第18章-生殖毒性研究
苯并[a]芘对生殖系统的毒性作用及其机制研究进展
![苯并[a]芘对生殖系统的毒性作用及其机制研究进展](https://img.taocdn.com/s3/m/9f44d8af760bf78a6529647d27284b73f24236e5.png)
生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第19卷第2期2024年4月V ol.19,No.2Apr.2024㊀㊀基金项目:国家自然科学基金项目(31960154);中央引导地方科技发展资金项目(2023ZY0004);内蒙古自治区 草原英才 工程青年创新创业人才项目(Q2022085);内蒙古自治区高等学校科学研究项目(NJZZ23017);内蒙古自治区自然科学基金项目(2023QN03047);内蒙古医科大学面上项目(YKD2022MS033)㊀㊀第一作者:王惠增(1997 ),女,硕士研究生,研究方向为生殖毒理㊁分子诊断,E -mail:******************* ㊀㊀*通信作者(Corresponding author ),E -mail:*********************.cnDOI:10.7524/AJE.1673-5897.20230413002王惠增,刘秉春,陈红,等.苯并[a]芘对生殖系统的毒性作用及其机制研究进展[J].生态毒理学报,2024,19(2):165-183Wang H Z,Liu B C,Chen H,et al.Research progress on toxic effects of benzo(a)pyrene on reproductive system and its mechanism [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2024,19(2):165-183(in Chinese)苯并[a ]芘对生殖系统的毒性作用及其机制研究进展王惠增1,刘秉春2,陈红1,徐沛欣1,郭鑫1,袁建龙1,*1.内蒙古医科大学附属医院检验科,呼和浩特0100502.内蒙古医科大学附属医院干细胞实验室/内蒙古自治区肿瘤细胞基因检测应用与研究工程实验室,呼和浩特010050收稿日期:2023-04-13㊀㊀录用日期:2023-11-02摘要:苯并[a]芘(benzo(a)pyrene,BaP)作为多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)的成员,是最早发现也是最具有代表性的环境污染物,通过空气㊁食物㊁水源等途径进入人体,引起细胞氧化应激损伤㊁DNA 损伤和基因异常表达导致细胞死亡㊂研究表明雄性与雌性动物经BaP 染毒后,其生殖器官㊁生殖细胞甚至激素水平均会受到影响,进而影响受精卵形成和胚胎发育,造成不良妊娠结局㊂因此,近年来BaP 的生殖毒性受到广泛关注,其作用机制包括改变胞内活性氧水平㊁诱导细胞DNA 损伤以及调控生殖发育相关基因㊁类固醇合成相关基因和促凋亡基因影响生殖发育㊂BaP 作为环境毒物,不仅可以影响生态环境的稳定性,还可以影响生物的生殖发育,损害生态环境中的物种多样性,从长远来看,BaP 的不良影响不但会威胁到陆地与海洋生物种群的稳定,还会破坏陆地和海洋生态系统的功能㊂本文将从生殖健康㊁配子与合子形成以及胚胎发育的角度,详细阐述BaP 染毒对生殖系统的毒性作用与机制,为预防BaP 引起的生殖危害㊁减少不良妊娠结局提供理论依据,旨在为BaP 的环境毒性行为和对生物的毒性研究提供有效借鉴,为合理预防和缓解因接触BaP 等环境毒物而带来的健康影响提供参考㊂关键词:苯并[a]芘(BaP);生殖细胞;生殖毒性;生殖器官;激素;细胞毒性文章编号:1673-5897(2024)2-165-19㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:AResearch Progress on Toxic Effects of Benzo (a )pyrene on Reproductive System and Its MechanismWang Huizeng 1,Liu Bingchun 2,Chen Hong 1,Xu Peixin 1,Guo Xin 1,Yuan Jianlong 1,*1.Department of Laboratory Medicine,The Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010050,China2.Stem Cell Research Center,The Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University/Inner Mongolia Autonomous Region Tumor Cell Gene Detection Application and Research Engineering Laboratory,Hohhot 010050,ChinaReceived 13April 2023㊀㊀accepted 2November 2023Abstract :Benzo(a)pyrene (BaP),as a member of the polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs),is the earliest dis -covered and most representative environmental pollutant.It enters the human body through the air,food,and water,causing cellular oxidative stress damage,DNA damage,and abnormal gene expression,leading to cell death.Studies have shown that when male and female animals are exposed to BaP,their reproductive organs,cells,and hormone166㊀生态毒理学报第19卷levels are affected,which in turn will affect the formation of fertilized eggs and embryonic development,resulting in adverse pregnancy outcomes.Hence,the reproductive toxicity of BaP has received more attention in recent years.Its mechanism of action on reproductive development includes alteration of intracellular reactive oxygen species levels,induction of cellular DNA damage,and modulation of genetic changes related to reproductive development,steroid synthesis and pro-apoptosis.BaP,as an environmental toxicant,could influence the stability of the ecological environment,the reproductive development of organisms and destroy the diversity of species in the ecosystems.In this review,we will detailly elaborate on the toxic effects and mechanisms of BaP on the reproductive system,and provide a theoretical evidence for prevention reproductive harm caused by BaP and the reduction of adverse pregnancy outcomes,with the aim to providing an effective reference for the study of BaP s toxicity to the environment and organisms,and for the rational prevention and mitigation of the health effects of exposure to BaP or other environmental toxins.Keywords:benzo(a)pyrene;germ cell;reproductive toxicity;genital organ;hormone;cytotoxicity㊀㊀PAHs是由2个或2个以上的稠环芳烃组成的有机化合物[1],由于其化学性质稳定且具有疏水性[2],因此多环芳烃可以在环境中稳定存在,是常见的环境污染物,广泛存在于油炸烧烤食物㊁香烟烟雾[3]㊁汽车尾气[4]㊁煤炭燃烧[5]等中㊂人类可以通过空气㊁饮用水㊁食物等不同方式暴露于多环芳烃[6]㊂此外,多环芳烃的亲脂性有利于它们在水生生物的脂肪中积累[7],并随着食物链进入人体,对人类健康产生威胁㊂BaP是多环芳烃中最具有代表性也是毒性最大的致癌物[8],可以诱发肺癌[9]㊁乳腺癌[10]等癌症,危害人类健康㊂BaP广泛存在于人类生活环境中,2019年公布的美国毒物和疾病登记机构物质优先清单中,BaP被列为第8名,在污染的空气[11]㊁土壤[12]㊁水源[13]㊁食物[14]中均可以检测到BaP㊂近年来,越来越多研究表明BaP与胚胎畸形[15]和不良妊娠[16]有着密切的联系㊂在妊娠早期暴露于BaP会导致小鼠胎儿畸形率增高[17]㊂此外,一项病例对照研究表明,接触BaP与早孕流产之间存在联系,妊娠女性发生流产的风险与血中BaP-DNA加合物的浓度成正比,这进一步说明BaP除了致癌性也具有生殖毒性㊂目前对于BaP的研究多聚焦于其诱发癌症[18-19]尤其是肺癌[20]这一方面,虽有研究表明BaP 具有生殖毒性,其生殖毒性机理尚未研究透彻㊂本综述的目的是总结BaP生殖毒性相关文章,讨论BaP导致生殖毒性的潜在分子机制㊂1㊀BaP在生殖方面的主要致毒途径(The main toxic pathway of BaP in reproduction)近些年研究发现,BaP发挥其致毒作用主要有3种途径:(1)通过氧化应激影响细胞正常代谢;(2)BaP可以与DNA形成加合物,进而导致DNA损伤;(3)BaP可以通过调控基因表达,发挥其毒性作用㊂BaP致毒途径是多种机制相辅相成㊂由于生殖对繁育后代具有重要意义,因此研究BaP的生殖毒性已成为科学家们的研究重点,下文将重点总结BaP的生殖毒性机制㊂1.1㊀氧化应激(Oxidative stress)BaP进入细胞后,通过AHR途径诱导细胞发生氧化应激反应,其主要过程为:BaP刺激细胞质中的一种转录因子 芳香族化合物受体(aryl hydrocar-bon receptor,AHR)[21],使其转入到细胞核后,再与芳香族化合物受体核转运蛋白(aryl hydrocarbon recep-tor nuclear transporter,ARNT)结合形成异二聚体[22],结合在下游靶基因上,激活细胞色素P450目标基因的异常表达,包括细胞色素P4501A1(cytochrome P450family1subfamily A member1,CYP1A1)㊁细胞色素P4501A1(cytochrome P450family1subfamily A member2,CYP1A2)㊁细胞色素P4501B1(cyto-chrome P450family1subfamily B member1, CYP1B1)[21,23],进而引起细胞产生大量活性氧(reac-tive oxygen species,ROS),使机体发生氧化应激反应,如果体内的活性氧产生过多,超出了细胞的清除能力,会影响细胞的正常代谢甚至会破坏细胞结构㊂低㊁高剂量的BaP均可导致小鼠卵母细胞功能障碍,降低精卵结合与融合率,这与线粒体ROS水平增加和卵膜脂质过氧化密切相关[24]㊂Zhang等[25]发现BaP可以削弱雌鼠的繁殖能力,通过增加雌鼠卵母细胞中ROS,扰乱纺锤体组装,染色体配对,阻滞卵母细胞减数分裂过程㊂BaP诱导的氧化应激不仅仅通过产生ROS这一条途径,还可以通过降低过氧第2期王惠增等:苯并[a]芘对生殖系统的毒性作用及其机制研究进展167㊀化氢酶(catalase,CAT)㊁抗坏血酸过氧化物酶(ascor-bate peroxidase,AP)㊁谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)㊁超氧化物歧化酶(superoxide dis-mutase,SOD)㊁谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase, GR)等抗氧化酶的活性[26-27]以及促进炎症细胞因子表达[28]导致氧化应激的发生,最终引起细胞功能受损㊂1.2㊀BPDE引起DNA损伤(BPDE induces DNA damage)BaP进入体内经过一系列氧化代谢反应,生成二羟环氧苯并[a]芘(BaP-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide, BPDE),进而发挥其毒性,Penning[29]认为生成BPDE 的主要途径是在细胞色素P450酶的催化下,BaP末端的苯环上发生单加氧化反应,生成BaP-7,8-环氧化物(BaP-7,8epoxide),在环氧化物水解酶作用下转化为BaP-7,8-二氢二醇(BaP-7,8diol),该过程循环往复最终形成致癌物 BPDE[30-32]㊂BPDE可以与DNA共价结合形成加合物,造成DNA损伤㊂Shiizaki等[33]提出一个关于BaP-DNA加合物成因的假设,即CYP1A1是BaP被激活形成BPDE反应中的关键酶,这与Bukowska等[32]提出的观点一致㊂Einaudi等[34]通过建立BaP染毒的雌性小鼠模型,发现BaP可以导致卵母细胞与卵丘细胞DNA损伤,并且他们认为导致DNA断裂的主要原因是由于细胞中的修复机制对BPDE-DNA加合物切除和修复导致的㊂Zhan等[35]研究表明BaP形成的DNA加合物可以干扰DNA复制,进一步引起胚胎的DNA损伤,影响胚胎的发育㊂Zhan等[35]进一步研究发现DNA加合物与ROS共同造成基因组严重损伤,还可以引起卵裂球的端粒功能障碍,最终引起胚胎的异常㊂Miao等[36]发现BaP会引起猪卵母细胞纺锤体组装缺陷进一步引起减数分裂停滞,而导致这一结果的原因可能是DNA加合物引起的㊂Zhang 等[25]将小鼠卵母细胞暴露于BaP后,发现纺锤体的组装㊁染色体的排列和着丝点-微管附着均被破坏,这可能与DNA加合物的形成有关联,与Miao的设想一致㊂1.3㊀基因表达调控(Regulation of gene expression)基因表达调控是生物学研究的重要内容之一,在细胞分化发育的不同时期,基因表达的种类和强度各不相同,共同决定着细胞的形态与功能;细胞为了适应环境变化改变自身的基因表达有利于生存,因而基因表达调控十分重要㊂海洋污染问题日趋严重,BaP具有水生生物生殖毒性,是造成海洋污染的重要原因之一,受到广泛关注㊂有研究发现BaP生殖毒性的潜在分子机制是通过调控相关基因表达㊂数字基因表达技术表明BaP对雄性栉孔扇贝睾丸中的生殖基因有影响,其中热休克蛋白90㊁细胞色素P4503A㊁凋亡抑制蛋白3个基因的改变会引起睾丸组织损伤,此外BaP与性激素合成和睾丸发育相关基因有密切联系[37]㊂Albornoz-Abud等[38]研究表明苯并芘可以通过调控GH/IGF轴发挥其生殖毒性,急性暴露于BaP会导致尼罗罗非鱼睾丸中内分泌相关基因:胰岛素样生长因子1(insulin-likegrowth factor1,IGF1)和生长激素受体基因1(growth hormone receptor1,GHR1)基因表达降低,并造成发育问题㊂BaP通过基因调控引起的生殖毒性不仅仅在海洋生物中体现,陆地生物也同样受这一机制调控㊂BaP通过影响父本基因,最终影响胚胎发育㊂用BaP染毒的雄性小鼠进行体外受精后,发现在8-细胞期和囊胚期存在基因表达异常,包括调控细胞周期以及DNA修复的基因[39]㊂妊娠黄体可以分泌雌孕激素,在生殖系统中发挥重要作用,黄体的发育与血管内皮生成因子有着密切联系[40]㊂苯并芘可以使血管内皮生成因子相关基因,如血管生成素-1(an-giopoietin-1,Ang-1)㊁血管内皮细胞生长因子受体(vascular endothelial growth factor,VEGFR)㊁内皮细胞TEK酪氨酸激酶表达下调,并增加抗血管生成因子血小板反应蛋白(recombinant thrombospondin1, THBS1)的表达,还影响了对黄体血管系统建立至关重要的基因Notch1㊁DLL4㊁Jag1和Hay2的表达,破坏了黄体血管网络系统的形成,最终影响了妊娠过程中黄体的内分泌功能[41]㊂综上所述,在3种BaP发挥致毒作用的机制中(图1),BaP诱导生殖发育相关基因表达异常或提高促凋亡基因表达起主导作用,也是目前研究较为透彻的机制(图2),下面将从雄性生殖㊁雌性生殖以及胚胎发育3个角度详述BaP的毒性机制㊂2㊀BaP的雄性生殖毒性(Male reproductive toxici-ty of BaP)2.1㊀BaP对雄性激素的毒性(Toxicity of BaP to an-drogens)BaP作为内分泌干扰物主要影响睾酮水平[42],睾酮主要是由睾丸间质细胞合成分泌的,其主要成分为类固醇㊂BaP可以降低睾酮的转化率[43]和(或)睾酮的浓度[44]㊂有研究表明睾丸巨噬细胞分泌的白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子α168㊀生态毒理学报第19卷(tumor necrosis factor α,TNF α)通过抑制类固醇生成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein,STAR)表达进一步抑制间质细胞合成睾酮[45]㊂Zheng 等[46]发现BaP 通过增加IL -1β的表达,显著抑制雄性大鼠睾酮的产生,他们还发现BaP 可以改变睾丸巨噬细胞亚群,激活ED2+睾丸巨噬细胞并促进了IL -1β的产生,最终抑制雄性大鼠睾酮合成㊂此外,3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehy -drogenase,3β-HSD)与细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶(cholesterol side -chain lyase P450scc,P450scc)在间质细胞合成睾酮中起着重要作用[47],其表达改变时会影响睾酮水平;STAR 表达的下调也可以导致睾酮合成减少[48-49]㊂雄性大鼠用BaP 灌胃90d 后,检测到BaP 下调间质细胞中的STAR ㊁3β-HSD 以及细胞色素P45017A1(cytochrome P450family 17subfamily A member 1,CYP17A1)表达,并上调P450scc 表达,进而降低大鼠睾丸间质细胞生成睾酮的能力[50]㊂Sheweita 等[51]发现BaP 降低类固醇合成酶CYP17A1和17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-hydroxysteroid dehydrogenase,17β-HSD)蛋白表达,使大鼠血浆睾酮浓度降低㊂Banerjee 等[52]进一步验证了BaP 通过抑制类固醇生成蛋白表达,如细胞色素P450ⅡA1(cytochrome P450family Ⅱsubfamily A member 1,CYP ⅡA1)㊁STAR ㊁3β-HSD ㊁17β-HSD ,进一步降低血清睾酮水平,2021年Daoud 等[53]再一次证实了上述观点㊂Yang 等[54]发现BaP 也可以通过影响3β-HSD ㊁CYP17和17β-HSD 表达进一步扰乱雄性栉孔扇贝的激素水平㊂Booc 等[55]研究发现BaP 可降低雄性底鳉的睾酮水平,与其他动物不同的是BaP 并非通过调控类固醇相关基因表达造成这一结果,而是可能通过精原细胞包囊大小进而影响睾酮水平㊂综上所述,BaP 主要通过改变类固醇生成相关基因与酶的表达,抑制睾酮的生成,对雄性的生殖发育产生不利影响㊂epoxide(BPDE)图1㊀BaP 致毒途径机制注:AHR 表示芳香族化合物受体,ARNT 表示芳香族化合物受体核转运蛋白,HSP90表示热休克蛋白90,CYP450表示细胞色素P450,CYP17A1表示细胞色素P45017A1,STAR 表示类固醇生成急性调节蛋白,3β-HSD 表示3β-羟基类固醇脱氢酶,17β-HSD 表示17β-羟基类固醇脱氢酶,Caspase -3表示半胱氨酸蛋白酶-3,Caspase -9表示半胱氨酸蛋白酶-9,Bax 表示Bcl -2相关X 蛋白㊂Fig.1㊀Mechanism of BaP toxicity pathwayNote:AHR represents aryl hydrocarbon receptor,ARNT represents aryl hydrocarbon receptor nuclear transporter,HSP90represents heat shock protein 90,CYP450represents cytochrome P450family,CYP17A1represents cytochrome P450family 17subfamily A member 1,STAR represents steroidogenic acute regulatory protein,3β-HSD represents 3β-hydroxysteroid dehydrogenase,17β-HSD represents 17β-hydroxysteroid dehydrogenase,and Bax represents Bcl -2associated X protein.第2期王惠增等:苯并[a]芘对生殖系统的毒性作用及其机制研究进展169㊀图2㊀BaP通过基因调控引起生殖毒性注:GnRH2表示促性腺激素释放激素,GnRH3表示促性腺激素释放激素,IL-1β表示白介素1β,CYP17A1表示细胞色素P45017A1,STAR表示类固醇生成急性调节蛋白,3β-HSD表示3β-羟基类固醇脱氢酶,17β-HSD表示17β-羟基类固醇脱氢酶,CYP1A1代表细胞色素P4501A1, P450scc代表细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶,Adcy-PKA代表上游腺苷环化酶-蛋白激酶,Caspase-3表示半胱氨酸蛋白酶-3,Caspase-9表示半胱氨酸蛋白酶-9,Bax表示Bcl-2相关X蛋白,Hsp90aB1代表90kDa热休克蛋白aB1,VTG代表卵黄蛋白原,CD34代表分化簇34, AMH代表抗缪勒管激素,CCND2代表细胞周期蛋白D2,FOXO1代表叉头框蛋白O1,HoxA10代表同源盒基因,BMP2代表骨形态发生蛋白-2,IBA1代表离子钙结合衔接分子1,SNCA代表重组人α-突触核蛋白,CYP19a代表细胞色素P450家族19亚家族a㊂Fig.2㊀BaP causes reproductive toxicity through gene regulationNote:GnRH2represents gonadotropin-releasing hormone2,GnRH3represents gonadotropin-releasing hormone3,IL-1βrepresents interleukin-1β, CYP17A1represents cytochrome P450family17subfamily A member1,STAR represents steroidogenic acute regulatory protein,3β-HSD represents3β-hydroxysteroid dehydrogenase,17β-HSD represents17β-hydroxysteroid dehydrogenase,CYP1A1represents cytochrome P450family1subfamily A member1,P450scc represents cholesterol side-chain lyase P450scc,Adcy-PKA represents adenylate cyclase-protein kinase,Bax represents Bcl-2associated X protein,Hsp90aB1represents recombinant heat shock protein90kDa alpha B1, VTG represents vitellogenin,CD34represents cluster designation34,AMH represents anti-Müllerian hormone, CCND2represents cyclin-D2,FOXO1represents forkhead box O1,HoxA10represents homeobox A10,BMP2represents bone morphogenetic protein-2,IBA1represents ionized calcium-binding adapter molecule1,SNCA representsrecombinant human alpha-synuclein,CYP19a represents cytochrome P450family19subfamily a.2.2㊀BaP对精子的毒性(Toxicity of BaP to sperm) 2.2.1㊀BaP减少精子生成(BaP reduces spermato-genesis)哺乳动物雄性生殖器官主要有睾丸㊁附睾㊁输精管等,其中睾丸的主要作用是生成精子和产生雄性激素,BaP主要通过损害睾丸进一步影响精子生成㊂BaP通过氧化应激或基因调控介导睾丸细胞凋亡,影响睾丸功能受损,减少精子数量㊂Banerjee等[52]证实BaP激活P38蛋白激酶(P38mitogen activated protein kinase,P38MAPK)通路来增加睾丸细胞内ROS,并降低细胞中的抗氧化酶活性[56],使睾丸细胞氧化应激损伤,减少精子的生成㊂Sheweita等[51]研究发现BaP通过降低睾丸组织中抗氧化酶CAT㊁SOD㊁GPX的活性,增加ROS水平,导致睾丸细胞线粒体膜破裂,进而引起睾丸组织凋亡㊂BaP还可通过AHR途径降低睾丸中CAT㊁SOD活性,升高H2O2含量,诱导睾丸细胞氧化应激,影响睾丸功能[57]㊂上述均为BaP对小鼠的生殖毒性,Tian等[58]发现BaP通过可引起雄性栉孔扇贝精巢氧化应激损伤,进一步减少精子生成㊂此外,BaP可以通过基因调控诱导睾丸细胞凋亡,提高睾丸细胞内的凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和半胱氨酸蛋白170㊀生态毒理学报第19卷酶-9(Caspase-9)表达;促进细胞色素C转位到细胞质,启动线粒体凋亡途径,导致睾丸细胞凋亡,进一步导致精子生成减少[52,59]㊂BaP不仅通过影响睾丸功能减少精子生成,而且可以直接影响精子生成过程㊂Verhofstad等[60]的研究表明在精子发育各个阶段均可以检测到BPDE 导致的精子DNA损伤,这也是精子数量减少的原因之一㊂BaP可以导致雄鼠精子功能缺陷以及生育能力下降,并且Mohamed等[61]的实验证明了BaP的生殖毒性具有遗传性,但毒性随着子代数增加逐渐减弱㊂BaP可以减少精母细胞和次级精母细胞进入中晚期粗线期,阻止减数分裂过程的完成,导致精子生成减少[62]㊂此外,BaP诱导的氧化应激会降低精原细胞的存活率,并且通过下调基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)水平以及上调促凋亡因子Caspase-3和Caspase-9表达促进精原细胞凋亡[63]㊂BaP作为广泛存在于生态系统中的环境污染物,不仅使陆地雄性动物精子生成异常,还影响水生生态系统中的雄性动物的精子生成㊂BaP可以通过基因调控扰乱雄性栉孔扇贝的精子发生相关基因:细胞周期蛋白D2(cyclin-D2,CCND2),联会复合体3㊁核呼吸因子1和水通道蛋白9,进一步减少精子生成[54]㊂斑马鱼胚胎暴露于BaP后,其睾丸中生殖细胞特异基因的启动子发生甲基化上调,进一步下调相关基因表达,最终抑制精子生成,影响雄性斑马鱼的生殖能力[64]㊂2.2.2㊀BaP降低精子活力(BaP reduces sperm motility)BaP可以损害睾丸和附睾的内分泌功能,从而导致储存的精子活力下降[65-67]㊂睾丸的质量和大小与精子的数量和活力成正比[68],雄性小鼠用BaP连续灌胃60d,检测到小鼠的睾丸质量明显降低,精子的活力也随之降低[69]㊂小鼠暴露于BaP后,其睾丸支持细胞和间质细胞均凋亡,进而影响精子发生过程,最终导致精子活力减弱[69]㊂畸形精子的活力及存活率显著低于正常精子,BaP暴露会导致精子形态异常,畸形精子大幅增加,主要异常表现为无尾㊁双头㊁中段弯曲[57]㊂Xu等[59]验证了BaP可导致精子活动力降低,精子头㊁尾部畸形率以及总畸形率均显著升高㊂最新研究表明BaP改变睾丸激素水平引起雄性交配强度减弱,降低精子质量,引起畸形精子增多[70-71]㊂有研究表明精子短端粒可能是导致男性不育的原因之一[72],Ling等[73]研究发现BaP可以使精子端粒变短,且与剂量成反比㊂3㊀BaP的雌性生殖毒性(Female reproductive toxicity of BaP)3.1㊀BaP对雌性激素的毒性(Toxicity of BaP to es-trogen)BaP作为一种常见的环境污染物,是海洋环境污染原因之一,影响水生动物的繁殖㊂雌孕激素对雌性发育有不可或缺的作用,而BaP作为内分泌干扰物可以降低水生动物血浆中的孕酮㊁雌激素和催乳素浓度[74]㊂为进一步探究其发生机制,Tian等[58]用不同浓度的BaP处理雌性栉孔扇贝,发现BaP可以导致类固醇合成相关酶(3β-HSD㊁CYP17㊁17β-HSD)表达下降,并呈剂量依赖性;高浓度的BaP还可抑制AHR㊁ARNT㊁CYP1A1以及17β-雌二醇-雌激素受体转录,2种机制相辅相成,共同抑制雌孕激素的生成㊂BaP通过干扰激素膜受体降低三疣梭子蟹的雌二醇(estradiol,E2)浓度[75]㊂斑马鱼胚胎暴露于BaP会导致成年雌鱼卵巢中E2水平下降,其机制为雌鱼脑中促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)基因中的GnRH3的甲基化水平显著升高,并下调GnRH3mRNA表达,从而影响E2的产生[76]㊂与斑马鱼报道相反的是BaP可促进雌性海马GnRH2和GnRH3mRNA的表达,并导致血浆中E2水平显著下降[77]㊂2种相反结果可能与BaP的浓度㊁作用时间以及实验对象不同有关㊂Yang等[78]发现BaP抑制雌性栉孔扇贝的上游腺苷环化酶-蛋白激酶(adenylate cyclase-protein ki-nase,Adcy-PKA)信号通路,下调促性腺激素受体转录水平,如促卵泡激素受体(follicle-stimulating hor-mone receptor,FSHR)和黄体生成素/绒毛膜促性腺激素受体(luteinizing hormone/choriogonadotropin re-ceptor,LHCGR),导致类固醇生成酶(3β-HSD㊁CYP17㊁17β-HSD)表达减少,最终引起抗雌激素效应㊂Kennedy和Smyth[79]发现雌鲑鱼体内E2的减少并非是通过常规的BaP作用于类固醇机制,而是通过其他内分泌干扰机制来对抗雌激素的方式改变了血浆E2的浓度,这种机制有待进一步研究㊂综上所述,BaP主要通过基因表达调控这一途径降低雌性体内E2和孕酮水平,进而影响雌性的生殖发育㊂3.2㊀BaP对卵巢的毒性(Toxicity of BaP to ovary)卵巢是雌性生殖发育中最重要的生殖器官,具有排卵和内分泌功能,对维持雌性激素水平至关重要,暴露于BaP会扰乱卵巢的结构与功能,进一步第2期王惠增等:苯并[a]芘对生殖系统的毒性作用及其机制研究进展171㊀影响生育㊁妊娠㊂高剂量的BaP可以导致卵巢细胞退化并出现管状结构,而这些组织学变化属于癌前病变[80]㊂Rahmani等[81]发现BaP通过氧化应激导致卵巢表面上皮内陷㊁细胞堆积㊁管状结构形成,卵巢间质出现间质水肿㊁出血等病理学改变,并且BaP 诱导卵巢中Caspase-3表达升高,影响卵巢的生理功能,与睾丸相比,BaP对卵巢的危害更严重,这是因为在BaP处理后,胎儿卵巢中促细胞凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associated X protein,Bax)表达增加,并激活下游Caspase-3和Caspase-9,导致卵巢细胞凋亡[82]㊂卵黄蛋白原(vitellogenin,VTG)和CCND2是雌激素介导的卵巢发育相关基因[83],BaP可以下调VTG和CCND2表达,造成雌性栉孔扇贝卵巢受损,组织学检查发现,BaP可引起卵巢发育延迟和卵母细胞退化,并且卵巢的病变情况随着染毒时间和染毒剂量的增加而严重[78]㊂研究发现BaP可以抑制脂联素受体1(adiponectin receptor protein1,AdipoR1)和脂联素受体2(adiponectin receptor protein2,AdipoR2)表达,进而影响卵巢功能[84]㊂最新研究表明,BaP及其代谢产物BPDE可抑制妊娠小鼠卵巢中腺嘌呤核苷酸转运体1(adenine nucleotide translocator1,ANT1)的表达,进一步研究发现ANT1的过表达可以修复BPDE引起的有丝分裂缺陷,恢复卵巢功能[85]㊂3.3㊀BaP对雌性生殖细胞的毒性(Toxicity of BaP to female germ cells)3.3.1㊀BaP影响卵泡发生和发育(BaP affects folli-cular genesis and development)卵泡发育是女性正常的生理过程,卵泡的发育情况直接关系到后代繁殖㊂卵泡作为卵巢的功能单位,支持卵母细胞的发育和成熟[86]㊂卵泡的生长发育过程相当复杂,原始卵泡经历初级卵泡㊁窦前㊁窦卵泡才能发育为成熟卵泡[87-88]㊂有报道称BaP作为卵毒物质,可以破坏原始卵泡[89],或者使原始卵泡迅速枯竭[90],BaP还可以通过香烟烟雾进入卵泡液中,对卵泡发育产生不利影响[91]㊂Sobinoff等[24]研究了BaP卵毒性的机制,连续用BaP处理雌性小鼠7d会导致卵巢中的原始卵泡显著减少,卵泡闭锁,其具体机制为BaP通过干扰AHR发育信号破坏卵泡形成㊂有报道称BaP不仅可以减少或耗尽原始卵泡和初级卵泡的数量[89-90],还可以抑制卵泡生长发育,即BaP处理过的卵泡均发育不到窦前阶段[92]㊂Sadeu和Foster[93]将小鼠卵泡暴露于不同浓度的BaP,发现卵泡存活率均降低,其中高浓度的BaP会抑制窦卵泡发育,使卵泡停滞于窦前卵泡阶段,窦卵泡比例显著减少㊂抗缪勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)浓度增加与卵泡发育停滞有关[94-95]㊂有研究表明BaP可以通过减少AMH生成,促进卵泡募集到卵泡池中,最终加快卵泡枯竭的速度[96]㊂Sadeu和Foster[93]进一步探索了BaP诱导卵泡发育异常的关键分子途径,发现BaP暴露通过激活窦前㊁窦卵泡和成熟卵泡中AHR信号通路,进一步促进促凋亡因子Bax激活,此外,BaP暴露还会导致90kDa热休克蛋白aB1(recombinant heat shock protein90kDa alpha B1,Hsp90aB1)基因表达上调,导致卵泡生长延迟和存活率下降㊂卵泡生长和卵泡发育在雌性哺乳动物生殖中有着重要地位,BaP不但可以通过基因表达调控导致卵泡生长发育异常,还可能通过氧化应激影响卵泡发育㊂3.3.2㊀BaP影响卵母细胞功能(BaP affects oocyte function)BaP可使卵母细胞线粒体内ROS水平升高,导致精-卵结合和融合障碍,影响动物的繁殖[24,36]㊂BaP可导致卵母细胞和卵丘细胞DNA断裂,细胞功能障碍,影响卵母细胞进一步发育,精卵融合失败[34],这也是BaP生殖毒性机制之一㊂卵母细胞的减数分裂在卵母细胞成熟与成功受精中起着重要作用[97],BaP诱导卵母细胞减数分裂异常,卵母细胞功能障碍,不利于动物繁殖㊂BaP可以阻滞猪卵母细胞减数分裂,使部分卵母细胞停滞在MⅡ期,进一步检测发现BaP通过降低乙酰化α-微管蛋白,导致微管不稳定,损害纺锤体组装,从而干扰卵母细胞减数分裂过程[36]㊂Sui等[98]通过将雌鼠暴露于BaP检测其对子代的影响,验证了BaP对卵母细胞的遗传毒性:生发泡破裂(germinal vesicle breakdown, GVBD)是卵母细胞成熟的关键事件,母体暴露BaP 会降低子代GVBD率[99];并且BaP会扰乱子代卵母细胞的纺锤体组装和染色体配对,使卵母细胞减数分裂停滞;最后,雌鼠暴露于BaP可导致子代卵母细胞基因组高甲基化,损害卵母细胞的发育能力㊂综上所述,母系BaP暴露损害了子代卵母细胞的进一步发育,这与上文Miao等[36]研究结果相一致㊂4㊀BaP对胎儿或胚胎的生殖毒性(Reproductive toxicity of BaP to the fetus or embryo)4.1㊀BaP的胚胎发育毒性(Embryonic developmen-tal toxicity of BaP)早有研究表明,吸烟损害身体健康,还对孕妇以。
甲醛对雄性动物生殖毒性的研究进展
ｆ０ ３￣ 道 甲醛 导 致 小 鼠睾 丸组 织 的病 理 改变 ２ ０ ）Ｋ
甲醛 （ Ｃ Ｏ 是 一种 无色 易 溶 的刺 激 性气 以生殖 细 胞变 性 为 主 ； 甲醛 各 剂 量 组均 引起 精 Ｈ Ｈ ）
体 ，可经 呼 吸道 、消化 道 吸 收 。现 代 科 学研 究 子 数减 少 ，精 子头 畸 形率 升 高 ； 甲醛 的 中、高 表 明， 甲醛在 常 温 下 极易 挥 发 ， 随着 温 度 的上 剂 量组 能诱致 早 期 精 细胞 微 核 率 和 精原 细胞 姊 升挥发 速 度越 快 。 甲醛为 较 高 毒 性 的物 质 ，在 妹 染色 单 体 交 换 率 （Ｃ ） Ｓ Ｅ 显著 升 高 ；Ｓ Ｈ 的活 Ｄ
近 年 来 ， 由于 人 们对 甲醛 危 害性 的认 识逐 的遗传 物 质集 中于 精 子 头 部 ， 因此精 子 头 部 的 渐 提 高 ， 甲醛 生殖 毒 性 的研 究 也越 来 越 受 到 关 畸 形 可 能造 成遗 传 物 质 的 损伤 ，这 就必 将 导致
注 。 甲醛 对 雄 性 动 物 的 生 殖 毒 性 已经 基 本 明 子 代 的遗 传 致 畸 ［ 余 黎 等 （０ ３￣ 道 甲醛 的 ９ １ 。 ２ ０ ）Ｋ 确 ，并 开始 逐 步探讨 其 生殖 毒性 机 理 。 中 、高剂 量 组 早 期精 细 胞 微 核率 显 著 升高 ； 同 时精 原 细 胞 姊 妹 染色 单 体 交 换 率 也 显 著 升 高 ，
药物毒理学理论第二章药物毒性代谢动力学
6.生殖毒性研究
药物对生殖能力\胚胎和胎儿生长发育及分娩前后动物 的影响.
生殖毒性研究时，中毒剂量的极限通常由母体毒性所决定。毒代动力学数据并非对所有 药物生殖毒性试验都是需要的，但在某些情况下，毒代动力学监测是有价值的，尤其是对母 体毒性低的药物。
在缺乏药理或毒理资料而难以断定全身中毒量是否足够时，毒代动力学原理有助于确 定在生殖过程不同阶段给药以达到的中毒量。
Volume (L/70kg)
40000
17000
300
250
30
27
6
Vd的临床应用意义
推测药物在体内的分布范围 Digoxin：0.5mg 0.78 ng/ml Vd = 645 L 主要分布于肌肉（包括心肌，其浓度为 血浓30倍）和脂肪组织
计算用药剂量：Vd=D/C
28
Plasma concentration
Acetaminophen
15 mg/L
>300mg/L
Chloroquine Digoxin Imipramine Lidocaine Nortriptyline Phenobarbital Phenytoin
20 ng/mL 1 ng/mL 200ng/mL 3 mg/L 100 ng/mL 15 mg/L 10 mg/L
250 ng/mL >2 ng/mL >1 mg/L >6 mg/L >500 ng/mL >30 mg/L >20 mg/L
根据靶浓度计算给药剂量和制定给药方案，药后还应及时监测3血4 药
浓度，调整剂量，以始终准确地维持在靶浓度水平。
10 峰浓度C(ss)max、谷浓度C(ss)min 11 蓄积因子R:
中药生殖毒性体外实验研究进展-张志伟
89第18卷 第4期 2016 年 4 月辽宁中医药大学学报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol. 18 No. 4 Apr .，2016中药生殖毒性体外实验研究进展张志伟1，汪受传2，徐建亚2，单进军2（1.南京中医药大学，江苏 南京 210023；2.南京中医药大学中医儿科研究所，江苏省儿童呼吸疾病（中医药）重点实验室，江苏 南京 210023）摘 要：生殖毒性作为中药学重要研究内容之一，是中药安全性研究的重要组成部分。
目前对中药生殖毒性研究评价主要采用国内外新药临床前安全性评价指南所推荐的三阶段试验，然而存在费用高、实验周期长等缺点。
欧洲替代方法研究中心（ECVAM）所推荐的胚胎干细胞试验、胚胎细胞微团培养试验及全胚胎培养试验等体外替代试验已应用于中药生殖、胚胎毒性的研究。
该文就中药单体或复方生殖毒性体外试验评价的现状，对体外替代试验方法及其优缺点、必要性等进行了讨论。
关键词：中药；生殖毒性；胚胎干细胞试验；胚胎细胞微团培养试验；全胚胎培养试验中图分类号：R282.7 文献标志码：A 文章编号：1673-842X (2016) 04- 0089- 03收稿日期：2015-09-16基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（81303299）作者简介：张志伟（1990-），男，河南洛阳人，2013级硕士研究生，研究方向：中医儿童保健学方向研究。
通讯作者：徐建亚（1980-），女，江苏江阴人，副研究员，硕士，研究方向：中药药理及毒理细胞分子机制研究。
Review of in Vitro Reproductive Toxicity in Traditional Chinese Medicine Screening MethodsZHANG Zhiwei 1，WANG Shouchuan 2，XU Jianya 2，SHAN Jinjun 2（1.Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，Jiangsu，China；2.Instituteof Pediatrics of Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu Key Laboratory ofPediatric Respiratory Disease（TCM），Nanjing 210023，Jiangsu，China）Abstract：The reproductive toxicity which is as one of the most important research in Chinese materiamedica takes an important place in Chinese medicine pre-clinical safety evaluation. At present，the three-phases reproductive toxicity study is the method mainly applied in traditional Chinese medicine reproductive toxicity evaluation. However，there exists lots of questions such as high cost and long experimental period. Alternative methods of whole embryos culture and embryonic stem cell and embryonic cell micromass culture recommended by ECVAM have been used in reproductive and embryo toxicity evaluations of traditional Chinese medicine. This article reviewed research progresses on reproductive toxicity of traditional Chinese medicine by alternative methods in vitro and discussed their advantages，disadvantages and the necessity etc.Keywords：traditional Chinese medicine；reproductive toxicity；embryonic stem cell test；embryo cell culture assays micelles；whole embryo culture test 妊娠安全和生殖健康不仅对于保障优生优育具有重要意义，而且还关系到国家的兴衰和民族的未来。
第八章 化学物质的生殖发育毒性和致畸作用及评价
3．损伤细胞和分子水平的翻译 细胞增殖率在个体发生过程中空间和
时间都在变化，在胚胎中细胞增殖、分化 和凋亡之间有精致的平衡。用CP处理妊娠 第10天大鼠，引起胚胎的S-期细胞周期阻 断，在细胞迅速增殖区域观察到细胞死亡
36
细胞周期长度的不同可能部分地影响 敏感性。如：胚胎的神经上皮对CP诱导 的细胞死亡相当敏感，而心脏有抵抗力。 第10天大鼠胚胎神经上皮的细胞周期时间 大约为9.5h，而在心脏中的细胞周期大约 是13.4h，这是由于心脏细胞比神经上皮 有更长的C0/G1期
48
第四节 外源性化学物发育毒性的评价
49
一、动物发育毒性试验
➢ 最佳联合方案是对成年动物进行染毒并包 括子代从受精卵到性成熟所有生长发育阶段 ➢ 观察期应贯穿一个完整的生命周期，以 检测近、远期效应 ➢ 最常选用的方案为三阶段试验
50
I 阶段试验
➢ 雌雄性交配前-受孕-雌性受精-雌性着床 期间染毒 ➢ 对成年雌雄性的生殖功能、配子的发生 及成熟、交配行为、受精、着床前的发育 和着床的影响
12
（二）器官形成期
孕体着床后直到硬腭闭合的一段时间 致畸敏感期或致畸作用危险期 (critical period)
➢ 器官结构畸形 ➢ 胚胎死亡
✓ 吸收胎（resorption） ✓ 流产
13
➢ 各个器官发育最旺盛时感受性最强，不 同器官的敏感期（target window）不同， 且有交叉重叠
8
3. 胚胎-胎儿毒性
胚胎毒性（embryotoxicity） 外源性理化因素造成的着床前后直到
器官形成期结束的所有毒性表现
胎儿毒性（fetoxicity） 器官形成期结束后的因素引发的任何
毒性表现（死亡、低体重、骨化迟缓、功 能缺陷以及结构异常）
丙烯酰胺生殖毒性的研究进展[1]
![丙烯酰胺生殖毒性的研究进展[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/f3d2478384868762caaed5b2.png)
丙烯酰胺生殖毒性的研究进展杨媛媛,杨建一 (山西医科大学细胞生物与遗传学教研室,太原 030001)中图分类号:R99416 文献标识码:A 文章编号:1006-9534(2007)12-0001-02 2002年4月瑞典国家食品管理局(NF A)和斯德哥尔摩大学研究者率先报道,在一些油炸和高温烘烤的淀粉类食品,如炸薯条、炸土豆片、谷物、面包等中检出丙烯酰胺(ac2 ryla m ide,AA)且其含量比世界卫生组织(WHO)规定的饮水中AA的含量(成人每日从饮水中摄入的AA<1μg)高出500倍以上;之后挪威、英国等国家也相继报道了类似结果。
由于AA具有神经毒性、致癌性、遗传毒性和生殖毒性,因此食品中AA的污染引起了国际社会和各国政府的高度关注。
一、丙烯酰胺致生殖毒性的形态学改变AA及其代谢产物环氧丙烯酰胺(glycida m ide,G A)可与精细胞鱼精蛋白相结合,造成精细胞形态学的改变及死亡[1]。
Yang等[2]人给S D雄性大鼠以0、5、15、30、45、和60mg/(kg・d)剂量的AA连续染毒5天,在最高剂量组中大鼠睾丸重量下降,所有染毒剂量组附睾重量明显下降,附睾尾部精子数量显著减少,最低剂量组精子数量较对照组降低一半,并呈现剂量依赖关系。
高剂量组显示曲细精管有多种组织病理学损伤,表现为管状内皮细胞增厚,层数增加,生殖细胞变性,在萎缩的曲细精管内有许多多核巨细胞的形成。
同时发现睾酮水平和间质细胞成活力也受到影响。
雄性小鼠以150mg/kg的AA经口一次染毒,10天后发现睾丸精子细胞核空泡和细胞肿胀的损伤,染毒第1天即可观察到明显的细胞脱落。
并观察到精子细胞和精母细胞的变性。
有人在鼠的日常食物中给予AA400ppm长达90天可见睾丸变性,在饮水中每天加入AA20mg/kg达92～93天发现鼠的睾丸和子宫有萎缩现象。
经AA染毒的雄性大鼠附属生殖器官中精子数量减少,活动度降低,畸形率增加,脱离暴露一段时间之后曲细精管会部分恢复。
国家食品药品监督管理局关于推进实施《药物非临床研究质量管理规范》的通知
国家食品药品监督管理局关于推进实施《药物非临床研究质量管理规范》的通知文章属性•【制定机关】国家食品药品监督管理局(已撤销)•【公布日期】2006.11.20•【文号】国食药监安[2006]587号•【施行日期】2006.11.20•【效力等级】部门规范性文件•【时效性】现行有效•【主题分类】药政管理正文国家食品药品监督管理局关于推进实施《药物非临床研究质量管理规范》的通知（国食药监安[2006]587号）各省、自治区、直辖市食品药品监督管理局（药品监督管理局）、总后卫生部药品监督管理局：为贯彻实施《药品管理法》，国家食品药品监督管理局发布了《药物非临床研究质量管理规范》（简称GLP）、《药物非临床研究质量管理规范检查办法（试行）》等有关规定，并于2003年开始对药物非临床安全性评价研究机构进行GLP 认证。
目前已有部分药物非临床安全性评价的研究机构通过GLP认证。
为进一步推进药物非临床研究实施GLP，从源头上提高药物研究水平，保证药物研究质量，经研究决定，自2007年1月1日起，未在国内上市销售的化学原料药及其制剂、生物制品；未在国内上市销售的从植物、动物、矿物等物质中提取的有效成份、有效部位及其制剂和从中药、天然药物中提取的有效成份及其制剂；中药注射剂的新药非临床安全性评价研究必须在经过GLP认证，符合GLP要求的实验室进行。
否则，其药品注册申请将不予受理。
2007年1月以前已开展的上述药物的非临床安全性评价研究，其药品注册申请资料可予以受理。
请各省、自治区、直辖市食品药品监督管理局（药品监督管理局）加强对辖区内药物非临床安全性评价研究的监督管理，并通知本辖区内药物非临床安全性评价研究机构和相应药品研发机构按照以上要求，严格执行GLP。
附件：通过GLP认证的机构名单国家食品药品监督管理局二○○六年十一月二十日通过GLP认证的机构名单┌─┬───────┬────────────────┬───────────────┐│序│机构名称│试验项目│公告时间││号││││├─┼───────┼────────────────┼───────────────┤│1 │中国药品生物制│1．单次给药毒性试验（啮齿类、非│2003年5月22日（第1号）│││品检定所（国家│啮齿类）；2．多次给药毒性试验（││││药物安全评价监│啮齿类、非啮齿类）；3．生殖毒性││││测中心）│试验；4．遗传毒性试验（Ames、微│││││核、染色体畸变）；5．致癌试验；6│││││．局部毒性试验；7．免疫原性试验│││││；8．安全性药理试验；9．毒代动力│││││学试验。
10.生殖毒性
外源化学物对雌性生殖系统的毒作用及表现
对下丘脑－垂体系统的损害: 闭经/动情抑制,受孕力降低
卵母细胞数↓/突变 生长卵泡和成熟卵泡 排卵抑制,受孕力↓ 对卵巢的损害 卵巢功能提前衰退 干扰卵巢内分泌 影响受精/着床/胚胎发育
生殖道的损害: 影响运送卵子/受精/受精卵发育
常见生殖损害的表现
性欲和性交能力↓,受孕力↓,月经紊乱,闭经,异常的妊 娠结局(流产、早产和死产,子代发育异常,低出生体重,围 产期死亡等)
睾酮 雌二醇 抑制素
Leydig 细胞 Leydig 细胞
Sertoli细 垂体前叶 胞
中枢神经系统
下丘脑 GnRH Leydig cell ICSH 睾酮 Sertoli cell FSH ABP,抑制素 调节雄激素含量 垂体 ICSH FSH 睾丸 附睾 受精 精细胞 n 精细胞转变成成熟精子的 过程精子生成或精子发生 (spermatogenesis) 精 子 发 生 精子形成或精子分化 (spermiogenesis) 精原细胞(休止状态) 2n 有丝分裂(青春期) 初级精母细胞 2n
器官重量
组织病理学 精液分子
睾丸、附睾、精囊、前列腺，垂体
睾丸、附睾、精囊、前列腺，垂体 精液量及精液特征分析
精子评价
激素水平
精子数量(计数、活率)及质量(形态、 活动度)
LH、FSH、睾酮、雌激素、催乳激素
睾丸功能
性行为
睾丸标志酶活性检测
跨上、插入、射精
发育效应
睾丸下降、包皮分离、精子产量、肛
殖距离、外生殖器结构
生殖毒作用的机理
细胞毒性、致癌或致突变性 直接作用 生殖毒物 作用方式 间接作用
结构与内源性分子的相似性
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第一节 致畸胎研究研究概况
年份
1932 1935 1948 1950 1956 1963 1966 1971
事件
作者
维生素A缺乏可使猴胚胎畸形
Hale
X射线照射使大鼠胚胎发生各种畸形 Gob
氮芥导致大鼠胚胎畸形
Harriu
可的松致小鼠胚胎畸形
Baxter
反应停（Thalidomide）事件
母体毒性（embryo toxicity ）：指药物引起怀孕动物的毒效 应，如体重不增或减轻等，最严重的是死亡。
第二节 有关生殖毒性的基本概念
畸形（malformations）：永久性结构异常或功能异常的 胎儿和新生儿。通常不包括显微镜下细微结构的异常, 生 化代谢性缺陷。单纯功能异常(如精神缺陷、智力缺陷), 也不包括分娩过程中各种因素造成的缺陷。
第三节 一般生殖毒性试验
[目的]
一般生殖毒性试验（reproductive toxicity test） 是研究药物对整个生殖过程的影响。包括生殖细胞 （精子、卵细胞）的发生，卵细胞受精、着床胚胎 形成，胚胎发育阶段的影响并作出评价。
[动物及分组]
至少一种动物，一般为大鼠或小鼠，每组雄性 动物10只，雌性动物至少20只。
第三节 一般生殖毒性试验
[检查]
1. 雄性与雌性动物同笼交配后，每日检查小鼠阴道中有无 阴栓，大鼠则检查精子，以检查到阴栓或精子的当日作 为妊娠第0天。
2. 雌鼠于妊娠第13天解剖观察，以确定妊娠、胎儿的吸收 和死亡情况，并记录母鼠的一般状况、体重变化和胎盘 重量，以确定子宫内的活胎数，对活胎进行性别鉴定、 体重和身长的测量以及外表和内脏器官的形态学观察， 对骨骼进行茜红素染色后进行检查，必要时进行组织学 和组织化学的详细检查。
第二节 有关生殖毒性的基本概念
畸胎学：从胚胎学和病理学发展出来的一个分支学科，是研 究胚胎发育时期，由各种内外因子引起结构和功能异常的先 天性畸形的科学。
致畸性（teratogenicity）：药物接触胚胎发生期后引起 永久性结构或功能异常的性质。 胚胎毒性（embryo toxicity）：某些药物在一定剂量仅 对胚胎或胎儿有毒性作用而对母体没有毒性作用，此作用 被称为胚胎毒性。胚胎毒性表现为胚胎死亡、胚胎生长迟 缓、畸形和功能不全。
一般生殖毒 性试验
成年雄性/雌性动物的生殖功能；胚胎 发和大部分器官形成
成年雌性动物的生殖功能；胚胎生长发 育以及器官发育和生长
致畸试验
成年雌性动物的生殖功能；婴儿在宫外 生活的适应性；断奶前的发育和生长 围产期试验
断奶前的发育和生长；独立生活的能力； 完全达到性成熟
避孕药、性激素、性功能障碍药、促精子生成药、致突变试验 阳性或有毒作用的新药，必须进行生殖毒性试验。
第二节 有关生殖毒性的基本概念
生殖是机体繁衍种族的生理过程，包括生殖细胞的发 育形成、交配、受精、植入、胚胎形成和发育、分娩和哺 乳等过程。每一个环节均可能是化学物质毒性作用的靶部 位，机体接触化学物质后干扰了其生理过程，使生殖过程 的功能出现缺陷和损害，此即化学物质的生殖毒性。
生殖毒性有两个特点：（1）对化学物质的毒性作用 敏感，一定剂量下，其他系统尚未出现损害之前，生殖过 程中的某个环节或功能已经出现障碍；（2）化学物质毒性 作用对其损害更为深远，不仅表现在接触化学物的机体本 身，还可影响后代。
本试验检测药物对整个生殖过程的毒性作用，通过繁 殖试验可以了解药物对试验动物的性腺功能、交配能力、 受孕能力、妊娠过程、分娩、哺乳及对后代生长发育的影 响。
生殖毒性研究在限定临床研究受试者范围、 降低临床研究受试者和药品上市后使用人群的 用药风险方面发挥重要作用。
生殖过程分期
分期
研究内容
检测方法
交配前到怀 孕 怀孕到着床
着床到硬腭 闭合 硬腭闭合到 怀孕末期 出生到断奶
断奶到性成 熟
成年雄性/雌性动物的生殖功能；配子 的发育和成熟；交配行为及生育力
成年雄性/雌性动物的生殖功能；着床 前的发育和着床
出生缺陷(birth defect)：指任何解剖学的和功能的 异常。既包括形态结构的异常(大体的和细微的)，也包 括功能、代谢、行为的异常。
致畸指数（teratogeny index）：为一种药物对母体的半数 致死量与最小致畸量的比值，是表示一种化学物质的致畸 强度指标。建议致畸指数在10以下定为不致畸，10 ~ 100为 致畸，100以上为强致畸。
[结果判定]
第三节 一般生殖毒性试验
畸胎率% =
畸胎总数 活胎仔总数
×100 %
活胎仔平均畸形数 =
畸形总数 活胎仔总数
母体畸胎出现率%
出现畸胎母体数 = 妊娠母体总数
×100 %
* 畸胎及畸形的计算方法
第四节 繁殖试验
[目的、原理]
凡受试物能引起生殖机能障碍，干扰配子的形成或使 生殖细胞受损，其结果除可影响受精卵或孕卵的着床而导 致不孕外，尚可影响胚胎的发生及胎仔的发育，如胚胎死 亡导致自然流产、胎仔发育迟缓以及胎仔畸形。如果对母 体造成不良影响，出现妊娠、分娩和乳汁分泌的异常，亦 可出现胎仔出生后发育异常。
美国药物安全委员会
美国FDA — 人用药生殖安全评价准则
WHO规定新药应有生殖毒性研究
先天愚型
海豹肢畸形
生殖毒性研究（Reproductive toxicity study）是药物非临床安全性评价的重要内容， 它与急性毒性、长期毒性、遗传毒性等毒理学 研究有着密切的联系，是药物进入临床研究及 上市的重要环节。
第三节 一般生殖毒性试验
[检查]Байду номын сангаас
3. 大鼠于孕期第20天处死（小鼠18天）。剖腹取 出子宫及卵巢，辨认和记录活胎数，早死胎数、 晚死胎数、吸收胎数和黄体数，对活胎仔应辨 别性别、称重，测量身长及尾长，仔细检查活 胎仔的外观有无畸形，将每只母鼠的2/3活胎 仔剥去皮肤和内脏，经脱水透吸及茜红素染色 后，检查骨骼畸形，将1/3活胎仔浸入Bouin氏 溶液中固定，供检查内脏畸形。
第三节 一般生殖毒性试验
[给药剂量及途径]
给药组设高、中、低三个剂量；高剂量应能产 生轻微毒性反应，如体重增长缓慢等，但不应出现 严重中毒或死亡。
给药途径应尽量接近临床。
[给药时间]
雄性动物交配前给药60 ~ 80天，雌性动物交配 连续给药14天。交配后继续给药至大多数器官发生 期（大鼠/小鼠为孕后13天）。