第12章荧光分析法

2、溶剂：
1）溶剂极性：极性↑→荧光波长↑，荧光强度↑ 原因：极性溶剂中，π→π*跃迁能量差ΔE小，使紫外 吸收波长和荧光波长均长移；跃迁几率增加，使荧光强度增 强。 2）溶剂粘度：粘度↓→荧光强度↓ 原因：溶剂粘度低，分子间碰撞机会增加，使无辐射跃 迁增加，使荧光减弱。 温度↑→溶剂粘度↓→荧光强度↓

（三）荧光试剂
弱/无荧光物质+荧光试剂→强荧光产物
1、荧光胺（fluorescamine）： 特点：与脂肪族和芳香族伯胺形成高度荧光衍生物。 荧光胺及其水解产物均不显荧光。 荧光条件：λex=275/390nm，λem=480nm。




2、邻苯二甲醛（OPA）： 特点：在2-巯基乙醇存在下，pH9-10的缓冲溶液中 能与伯胺类、特别是半胱氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸 外的α-氨基酸生成灵敏的荧光产物。 荧光条件：λex=340nm，λem=455nm。 例：测定磺胺类药物
内转换 S2
内转换 振动弛豫 系间跨越
S1
能 量 吸 收 T1 T2
发 射 荧 光
外转换
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l1
l2
l 2
l3


（二）荧光的激发光谱和发射光谱
激发光谱（excitation spectrum）：不同激发波长 的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。 绘制：固定发射波长，荧光强度（F）对激发波 长（λex）的关系曲线，其形状与吸收光谱相似。 荧光光谱（fluorescence spectrum）：在所发射的 荧光中各种波长组分的相对强度。 绘制：固定激发光波长和强度，荧光强度（F） 对发射波长（λem）的关系曲线。 荧光分析法通常采用λexmax与λemmax。

外转换及体系间跨越使荧光减弱甚至消失。

磷光发射
分子从单重态以体系间跨越跃迁到三重态后，再经 振动弛豫回到三重态最低振动能级，返回至基态的各个振 动能级而发出光辐射，称为磷光。 特点： 1）发射光量子，磷光波长较荧光更长； 2）时间较长，10-4-10s，甚至更长； 3）光照停止后，可持续一段时间； 4）在室温下很少产生磷光。

溶液的荧光强度 该溶液中荧光物质吸收光能的程度 荧光效率
条件：极稀溶液
二、定量分析方法

1、校正曲线法：
以荧光强度为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标。

2、比例法：
在线性范围内，测定标样和试样荧光强度，对比。

3、联立方程式法：
用于多组分混合物的荧光分析。
第三节 荧光分光光度计 和荧光分析新技术

2、荧光的产生
基态
光辐射
激发态
释放能量
基态

振动弛豫（vibrational relexation）
处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞， 能量传递给溶剂分子，电子返回到同一电子激发态的最低振 动能级。 特点：无辐射跃迁；只能在同一电子能级内进行；时间 约为10-12s；使大多数电子激发态处于其最低振动能级上。

外部能量转换（external conversion）：外转换
溶液中的激发态分子与溶剂分子或其他溶质分子之间相 互碰撞而失去能量，并以热能的形式释放能量的过程。 特点：无辐射跃迁；常发生在第一激发单重态或激发三重 态的最低振动能级返回基态的过程；降低荧光强度。

体系间跨越（intersystem crossing）
一、荧光分光光度计



滤光片荧光计：激发滤光片让激发光通过；发射 滤光片常用截止滤光片，截去所有的激发光和散 射光，只允许试样的荧光通过，不能测定光谱， 只用于定量分析。 滤光片-单色器荧光计：将发射滤光片用光栅代替， 不能测定激发光谱，可测定荧光光谱。 荧光分光光度计：两个滤光片都用光栅取代，可 绘制激发光谱和荧光光谱。

5、散射光：
一束平行单色光照射在液体样品上时，大部分光线透过溶 液，小部分由于光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发 生改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。 瑞利光：仅运动方向改变，无能量交换。 拉曼光：运动方向改变，并有能量交换，波长较入射光稍 长或稍短。 对荧光测定干扰的主要是波长比入射光波长更长的拉曼光。 消除：选择适当的激发波长。

荧光效率（fluorescence efficiency）： 荧光量子产率（fluorescence quantum yield），指激发态分子发射荧光的光子数与基态分 子吸收激发光的光子数之比，常用φf表示。 φf=发射荧光的光子数/吸收激发光的光子数 一般物质的荧光效率在0-1之间。大小取决于物 质分子的化学结构及环境（温度、pH 、溶剂等）。 荧光效率越高，荧光强度越强。

2、分子的刚性-共平面性
分子刚性-共平面性越强，荧光效率越大，荧光波长越长。

3、取代基
1）给电子取代基，如-NH2、-OH、-OCH3、-NHR、-NR2、-CN 等，能增加分子的π电子共轭程度，常使荧光效率提高，荧光 波长长移。 2）吸电子取代基，如-COOH、-NO2、-C=O、-NO、-SH、NHCOCH3、-F、-Cl、-Br、-I等，减弱分子的π电子共轭程度， 使荧光减弱甚至熄灭。 3）取代基对π电子共轭体系作用较小，如-R、-SO3H、 -NH3+等，对荧光影响也不明显。
处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性 发生变化的过程。如S1*的最低振动能级同T1*的最高振动能级重 叠，则可发生体系间跨越（S1*→T1*）。 特点：无辐射跃迁；发生在不同多重态之间（S1*→T1*）； 含有重原子如溴、碘等的分子，或溶液中存在氧分子等顺磁性 物质容易发生；使荧光减弱。

荧光发射
处于第一激发单重态最低振动能级的电子以辐射形式 发射光量子而返回至基态的任一振动能级上，发射的光量 子称为荧光。 特点： 1）发射光量子，且荧光波长总是长于激发光波长； 2）时间约为10-9-10-7s； 3）荧光谱线有时呈现几个非常接近的峰（电子返回到 基态不能振动能级，能级差不同，吸收波长不同）； 4）处于基态不同能级的电子会通过振动弛豫返回到基 态最低振动能级。

3、酸度：
荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的酸度对其荧光强 度有较大影响，因为在不同酸度中分子和离子间的平衡改变， 因此荧光强度也有差异。 如苯胺：在pH7-12溶液中主要以分子形式存在，发生蓝色荧 光；pH<2或pH>13的溶液中均以离子形式存在，不发射荧光。


4、荧光熄灭剂：
荧光熄灭：荧光猝灭，指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分 子相互作用引起荧光强度降低的现象。 荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质，如卤素离子、重金属离子、 氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。 作用机制： 1）荧光物质分子和熄灭剂分子碰撞而损失能量； 2）荧光物质分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的配位 化合物； 3）溶解氧的存在，使荧光物质氧化，或是由于氧分子的顺磁 性，促进体系间跨越，激发单重态的荧光分子转变至三重态； 4）浓度较大（超过1g/L）时，发生自熄灭现象。 荧光熄灭法（fluorescence quenching method）：荧光物质在 加入某种熄灭剂后，荧光强度的减弱和荧光熄灭剂的浓度呈线 性关系，利用这一性质测定荧光熄灭剂的含量的方法。

1、荧光分光光度计的主要部件：
激发光源：氙灯、高压汞灯、激光 激发单色器（样品池前）：光栅或滤光片 发射单色器（样品池后）：光栅或滤光片 样品池：石英 检测系统：光电倍增管


2、仪器的校正
（1）灵敏度校正： 用被检测出的最低信号来表示，或用某一对照 品的稀溶液在一定激发波长光的照射下，能发射出 最低信噪比时的荧光强度的最低浓度表示。 （2）波长校正： 用汞灯的标准谱线对单色器波长刻度校正。 （3）激发光谱和荧光光谱的校正
基态+hv→激发态 光谱中电子能级可分为二组： 1）电子自旋配对的（电子自旋方向相反，电子的净 自旋S=0，谱线多重性M=2S+1=1）称为单重态或单线 态，以S表示。 2）电子自旋非配对的（电子自旋方向相同，其净自 旋S=1，谱线多重性M=3）称为三重态或三线态，以T 表示。




激发单重态与相应的三重态的区别在于电子自旋方向 不同及三重态的能级稍低一些。 三重态寿命较长。
4、测定无机离子的荧光试剂 无机离子+有机化合物→配合物→直接测定荧光强度 加入无机离子（如CN-、F-等）
配合物荧光减弱或消失
荧光猝灭法
三、影响荧光强度的外部因素

1、温度：温度↑→荧光效率↓，荧光强度↓
原因：温度升高，分子运动速度加快，分子间碰撞几率 增加，使无辐射跃迁增加，从而降低了荧光效率。



特点： 1）灵敏度高 2）选择性好 3）方法简单快速，用样量少 4）应用受限
第一节 荧光分析法的基本原理
一、分子荧光 （一）分子荧光的产生 （二）荧光的激发光谱和发射光谱 二、荧光与分子结构 三、影响荧光强度的外部因素
一、分子荧光

（一）分子荧光的产生 1、分子的电子能级与激发过程

内部能量转换（internal conversion）：内转换
两个电子激发态之间的能量相差较小以致其振动能级有 重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电 子能级的过程。 特点：无辐射跃迁；两个电子激发态具有相同的多重性 （都是单重态或都是三重态，如S2*→S1*，T2*→T1*）。

处于激发单重态的分子通过振动弛豫和内转换，均可返回到 第一激发单重态的最低振动能级。

2、荧光光谱的形状与激发波长无关
基态分子跃迁到不同的激发态（如S1*，S2*）， 吸收不同的波长（如λ1，λ2），所以吸收光谱可 能有几个吸收带；但均回到第一激发单重态最低振 动能级后再发射荧光返回到基态，所以荧光发射光 谱只有一个发射带。