生物芯片的数据分析
生物芯片和基因芯片技术在生命科学研究中的应用
生物芯片和基因芯片技术在生命科学研究中的应用生物芯片和基因芯片技术是现代生命科学研究中的重要工具。
芯片技术的发展使得我们能够快速地对大量的样本进行高通量、高精确度的分析。
本文将介绍生物芯片和基因芯片技术在生命科学研究中的应用及其发展趋势。
一、生物芯片技术的应用生物芯片技术是一种高通量的分析方法，它可以在一张芯片上同时检测多个分子。
这使得我们能够在非常短的时间内获取大量的数据。
生物芯片技术广泛应用于基因表达、蛋白质分析、代谢组学、病原体检测等领域。
1. 基因表达分析基因芯片是一种生物芯片，它可以同时检测大量的基因表达水平。
在基因芯片实验中，我们可以将RNA转录成cDNA并标记，然后用标记后的cDNA对芯片上的基因探针进行杂交。
利用芯片上的探针对转录物进行测定，可以对基因的表达水平进行高通量分析。
基因表达分析可以帮助我们了解基因在不同条件下的表达情况，从而找到与某种生理或病理状态相关的基因，或者发现新的基因调控机制。
2. 蛋白质分析生物芯片技术不仅可以用于基因表达分析，还可以用于蛋白质分析。
蛋白芯片是一种生物芯片，它可以同时检测多种蛋白质。
蛋白质芯片上的探针可以是包括多肽、抗体或亲和分子等，这些可以特异性地结合目标蛋白质。
通过分析芯片上与蛋白质结合的探针，可以得到不同样本中的蛋白质组分，从而找到与某种生理或病理状态相关的蛋白质，或者发现新的蛋白质相互作用机制。
3. 代谢组学代谢组学是通过测定生物体内代谢产物的组成和变化以了解代谢过程的系统科学研究方法。
芯片技术在代谢组学研究中广泛应用。
代谢组学芯片可以同时检测多种代谢产物，这些代谢产物可以反映代谢系统的整体状态。
通过对代谢组学芯片的分析，我们可以了解不同组织或器官代谢物质的组成和变化，从而为疾病的诊断和治疗提供重要的参考。
4. 病原体检测芯片技术还可以用于病原体检测。
基因芯片或蛋白质芯片可以用于检测感染病毒、细菌、真菌等病原体相关的基因或蛋白质。
这种技术可以快速、高效地检测出病原体的存在，从而为疾病的诊断和治疗提供帮助。
生物芯片技术在分子诊断中的应用及分析
生物芯片技术在分子诊断中的应用及分析随着现代科技的飞速发展，人们对于疾病的诊断和治疗都有了更高的要求。
传统的诊断方法往往需要进行大量的实验操作，并且耗费人力、时间和物力，难以为患者提供快速、准确、低成本的服务。
而生物芯片技术的出现，不仅可以帮助人们更快速、更准确地进行分子诊断，同时还可以大大节省成本，成为一种受欢迎的疾病诊断手段。
一、生物芯片技术的基本原理生物芯片技术是一种高端的分子生物学技术，它主要通过微芯片上的生物分子反应方案，检测待测样本中的分子信息。
其基本原理是将具有生物学功能的生物分子固定在芯片上的指定的区域，待样本加入后，样本中的荧光性或者透析性（离子流）的变化，会让生物芯片中的检测系统检测到，并通过计算机程序，记录关键性的信息。
通俗地说，就是利用生物芯片对样本信息进行筛查和分析，找到疾病信号，从而进行诊断。
二、生物芯片技术在分子诊断中的应用1.基因诊断基因诊断是生物芯片技术最主要的应用之一，它主要通过生物芯片上的基因序列信息对待测样本进行分析和检测，包括基因突变、单核苷酸多态性（SNP）、基因差异性表达等等。
通过对待测样本的基因信息比对和分析，可以有效地诊断出一些遗传性疾病，如唐氏综合症等遗传基因疾病。
2.肿瘤诊断肿瘤诊断是生物芯片技术中的另一个主要应用，其主要通过检测血清、血浆和组织中的一些特异性肿瘤标志物（如AFP、CEA、CA125等）及相关蛋白，进行对肿瘤的筛查和诊断。
同时，它还可以通过检测肿瘤的mRNA表达谱，对肿瘤的分类和恶性程度进行判别。
3.细胞检测生物芯片技术还可以用于对待测样本中细胞相关的生物分子信息进行检测和诊断，如细胞表面标志物、染色体畸变、基因增殖等信息，从而对未知的肿瘤或病因进行诊断。
三、生物芯片技术在分子诊断中的优势与传统的检测方法相比，生物芯片技术在分子诊断方面有以下几个优势：1.快速、高效生物芯片技术可以对待测样本进行大量筛查和分析，且可以提供迅速的分子生物学信息，从而可以快速、高效地进行病因分类。
生物信息学讲义——基因芯片数据分析
生物信息学讲义——基因芯片数据分析生物信息学是指运用计算机技术和统计学方法来解析和理解生物领域的大规模生物数据的学科。
基因芯片数据分析是生物信息学研究的一个重要方向，通过对基因芯片数据进行分析，可以揭示基因在生物过程中的功能和调节机制。
本讲义将介绍基因芯片数据的分析方法和应用。
一、基因芯片数据的获取与处理基因芯片是一种用于检测和测量基因表达水平的高通量技术，可以同时检测上千个基因的表达情况。
获取基因芯片数据的第一步是进行基因芯片实验，如DNA芯片实验或RNA芯片实验。
实验得到的数据一般为原始强度值或信号强度值。
接下来，需要对这些原始数据进行预处理，包括背景校正、归一化和过滤噪声等步骤，以消除实验误差和提高数据质量。
二、基因表达分析基因芯片数据的最主要应用之一是进行基因表达分析。
基因表达分析可以揭示在不同条件下基因的表达模式和差异表达基因。
常用的基因表达分析方法包括差异表达分析、聚类分析和差异共表达网络分析等。
差异表达分析常用来寻找在不同条件下表达差异显著的基因，如差异表达基因的筛选和注释；聚类分析可以将表达模式相似的基因分为一组，如聚类分析可以将不同样本中的基因按照表达模式进行分类；差异共表达网络分析可以找到一组在差异表达样本中共同表达的基因，揭示潜在的功能模块。
三、功能富集分析对差异表达基因进行功能富集分析可以帮助我们理解这些基因的生物学功能和参与的生物过程。
功能富集分析可以通过对差异表达基因进行GO(Gene Ontology)注释，找到在特定条件下富集的生物学过程、分子功能和细胞组分等。
另外，功能富集分析还可以进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析，找到差异表达基因在代谢通路和信号传导通路中的富集情况。
四、基因调控网络分析基因调控网络分析可以帮助我们揭示基因间的调控关系和寻找关键调控基因。
基因调控网络是基于差异表达数据构建的，它可以包括转录因子-靶基因调控网络和miRNA-mRNA调控网络等。
生物芯片数据分析简介
一、基因芯片与基因表达 二、基因表达谱统计与分类分析 三、Ontology与基因功能注释 四、基于芯片数据的pathway分析
一、基因芯片与基因表达
什么是生物芯片？
一块指甲大小（1cm3 ）的有多聚赖氨酸包被的硅片或其 它固体支持物（如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维 素膜、尼龙膜等 ）。 生物芯片通过微加工和微流体系 统将生化分析中的样品制备、生 化反应、及结果检测有机地结合 集成在一起 。 具有高速度、分析自动化、及高 度并行处理能力 。
Subcellular components where a gene-product is found. Encompasses subcellular structures, locations, and macromolecular complexes
GO example
(Browser at /cgi-bin/go.cgi)
cDNA microarray
microRNA Chip
Biological question
Experimental design Microarray experiment
Image analysis
Normalization
Estimation
Testing
Clustering
Discrimination
13,601 Genes
Signal Transduction Ligand Binding or Carrier Motor Protein
GO Analysis—目标基因群显著性、靶向性基因功能分析。 Go Analysis对目标基因（差异基因等）进行GO分类，而后 对GO进行基于离散分布的显著性分析、误判率分析、富集度 分析，得出与实验目的有显著联系的、低误判率的、靶向性 的基因功能分类，该分类即导致样本性状差异的最重要的功 能差别，其所属基因是进一步验证的重要目标基因。 数据要求：标有上调和下调比值的差异基因列表。
生物芯片技术优势和应用前景分析
生物芯片技术优势和应用前景分析生物芯片技术是一种新兴的生物科技，它在生物学、医学和检测领域具有广阔的应用前景。
本篇文章将对生物芯片技术的优势以及未来的应用前景进行分析和探讨。
生物芯片技术是一种通过微电子制造工艺将生物分子与晶体管技术紧密结合的技术。
它以微芯片为载体，具备高通量、高灵敏度、高特异性等优势，成为生命科学和医学领域的重要突破之一。
首先，生物芯片技术具有高通量的特点。
传统的生物实验通常需要大量的试剂和样品，以及大量的实验时间。
而生物芯片技术通过集成多个探测位点在一个芯片上，能够同时进行多个实验或检测，大大提高了实验的吞吐量和效率。
这种高通量的特点非常适合于高效筛选和分析大量的生物标志物，例如遗传变异、蛋白质表达水平等。
其次，生物芯片技术具有高灵敏度的优势。
生物芯片上的微阵列结构能够将目标分子与传感器直接接触，从而实现高灵敏度的检测。
而且，由于芯片上的探测点密集排列，使得对样本的需求量大大降低，可以实现微量样本的分析。
这种高灵敏度的特点对于药物筛选、疾病早期诊断等方面具有重要意义。
此外，生物芯片技术还具有高特异性的特点。
生物芯片上的每个探测点都经过精确设计和优化，能够特异性地与目标分子结合，并产生可靠的信号。
通过合理设计分子探针和相应的引物，可以实现对特定基因、蛋白质、细胞等特定生物分子的检测和鉴定。
这种高特异性的特点使得生物芯片技术在基因检测、肿瘤标志物检测等方面具有巨大的潜力。
生物芯片技术在医学、生物学研究和环境监测等领域具有广阔的应用前景。
在医学方面，生物芯片技术可以应用于个体化治疗和药物筛选。
通过检测基因型、表型和环境因素等信息，可以预测患者对特定药物的反应和疗效，从而实现个体化治疗。
另外，生物芯片技术还可以用于快速检测病原体和疾病标志物，提高疾病的早期诊断和预防。
在生物学研究方面，生物芯片技术可以帮助研究人员快速获取大量基因表达数据，并进行高通量的功能分析和互作网络研究。
此外，生物芯片技术的高特异性和高灵敏度使得它在基因编辑和基因组编辑领域有着广泛的应用潜力，为研究人员提供了更多的研究工具和研究方法。
生物芯片分析中的差异表达基因筛选技巧
生物芯片分析中的差异表达基因筛选技巧随着高通量测序和生物芯片技术的发展，差异表达基因分析已成为研究基因调控和识别重要生物过程的关键方法。
差异表达基因筛选是一个常见的分析步骤，它可以帮助研究人员快速发现在不同条件或组织中表达水平显著变化的基因。
本文将讨论生物芯片分析中的差异表达基因筛选技巧，并介绍一些常用的方法和工具。
1. 统计学方法差异表达基因分析的首要任务是确定在两个条件或组织之间是否存在表达水平上的显著差异。
为了实现这一目标，研究人员可以利用各种统计学方法，如T检验、方差分析（ANOVA）、Wilcoxon秩和检验等。
这些方法可以帮助确定差异表达基因，并提供相关的统计指标（如p值和调整后的p值），用于衡量差异的显著性和可靠性。
2. 基因表达聚类基因表达聚类是一种常用的差异表达基因筛选技巧。
通过将基因根据其表达模式进行分组，研究人员可以识别出共同调控的基因群。
常见的聚类方法包括层次聚类、K均值聚类和模糊聚类等。
这些方法可以将差异表达的基因分为若干个独立的模式，有效地揭示基因在不同条件下的表达特征。
3. 基因注释和功能分析差异表达基因筛选的另一个重要步骤是进行基因注释和功能分析。
基因注释可以将差异表达基因与已知的生物学功能和代谢通路关联起来。
研究人员可以利用公共数据库（如Gene Ontology、KEGG和Reactome等）对差异表达基因进行注释和功能分析，以了解这些基因在疾病发生和发展中的潜在作用。
4. 基因网络分析基因网络分析是一种集成基因表达数据的方法，可以帮助研究人员识别差异表达基因之间的相互关系和调控通路。
通过构建基因互作网络或转录调控网络，研究人员可以发现潜在的关键基因和调控因子，并揭示相关生物过程的重要调控机制。
常用的基因网络分析工具包括Cytoscape、STRING和GeneMANIA等。
5. 机器学习方法随着机器学习技术的发展，越来越多的研究人员开始将其应用于差异表达基因筛选。
芯片数据提取与分析微阵列生物芯片...
摘要生物芯片技术是二十世纪出现的最具有时代特征的一项革命性技术它用承载有成千上万种DNA和蛋白序列的厘米见方的固体芯片取代了传统生物分析中所用的凝胶滤器和纯化柱它的出现对生物农业医学领域乃至整个人类生活健康的各个方面带来了巨大的影响生物芯片技术的作用就像生物微处理器能够在基因组规模上对基因表达谱病人基因型药物代谢疾病的发生和进展过程进行快速和定量的分析生物芯片检测技术对生物学的发展具有革命性的意义通过应用生物芯片扫描仪人们能够自动读取生物芯片上的信息在短短几分钟内获取大量的数据而在以前要读取这些数据需要几个月甚至几年的时间在荧光检测技术中体现生化反应程度的荧光由生物芯片扫描仪中的激光激发并通过光电倍增管或CCD相机捕获形成数字图像此图像即是生物芯片实验分析的原始数据因此生物芯片扫描仪性能以及对原始图像的处理效果将对后续分析具有重要影响本课题来源于生物芯片北京国家工程研究中心所承担的十五国家863计划生物芯片专项的研发项目微阵列生物芯片扫描仪的研制该项目致力于研制基于CCD相机和激光扫描显微镜结构的国产化生物芯片检测仪器目标是研制出价格低廉性能优良的国产生物芯片检测系统样机能使用该仪器进行临床疾病诊断分析本文首先介绍了有关生物芯片的基本概念和几种常用的生物芯片检测技术其中重点介绍了生物芯片的荧光检测技术然后探讨了生物芯片和生物芯片激光共聚焦扫描仪的工作原理以及目前国内外研发的最新进展接着阐述了我们选用的设计方案并且给出了仪器的原理图和结构图着重介绍了自制生物芯片激光共聚焦扫描仪系统的硬件电路及其相应嵌入式软件的设计在本文的最后我们对扫描仪的线性度灵敏度和重复性等性能指标进行了测试结果表明此生物芯片扫描仪是一台高性能的检测系统关键词生物芯片生物芯片扫描仪微阵列信号检测AbstractThe magic of biochip analysis is sweeping through the agricultural and medical sciences, replacing traditional biological assays based on gels, filters, and purification columns with small glass chips containing tens of thousands of DNA and protein sequences. Biochip function like biological microprocessors, enabling the rapid and quantitative analysis of gene expression patterns, patient genotypes, drug mechanisms, and disease onset and progression on a genomic scale. Biochip detection instruments are revolutionizing biology. These ingenious devices allow biochips to be read in an automated fashion, providing an amount of data in a few minutes that would have taken months or even years to acquire with antecedent technologies.In this technique, fluorescence intensities, which reflect the degree of biochemical reaction, are detected by imaging the array with a laser and capturing the image with a photomultiplier tube or a CDD camera, resulting in the production of digital images. The images from the reaction arrays constitute the essential raw data for biochip. Therefore, biochip scanner and robust image processing are particularly important and have large impacts on downstream analysis.This project is come from National Engineering Research Center for Beijing Biochip Technology. The project is supported by “863” project on biochip, which is studying on laser confocal biochip scanner and CCD biochip scanner. The target is working out a cheap and work well laser confocal biochip scanner, which can be used in clinic diagnosis. In this paper, the basic concepts and general application flows of biochip technology are introduced, including the detailed principles of fluorescence detections for biochip. We discuss the principle of biochip scanner and the latest development and research in the world; we also introduce our design of biochip including its principle figures and structure figures. We introduce in detail that the system’s hardware and the embedded software. The performances, including linearity, sensitivity, repeatability and so on, are tested with special methods. This biochip scanner is a high performance detection system.Keywords: Biochip Biochip scanner Microarray Signal detection1 绪论1.1生物芯片技术1.1.1生物芯片技术生物芯片biochip的概念来自计算机芯片发展至今不过十几年时间但进展神速它是指能对生物分子进行快速并行处理和分析的指甲盖大小的薄型固体器件[1]生物芯片能够以生物学上史无前例的快速度和精确性来研究生物的基因组信息其发展的最终目标是将生命科学和医学研究中许多不连续的分析过程包括样品制备生化反应及检测分析等集成到由一块或多块芯片构成的芯片实验室Lab-on-a-chip[1]或微型全分析系统micro total analytical system, μTAS[2]中自从1991年Fodor[3]等人提出DNA芯片的概念后近年来以DNA芯片为代表的生物芯片技术[4]~[7]得到了迅猛发展目前已有多种不同功用的芯片问世而且有的已经在生命科学研究中开始发挥重要作用生物芯片按功能分有基因测序芯片[8]表达谱芯片疾病诊断芯片[9]药物筛选芯片样品制备芯片[10]生化反应芯片[11]结果检测芯片[12]等按工作方式分有被动式芯片和主动式芯片[1]两种根据芯片结构和工作机理分为微阵列Microarray芯片和微流体Microfluidic芯片[13] [14]前者是由排成阵列形式的生物分子包括核酸蛋白质等构成其分析应用原理都是基于抗原和抗体的结合核酸分子的碱基互补作用等生物分子之间的亲和作用力所以也可通称为亲和型生物芯片后者则是以各种微管道网络为结构特征用来实现对包含生化组份微流体的控制和检测分析包括常见的毛细管电泳芯片[15][16]PCR反应芯片[11]介电电泳分离芯片[17][18][19]等本文谈到的生物芯片为微阵列生物芯片微阵列生物芯片是指采用光导原位合成或微量点样等方法将大量生物大分子比如核酸片段多肽分子甚至组织切片细胞等生物样品有序地固化于支持物如玻片尼龙膜等载体的表面组成密集二维分子排列然后与已标记的待测生物样品中靶分子反应反应结果用同位素法化学荧光法化学发光法或酶标法显示然后用精密的扫描仪或CCD 摄像技术记录通过计算机软件分析综合成可读的IC总信息从而判断样品中靶分子的数量[20][21]根据芯片上固定的探针不同微阵列芯片分为基因芯片蛋白质芯片细胞芯片组织芯片等微阵列生物芯片的检测过程如图1.1所示图1.1 微阵列生物芯片的检测过程因为基因表达的模式和它们的功能密切相关因此微阵列生物芯片为研究人类衰老药物反应激素反应脑疾病膳食及其他临床相关研究提供了史无前例的信息微阵列生物芯片技术也能用来检测基因序列的改变因而为在遗传筛选测试诊断领域建立新方法扫清了道路组织芯片和蛋白芯片正在对传统的组织免疫和生化分析进行微型化改造加速了人们对肿瘤分类蛋白-蛋白反应酶活性的分析由于微阵列生物芯片技术具有研究细菌病毒线虫果蝇植物奶牛鸡小鼠大鼠及灵长目基因组的能力它正在成为生物化学领域研究的诺亚方舟1.1.2生物芯片技术的历史基础生物芯片技术的出现在生物学发展的历史上是独特的因为还没有其它的技术把如此多的学科结合在一起并且能对生物体系提供定量和系统的分析20世纪90年代早期在斯坦福大学[22]发展起来的生物芯片技术主要结合了六门学科的内容它们是生物学化学物理学工程学数学和计算机科学下面从生物学的角度来观察生物芯片技术在历史发展过程中的继承性早在1949年Pauling及其同事就描述了基因突变改变的蛋白质和疾病之间的关系Pauling的实验表明患有镰刀型贫血症的病人红细胞中的血红蛋白较健康人的在凝胶电泳分析时迁移距离不一样Pauling等人把这种现象正确地解释为两者的血红蛋白表面电荷不一致通过调查比较正常个体镰刀型贫血症基因携带者和患病者Pauling等人认为血红蛋白编码基因的变化是引起血红蛋白改变的原因随后的基因测序证明了这一点Pauling等人发表的论文为人类疾病的分子遗传分析铺平了道路也为现在的生物芯片技术在遗传筛选检测和诊断领域的应用奠定了概念上的基础在Science杂志上发表的这篇有关血红蛋白的论文是生物芯片技术历史基础上的一个里程碑Watson和Crick于1953年在Nature杂志上发表的一篇杰出的论文中预测了DNA 分子的化学结构通过使用结构化学和模型的数据作者正确地推测DNA分子包含两条方向相反的链两条链通过碱基之间的氢键力结合在一起Watson和Crick还建议了特异的碱基配对法则A-T和 C-G以及磷酸基团分布在外部的双螺旋结构随后的生化和结构研究证实了这些预测Watson Crick和Wilkins由于发现了核酸的分子结构以及核酸在生物体中传递信息的重要性而分享了1962年的诺贝尔奖双螺旋结构的发现是十九世纪科学发现最重要的突破之一也是现今生物芯片技术中杂交反应的化学基础DNA和RNA聚合酶能把核苷酸连接起来合成DNA和RNA链20世纪50年代圣路易斯华盛顿大学的Kornberg及其同事受到Cori实验室有关糖原磷酸化酶工作的启发发现了DNA聚合酶随后Cori的另外一名学生Ochoa又发现了RNA聚合酶的活性Kornberg和Ochoa由于发现了核酸和脱氧核酸生物合成的机制而荣获1959年的诺贝尔奖聚合酶证明有很多实际的应用包括作为DNA重组聚合酶链反应PCR和微阵列分析中的关键酶聚合酶的发现在生物学的发展史上有着非常重要的意义一个特殊的DNA聚合酶是反转录酶它能以RNA为模板来合成DNA这个酶的活性是1970年由Baltimore Temin和Mizutani发现的他们结合DNA聚合酶分析和放射性同位素标记的方法发现在劳氏肉瘤病毒和其他RNA病毒合成过程中有反转录酶出现反转录酶含有核酸酶的活性以及在RNA病毒合成过程中必须有反转录酶的出现都表明有来自病毒的RNA作为模板以后的研究证明了这一点反转录酶的发现是出乎意料带有戏剧性的因为它看上去和当时认为的遗传信息应该从DNA流向RNA而不能逆向流动的观点是相反的Baltimore Temin和Dulbecco由于发现了肿瘤病毒和细胞遗传物质之间的相互作用而荣获1972年的诺贝尔奖反转录酶有很多实际上的用途包括在第一次生物芯片芯片实验中用作标记的酶[23]在20世纪70年代斯坦福大学的研究者研究了基于硝酸纤维素膜和尼龙膜的许多应用途径这些方法为二十年后生物芯片技术的建立提供了基本的理论基础1975年斯坦福大学的Crunstein和Hogness发表了第一篇描述生物芯片的论文作者采用了硝酸纤维素膜点上细菌克隆的方法来分离果蝇基因他们发表的文章也表明了在DNA杂交实验中行和列的重要性斯坦福大学的Davis及其合作者也用硝酸纤维素膜来检测细菌的噬菌斑类似的工作也用在高等生物中鉴别了第一个差异性表达的基因哈佛大学的Maxam和Gilbert以及MRC中心的Sanger和合作者在1977年分别独立地发明了DNA测序方法Gilbert和Sanger由于他们在确定核酸碱基序列上的贡献而分享1980年诺贝尔奖Sanger化学方法被用来对人的基因组进行测序测序得到的数据信息又被用来构建DNA生物芯片1980年的诺贝尔化学奖被授予给斯坦福大学的Berg由于他对核酸生化性质的基础研究特别是在重组DNA方面所作的工作Berg及其合作者建立的DNA重组技术是20世纪最重要的科技进步之一并且显示出很多实际的应用包括现在生物芯片技术中用到的克隆文库的制备DNA聚合酶发现后引发的另一革命性发明是20世纪80年代早期Cetus公司的Mullis及其同事发明的PCR技术PCR技术可以从少量的遗传物质中制备数以百万计的DNA拷贝确保可以从任何生物样品中对任何一个基因进行DNA分析PCR 技术在生物芯片样品制备过程和生物芯片用于诊断过程中都有广泛的应用荧光染料数十年来一直用于生物膜的检测包括Waggoner和Stryer在20世纪70年代做的早期研究而后在20世纪90年代早期有人将花青素cyanine这种染料用于DNA探针的酶促制备过程Pinkel及其同事在20世纪80年代和90年代早期发明了双色标记和检测方法用于染色体分析以上在荧光和荧光显微镜方面所做的工作为现在的生物芯片技术中荧光标记和荧光检测的应用奠定了基础在玻片上进行的初期的杂交反应是20世纪80年代晚期和90年代早期由Mirzabekov及其合作者在莫斯科Fodor及其合作者1991年在Affymax公司Maskos 和Southern1992年在牛津大学Eggers及其合作者在Baylor Smith及其合作者在美国威斯康星大学分别进行的在Imperial Cancer Research Fund (ICRF)工作的Hans Lehrach及其同事在20世纪80年代后期开创性地把机械手用于DNA阵列的快速制备他们使用固体针在尼龙膜上点入基因组DNA克隆制备了较大的阵列尽管他们制备的阵列还比较大但他们的工作表明机械手可以用于阵列的制备高精度的运动控制系统可广泛地用于光引导原位合成接触式点样和喷墨式点样1.2 生物芯片的使用生物芯片的使用过程一般来说包括如图1.2所示的几个步骤样品处理目标分子富集转录文库制备增扩标记数据处理放射显影光化学电化学活性酶促反应综合信息分析检测洗涤分子间反应或杂交芯片制作配体点阵及固定化图 1.2 生物芯片使用过程 1.2.1 样品处理 生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体除少数特殊样品外一般不能直接与芯片反应必须将样品进行预处理例如从血液或活组织中获取的DNA/mRNA 样品在标记成为探针以前必须扩增以提高阅读灵敏度[24]根据样品来源基因含量检测方法和分析目的不同采用的分离扩增及标记方法也不同为了获得反应信号必须对样品进行标记标记方法有荧光标记法[25]生物素标记法同位素标记法等1.2.2 芯片制作生物芯片的制作需要做三方面的准备准备固定在芯片上的生物分子样品芯片片基和制作生物芯片的仪器研究目的不同期望制作的芯片类型不同制备芯片方法也不尽相同以基因芯片为例基本上可分为两大类一类是原位合成即在支持物表面原位合成寡核苷酸探针适用于寡核苷酸一类是预合成后直接点样多用于大片段DNA有时也用于寡核苷酸甚至mRNA 1光引导原位合成法 AffymaxSanta Clara, CA 的Fodor 和他的同事在微电子工业的光刻技术基础上做了极具创意的改进发明了光引导原位合成法[26]用紫外光和固相化学合成的方法制作微阵列这种发明于上世纪九十年代初期的光引导原位合成方法发展非常迅速已经成为应用最为广泛的微阵列生物芯片制备方法中的一种Affymetrix 公司利用光引导原位合成技术制备核酸微阵列生物芯片2000年售出了超过200 000片用这种方法制作的微阵列生物芯片光引导原位合成前玻片表面先作硅烷化处理使玻片表面上生成活性胺基团然后用第二种含有特殊化学基团methylnitropiperonyloxycarbonyl MeNPOC 的试剂修饰活性胺基团MeNPOC 基团对于各种化学反应试剂都很稳定但可以被强紫外光照射大约30秒后有选择性地去掉MeNPOC 基团能够抑止任何没有紫外光介入下的化学反应因此被称为光保护基团去掉光保护基团后基片去除保护的表面上可以和特定种类的DNA 碱基充分反应微阵列生物芯片表面上的分子与DNA 碱基键合在脱氧核糖的3’位置这个位置上有一个活性氨基磷酸酯基团如图1.3 合成单元活化亲核反应键合重复图 1.3 光导原位合成的化学过程DNA 碱基连在玻片表面上这一过程被称为耦合每一个耦合过的碱基都在其5’羟基位有一个光保护基团如图 1.3用紫外光照射后碱基上的MeNPOC 基团被去掉且可与第二个碱基耦合重复去除掩膜基团耦合新的碱基步骤可以在玻片上合成各种序列的寡聚核苷酸利用光掩膜可以对微阵列生物芯片上特定区域有选择性的去除光保护基团从而在微阵列生物芯片表面的各个位置合成寡聚核苷酸光掩膜是半导体工业中用于生产微处理器用的镀铬模板光掩膜包括表面镀铬的玻璃板以及板上各个没有铬的区域如图1.4铬阻止紫外光通过而没有铬的区域则允许紫外光通过且照射到基片表面上因为掩膜可以加工成涂铬区域和不涂铬区域的不同种组合紫外光可以按照任何顺序照射到基片的各个区域这样可以用一组光掩膜逐步合成各种序列的寡聚核苷酸微阵列每个光掩膜可以在基片的任何位置合成DNA碱基镀铬模板上的单元可以做得很小能够制备点径为2050m的微阵列现在Affymetrix公司可以制备密度大于250000点/cm2的微阵列生物芯片光掩膜紫外光表面修饰有保护基团的基片键合后的碱基图1.4 按光掩膜定义的方式进行键合相比接触式和非接触式点样方法光引导原位合成的主要优势是任何序列的微阵列都可以用4种碱基A, G, C和T来构建用几种试剂代替为微阵列上每个位点制备和储存样品是其一大优势尤其是需要制备复杂的微阵列生物芯片时而劣势是其局限于制备短长度的寡聚核苷酸微阵列< 30个核苷酸光掩膜和微阵列生物芯片的加工成本也相当昂贵但是光引导原位合成法可能是最为经济的制备大量全基因组微阵列生物芯片的方法2点样法点样法是将预先通过液相化学合成好的探针PCR技术扩增后的cDNA或基因组DNA经纯化定量分析后通过由阵列复制器arraying and replicating device ARD 或阵列点样仪arrayer及电脑控制的机器人准确快速地将不同探针样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或玻片相应位置上支持物应事先进行特定处理例如以带正电荷的多聚赖酸或氨基硅烷包被再由紫外线交联固定后即得到微阵列生物芯片点样的方式分两种其一为接触式点样[27]即点样针直接与固相支持物表面接触将样品留在固相支持物上其二为非接触式点样即喷点它是以压电原理将样品通过毛细管直接喷至固相支持物表面打印法的优点是探针密度高通常1平方厘米可打印2500个探针缺点是定量准确性及重现性不好打印针易堵塞且使用寿命有限喷印法的优点是定量准确重现性好使用寿命长缺点是喷印的斑点大因此探针密度低通常只有1平方厘米400点点样机器人有一套计算机控制的三维移动装置多个打印/喷印头一个减震底座上面可放内盛探针的多孔板和多个芯片根据需要还可以有温度和湿度控制装置针洗涤装置打印/喷印针将探针从多孔板取出直接打印或喷印于芯片上检验点样仪是否优秀的指标包括点样精度点样速度一次点样的芯片容量样点的均匀性样品是否有交叉污染及设备操作的灵活性简便性等等图1.5所示为点样仪实物图图1.5 点样装置实物图1.2.3 芯片检测芯片结果的判读要依据标记的报告分子的种类来设计判读装置最早是用同位素标记法需经过曝光显影然后用具有寻址功能的扫描仪扫读荧光标记是芯片信息采集中使用最多也是最成功的一种报告标记它没有同位素的使用限制应用激光作为激发光源的共聚焦扫描装置具有极高的分辨能力可以定量测读结果并可以有极高的灵敏度和定位功能目前已被普遍用于芯片杂交结果判读[28]进行平行分析时需要采用两种或更多不同波长的激光来激发2种或2种以上的荧光素来示差显示杂交结果此时氩离子激光器及氦氖激光器是较好的选择例如General Scanning公司的Scan Array 3000是双色荧光标记双激光激发的[29]而其后的Scan Array 4000和5000则是四激光激发四色荧光标记的气体激光器虽然在性能方面有巨大的优势但是其体积较大而且使用寿命短限制了它在扫描仪系统中的使用最新的扫描仪系统中有些使用半导体固体激光器它体积小寿命长价格便宜而且随着科学技术的不断发展半导体固体激光器的性能也在不断提高逐渐接近气体激光器的性能使用半导体固体激光器取代气体激光器是未来生物芯片扫描仪开发的趋势1.2.4 芯片数据提取与分析微阵列生物芯片数据分析简单来说就是对微阵列生物芯片的图像进行处理对图像中斑点的荧光信号进行定量分析通过有效数据的筛选和相关基因表达谱的聚类最终整合荧光斑点的生物学信息微阵列生物芯片在一块片基上集成了数十个至数万个点的识别分子每个点对应于一个基因或一段核酸DNA RNA片断或cDNA序列和反应测定的光密度值对于多色荧光染料标记的芯片还包括了荧光强度的比例信息同时芯片制作的目的制作的条件和方法样品的制备反应条件清洗条件和检测条件等信息均与该芯片对应可见在芯片的制作测定前后都有大量的信息数据需要处理因此需要有一个专门的系统来处理芯片的数据[30]一个完整的芯片数据处理系统应该包括芯片图像分析和数据提取芯片数据的统计学分析目前商用芯片数据处理软件层出不穷并不断有新的软件推出常用的有Axon Instruments公司的GenePix Pro软件Biodiscovery 的ImaGene系列Parkard的QuantArray等微阵列芯片数据提取与分析主要包括图像数据提取芯片数据标准化处理Normalization比率Ratio分析基因聚类分析Gene Clustering[31][32][33]1图像数据提取激光扫描仪扫描芯片得到的Cy3/Cy5图像文件通过图像滤波定位信号斑点提取得到基因表达的荧光信号强度值和背景值最后以列表或矩阵形式输出提取的数据结果由于芯片的制作反应清洗和测定过程中难免灰尘的污染以及测定样品中核酸蛋白质细胞和组织碎片的干扰或者由于芯片扫描仪的噪音往往产生较大的刺峰信号如果不予以消除将影响实验的结果[31] ImaGene采用一种中值过滤器的方法这种方法只能消除较尖细的刺峰干扰对于较粗大的刺峰不能剔除对一些较粗大的背景噪声可以通过对二值化后的图像的进行图像分割计算各分割区域的特征圆度较好并且面积也比较符合指标的区域即可认为是信号点面积太大超过指标的区域或者面积比较大并且圆度指标比较差的区域可以认为是噪声点也有人采用基于模糊数学以及神经网络的数字形态学方法构造不同尺寸不同形状的滤波算子,经腐蚀膨胀等运算提高图像的质量[34][35][36]点样仪在芯片上所点点阵为一个阵列形式但是由于点样的误差这个矩阵形式的点阵会出现一定偏差例如整个点阵的扭曲或点阵中斑点位置的偏移而且由于芯片上较大组织碎片或者灰尘的污染得到图像中会出现尺寸较大且亮度较高的噪声点这些点使用模式识别的方法较难排除因此较多的软件对斑点的识别仍然需要人为干预和帮助最常用的斑点识别方法是在图像中选择需要识别的区域输入芯片阵列的行列数斑点半径和阵列的行列间距由计算机自动产生一个圆圈整列套在芯片图像中使每个圆圈内包括一个斑点由于点阵排列的不完全规则需要手动对单个点进行调整通常的定量程序可以提供不同的确定斑点信号值和背景值的方法可以选择整个斑点区域确定信号强度但因为斑点内像素强度并不一致因此斑点内有效信号像素并不组成一个圆形在精确定量的情况下需要在斑点区域内分离有效信号像素和背景像素[37][38]背景的测量方法也不尽相同对于标准的玻片片基微阵列生物芯片阵列上不同位置的背景水平是不同的因此通常对不同斑点选取不同的背景常以斑点圆形区域外的一个环状区域作为斑点背景区域微阵列生物芯片中阵列各斑点提取的数据有斑点像素均值斑点区域内各像素灰度值的平均斑点的面积斑点区域内像素总数斑点像素中值斑点区域内各像素灰度值的中位值斑点像素标准差斑点区域内像素灰度值的标准差背景像素均值背景像素中值和背景像素标准差等推荐使用斑点区域和背景区域像素灰度的中值作为斑点强度和其背景强度下文中若无特别说明均采用此方法计算斑点强度此外对于双色荧光标记的芯片还需要提取阵列各个斑点2种不同荧光的强度值比[31]图像分析的目的是将扫描得到的微阵列生物芯片图像变成一个斑点强度数据阵列在数据提取完成后必须将各样点的数据输出大部分软件将提取的数据按芯片上点阵排列顺序以TXT文本文件的格式存入磁盘以便供其他的分析处理软件调用或者将此数据集输入到特定的关系型数据库中保存便于进一步的分析处理和查询2芯片数据标准化由于样本差异荧光标记效率和检出率的不平衡需对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正才能进一步分析实验数据芯片数据标准化正是基于此种。
生物芯片实验报告
实验名称：基因表达水平检测实验目的：1. 学习和掌握生物芯片技术的基本原理和操作流程。
2. 通过基因芯片技术检测特定基因在不同样本中的表达水平。
3. 分析实验数据，验证实验结果的可靠性。
实验材料：1. 基因芯片：包含待检测基因和对照基因。
2. 样本：待检测的组织或细胞。
3. 标准品：已知表达水平的对照样本。
4. 实验试剂：包括核酸提取试剂、PCR扩增试剂、杂交试剂、洗涤液等。
5. 仪器设备：PCR仪、杂交仪、荧光显微镜、凝胶成像系统等。
实验步骤：1. 样本处理：- 提取待检测样本的总RNA。
- 使用DNase I去除DNA污染。
- 通过RNeasy Mini Kit进行纯化。
2. cDNA合成：- 使用Oligo(dT) primers进行第一链合成。
- 使用Reverse Transcriptase进行第二链合成。
3. PCR扩增：- 使用PCR试剂进行目的基因的扩增。
- 通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
4. 标记：- 将扩增产物与荧光标记的寡核苷酸探针杂交。
5. 杂交与洗涤：- 将杂交后的芯片放入杂交仪中进行杂交。
- 使用洗涤液进行洗涤。
6. 扫描与分析：- 使用荧光显微镜或凝胶成像系统扫描芯片。
- 使用软件分析杂交信号，计算基因表达水平。
实验结果：通过实验，成功地将待检测基因的cDNA与荧光标记的探针杂交，并在芯片上得到了清晰的信号。
通过比较待检测样本与标准品的结果，可以判断待检测基因在不同样本中的表达水平。
数据分析：1. 对比待检测样本与标准品的信号强度，计算基因表达水平的相对值。
2. 分析不同样本之间基因表达水平的差异。
3. 对比实验结果与已知文献报道的结果，验证实验结果的可靠性。
结论：本次实验成功利用生物芯片技术检测了待检测基因在不同样本中的表达水平。
实验结果表明，生物芯片技术在基因表达水平检测方面具有高效、准确、高通量的特点，为基因功能研究和疾病诊断提供了有力工具。
实验讨论：1. 实验过程中可能存在的误差来源，如RNA提取、PCR扩增、杂交等步骤的误差。
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数据分析
• 根据检测出来的灰度水平来估计蛋白质表 达水平（拟合关系）
• 目前常用的芯片数据分析手段有数据归一 化分析、直观视图分析、统计学分析和生 物学分析
数据的归一化
• 归一化的方法可以用特定的对照，将各点 光密度值或比值除以所有点的平均值法， 或附带一些参数如平均值等以作为该芯片 的内部对照。
• 目前应用于基因芯片表达数据统计分析的 主要方法是聚类分析（Cluster Analysis）。 聚类分析是研究事物分类的一种方法，是 在事物分类面貌尚不清楚的情况下研究事 物的分类。其方法是直接比较样本中各指 标之间的性质，将性质相近的归为一类， 性质差别较大的归在另一类。
生物学分析
• 生物学分析是根据视图分析的结果，结合 生物学知识作出相关判断。时间过程分析 （time－course analysis）是用较多的一种 方法，可以用于分析细胞生长不同时期的 蛋白质表达、正常组织与肿瘤组织的蛋白 质变化、测定用药前后蛋白质发生的变化
直观视图分析
• 视图分析使最简单、最直接、最直观的分 析方法。通常用散点图（二维和三维）、 直方图和饼图直观地显示芯片表达的结果， 对于结果较为明显的数据，可以直接作出 判断。
Protein Array Assay Images
Control Sample
Treated Sample
统计学分析
相关软件的辅助
• 差异性分析 • 聚类分析
酿酒酵母蛋白组芯片
检测酿酒酵母蛋白质的糖基化
哺乳动物细胞的血凝素指纹
蛋白质芯片技术存在的问题及改进方向
1. 蛋白芯片的制作是其应用的关键因素 之一。目前蛋白芯片的制作方法较为 费时、成本较高，特别是涉及大量不 同种类的蛋白质的高效表达与纯化问 题需要解决。
Detection
Capture
Immobilization
蛋白质芯片原理示意图
蛋白质芯片的分类
按蛋白质性质分类 1. 无活性芯片：将已经合成好的蛋白质以
高密度阵列点样在芯片上，进行杂交反 应。 2. 有活性芯片：把生物体直接点在芯片上 ，并原位表达蛋白质。 按形式分类 1. 玻璃载玻片芯片（在玻璃表面构建） 2. 3-D胶芯片（在多孔凝胶垫上构建） 3. 微孔芯片（在微孔板上构建）
（1）用于肿瘤患者的辅助诊断、疗效判断、病 情监测、预后评估及判断肿瘤有无复发和转移 等。
（2）用于肿瘤高危人群的定期筛查。高危人群 主要是指45岁以上的人群、患各种慢性炎症和 各种慢性疾病的患者、有肿瘤家族史和肿瘤高 发区居民等。
（3）用于肿瘤分子流行病学调查及肿瘤生物学 研究。
3、抗体筛查。例如，对噬菌体抗体库一次 可对上万个不同的抗体克隆进行检测。 （S）
• 有人运用表面增强激光解吸电离 （ surface-enhanced laser desorption ionization ， SELDI ） 质 谱 来 检 测 低 密 度 蛋白质芯片。
• 原子力显微镜（atomic force microscopy， AFM）也可以作为蛋白质芯片的检测工 具。检测蛋白质芯片结合前后表面拓扑 学性质的变化。
2. 进一步改进基片材料的表面处理技术 与蛋白质固化技术，以减少蛋白质的 非特异性结合。
3. 提高芯片的点阵速度，以保持芯片表面 配基的稳定性和生物活性。
4. 改进蛋白质的标记技术，进一步提高信 号检测的灵敏度。
5. 进一步提高检测结果的分析方法，提供 高分辨率和灵敏度的成像设备与分析软 件，实现成像与数据分析一体化。
蛋白芯片的应用
蛋白质芯片的应用
1、用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸、蛋 白质-脂类等相互作用研究；特异性蛋白 质的筛选；功能蛋白质组研究。
例如，应用酵母蛋白质芯片进行钙调蛋白 的研究；应用磷脂酰肌醇来筛选磷脂酰 肌醇的结合蛋白。
2、疾病诊断的研究。目前，临床上应用的蛋白 质芯片主要是用于检测肿瘤标志物的蛋白质芯 片。它的应用范围主要在以下几个方面：
荧光标记方法
1. 一步标记法 • 用荧光蛋白或可以发光的小分子经过一步将
蛋白质作标记检测。 2. 二步标记法 • 先用一个可检测到的标签探针（如生物素）
将蛋白质标记后，再在第二步操作中用一个 合适的发光试剂作标记。 • 优点：灵敏度较高。 • 缺点：操作步骤相对复杂；有的蛋白质不适 合此种方法。
2. 无探针标记检测法
4、药物筛选、药代动力学研究。
5、在毒理学中的应用。
6、环境监测。
7、食品卫生安全的监测。
不同种类的蛋白质芯片的特点
蛋白芯片的特点
1. 高通量 2. 灵敏度较高 3. 重复性好 4. 操作自动化
操作步骤
1 . 将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻 片等各种载体上制成检测用的芯片。
2. 用标记了荧光分子的样品与芯片反应。 3. 经漂洗将未能与芯片上的蛋白质作用的成分洗去
。 4. 利用荧光扫描仪测定芯片上各点的荧光强度。 5. 通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质相互作用的关
系，测定各种蛋白质。
蛋白质芯片的检测方法
1. 探针标记检测法 2. 无探针标记检测法
1. 探针标记检测法
根据标记探针的特点大致分为两种： （1）荧光标记的探针 （2）放射性同位素标记的探针
荧光检测法
• 它是目前最常使用的检测方法。 • 特点：简单；安全；高灵敏度；可以和
基因芯片的扫描仪配合使用，这样可以 提高分析效率，适用于大量数据的采集 和分析。
生物芯片的数据分析
生物芯片
• 借助微加工和微电子技术，将大量已知序 列的核酸或蛋白质片段有序地组合在一个 微小基片表面,通过与标记的核酸或蛋白质 分子进行反应，分析待检标本的相应成分。
生物芯片的分类
• 基因芯片 • 蛋白芯片 • 组织芯片 • 细胞芯片
蛋白芯片
蛋白质芯片是将各种微量纯化的蛋白质阵列 在一种高密度的固相载体上，并与待测样 品杂交，以测定相应蛋白质的性质、特征 以及蛋白质与生物大分子之间的相互作用 的方法。