以实现对分子尺寸和性质的选择性分离。
凝胶色谱法在分析和纯化生物大分子方面具有广泛应用，并且可与其他技术相结合，如质谱联用、核酸测序等。
凝胶色谱法的原理和目的
凝胶色谱法的原理和目的
凝胶色谱法是一种分离和分析生物大分子的常用方法，其原理是利用凝胶（如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶）作为固定相，通过分子在凝胶中的大小和形状差异，使样品分子在凝胶中以不同的速率进行迁移，从而实现分离。
目的是通过凝胶色谱法可以实现以下几个目标：
1. 分离和纯化目标分子：凝胶色谱法可以将混合的生物大分子混合物分离成单一的成分，从而实现对目标分子的纯化。
2. 获得目标分子的大小和形状信息：不同大小和形状的分子在凝胶中的迁移速率不同，通过测定其迁移距离或迁移时间，可以获得目标分子的大小和形状信息。
3. 分析样品中不同组分的含量和相对分子量：通过凝胶色谱法可以定量分析样品中不同组分的含量，并通过与已知相对分子量的标准物质进行比较，可以得到目标分子的相对分子量。
总之，凝胶色谱法是一种用于分离和分析生物大分子的常用方法，既可以用于纯化目标分子，又可以获得目标分子的大小、形状以及相对分子量等信息。
凝胶色谱法要点
简介 凝胶色谱技术是上世纪六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，对高分子物质有很好的分离效果。
在生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域被广泛采用，工业生产上也有非常广泛的应用。
一、分离原理 一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。
大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。
小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。
具有多孔的凝胶就是分子筛。
各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。
分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。
两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。
直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。
如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。
因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。
综上所述，在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。
大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。
对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。
凝胶色谱法
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1.原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决
于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。
2. SDS作用机理:
SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成 的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链， 因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各 种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷 的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩 盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完 全取决于分子的大小。
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用SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质 分子量的方法
使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋 白质的分子量时，可选用一组已知分子量 的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子 量的标准蛋白的电泳区带位置，可以测定 未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、 次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出 售。
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2.原理①：许多重要的生物大分子，如多肽、
核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下， 这些基团会带上正电或负电。 ②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所 带电荷相反的电极移动。 ③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的 差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电 分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种 分子的分离。
维持PH基本不变。
2.缓冲溶液的通配常制由:1－2 种缓冲剂溶解于水
中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不 同PH范围内使用的缓冲液。
3. 在本课题中使用的缓冲液是:磷酸缓冲液, 成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠
如何证明凝胶色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？
.8Βιβλιοθήκη （三） 电泳：1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。
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凝胶渗透色谱
凝胶渗透色谱目录一、基本原理 (2)1.1 凝胶的特性 (2)1.2 色谱的分离原理 (3)1.3 凝胶渗透色谱在分离技术中的应用 (5)二、仪器设备 (6)2.1 凝胶渗透色谱仪的主要组成部分 (7)2.2 主要性能指标及选择 (9)2.3 仪器设备的清洁与维护 (9)三、样品前处理 (11)3.1 样品的选择与制备 (11)3.2 样品浓缩与净化 (12)3.3 样品检测方法的建立 (13)四、实验操作流程 (14)4.1 样品进样 (16)4.2 柱塞泵的设置与调节 (17)4.3 检测器的选择与校准 (18)4.4 数据处理与结果分析 (19)五、理论基础与数学模型 (20)5.1 凝胶渗透色谱的理论基础 (22)5.2 数学模型在凝胶渗透色谱中的应用 (23)5.3 实验数据的解释与处理 (24)六、应用领域 (26)6.1 在化学领域中的应用 (28)6.2 在生物医学领域中的应用 (29)6.3 在环境科学领域中的应用 (30)七、常见问题与解决方案 (31)7.1 常见问题及原因分析 (32)7.2 预防措施与解决策略 (33)八、实验安全与防护 (34)8.1 实验室安全规程 (36)8.2 个人防护装备的使用 (37)8.3 应急处理措施 (38)九、最新研究进展 (39)9.1 新型凝胶材料的研究与应用 (40)9.2 色谱技术的创新与发展 (41)9.3 聚合物凝胶渗透色谱法的探索 (43)一、基本原理它的基本原理是利用具有不同孔径大小的多孔凝胶颗粒作为固定相，将待分离的混合物通过凝胶柱进行分离。
在色谱过程中，待分离的混合物会与凝胶颗粒发生相互作用，从而导致不同成分在凝胶颗粒之间的分配系数和扩散速率的差异。
根据这些差异，混合物中的各个成分可以通过不同的时间顺序依次通过凝胶柱，从而实现对混合物中各组分的高效分离。
GPC的关键参数包括：凝胶颗粒的大小和形状；溶液流速；压力；洗脱剂的选择和浓度。
凝胶渗透色谱法
凝胶渗透色谱法（GPC）一、凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱Gel Permeation Chromatography（GPC)，一种新型的液体色谱，原理是利用高分子溶液通过一个装填凝胶的柱子，在柱子中按分子大小进行分离。
柱子为玻璃柱或金属柱，内填装有交联度很高的球形凝胶。
其中的凝胶类型有很多，都是根据具体的要求而确定（常用的有聚苯乙烯凝胶）。
然而，无论哪一种填料，他们都有一个共同点，就是球形凝胶本身都有很多按一定分布的大小不同的孔洞（见图1）。
图1 GPC分离原理不仅可用于小分子物质的分离与鉴定，而且可作为用来分析化学性质相同但分子体积不同的高分子同系物。
可以快速、自动测定高聚物的平均分子量及分子量分布。
现阶段，已经成为最为重要的测定聚合物的分子量与分子量分布的方法。
二、测定原理凝胶色谱法的固定相采用凝胶状多孔性填充剂，是根据样品中各种分子流体力学提及的不同进行分离的。
比凝胶孔径大的分子完全不能进入孔内，随流动相沿凝胶颗粒间流出柱外，而娇小的分子则可或多或少地进入孔内。
因此大分子流程短，保留值小；小分子流程长，保留值大，所以凝胶色谱是按分子流体力学体积的大小，从大到小顺序进行分离的。
（见图2）图2 GPC淋出曲线溶质分子的体积越小，其淋出体积越大，这种解释不考虑溶质与载体间的吸附效应以及溶质在流动相和固定相中的分配效应，其淋出体积仅仅由溶质分子的尺寸和载体的孔径尺寸决定，分离完全是由于体积排除效应所致。
凝胶色谱的特点是样品的保留体积不会超出色谱柱中溶剂的总量，因为保留值的范围是可以推测的，这样可以每隔一定时间连续进样而不会造成谱峰的重叠，提高了仪器的使用率。
三、分子量校正曲线（LogM-V曲线）凝胶色谱图计算样品的分子量分布的关键是把凝胶色谱曲线中的淋洗体积V转化成分子量M，这种分子量的对数值与淋洗体积之间的曲线(LogM-V)称之为分子量校正曲线（见图3）。
图3 分子量校正(LogM-V)曲线➢排阻极限排阻极限是指不能进入凝胶颗粒空穴内部的最小分子的分子量。
凝胶色谱法的原理高中生物
凝胶色谱法的原理高中生物什么是凝胶色谱法？凝胶色谱法是一种常用于生物分子分离与分析的实验技术。
它基于不同组分在凝胶基质内的迁移速率差异，利用凝胶作为分离介质，通过色谱柱将混合物中的不同成分分离出来。
凝胶色谱法的原理凝胶色谱法的分离原理基于分子在凝胶基质中的迁移速率差异。
凝胶是一种多孔的材料，分子可以通过孔隙进入凝胶内部，并在凝胶中扩散。
不同大小、形状及电荷的分子由于其与凝胶相互作用的力不同，会表现出不同的迁移速率。
通常，凝胶色谱法使用分子量作为分离依据，在实验中，较大分子会在凝胶中扩散的速度相对较慢，而较小分子则扩散得更快。
这样，当混合物在色谱柱中通过凝胶时，不同大小的分子将被逐渐分离出来，形成不同的峰。
凝胶色谱法的应用凝胶色谱法在许多生物分析和研究领域中得到广泛应用。
以下是几个常见的应用示例：•蛋白质分离：凝胶色谱法可用于分离不同大小和电荷的蛋白质，有助于研究蛋白质的结构和功能。
•核酸分析：凝胶色谱法可用于分离DNA或RNA的片段，用于基因测序、突变检测等。
•糖类分析：凝胶色谱法可用于分离和分析不同种类和结构的糖类。
•药物分析：凝胶色谱法可用于药物代谢产物的分离和分析，以及药物纯度的检测。
凝胶色谱法的优缺点优点：•简单易操作，成本较低。
•适用于各种样品类型，包括蛋白质、核酸等。
•可实现高分辨率的分离。
缺点：•分离速度较慢。
•对样品的要求较高，一些复杂样品可能需要额外的预处理。
•无法直接得到纯度较高的单一成分。
结语凝胶色谱法作为一种常用的生物分析技术，广泛应用于科研和实验室中。
通过了解凝胶色谱法的原理和应用，我们可以更好地理解生物分子的特性，并且在生物学研究中起到重要的分离和分析作用。
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• 最常用的是葡聚糖凝胶。
• （一）、葡聚糖凝胶的结构与性质 • 葡聚糖凝胶又称交链葡聚糖凝胶， 是由葡聚糖（右旋糖酐）和甘油基通 过醚桥键相交链而成的多孔性状结构 。
• 甘油基为交联剂，交联剂在原料中所 占的重量百分比称交联度。 • 交联度越大，网状结构越紧密，网孔 越小，吸水量越少吸水后体积膨胀越 小，可用于分离小分子物质。
•
（简称HPLC）是在经典的液相色 谱基础上发展起来的一种快速分析 技术。它是以高压泵输送的液体为 流动相的色谱法。使用仪器为液相 色谱仪。
高效液相色谱仪
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• 七、其他色谱法
• （一）、气相色谱法 • 是以气体作为流动相的一种色谱方 法（GC）。 • 根据流动相与固定相的状态可分为： • 气—固色谱 • 气—液色谱两种， • 以气—液分配色谱应用最广。本法使 用的仪器为气相色谱仪。
气相色谱仪
气相色谱仪测茶叶中的噻嗪酮
（二）、高效液相色谱法
甘油基
（二）、分离原理
将凝胶颗粒在适宜的溶剂中浸泡使其充分吸液 膨胀，然后装入色谱柱中，加入样品后，用同一 溶剂洗脱。由于凝胶颗粒膨胀所形成的骨架呈网 孔状，小分子成分能自由扩散进入这些网孔内， 而大分子成分不能进入网孔而随溶液顺凝胶间隙 迁移，其速度比小分子成分快，使分子大小不同 的成分先后顺序流出色谱柱， • 从而将分子大小不同的物质分离。