重组DNA技术
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DNA重组技术
MCS——多克隆位点（multiple cloining site， MCS） （1）MCS 是多个限制酶识别的一段DNA顺序， 以便克隆/插入外源基因/DNA片段，与之相关概 念有： （2）多聚接头（polyliker） 有些质粒载体单一 切点少，不能普遍使用。为了扩大使用范围，可 以加一段有许多限制酶识别的单一切点的多聚接 头。 （3）人工接头（linker） 是用若干个bp组成的 dsDNA片段，一般有一个或以上限制酶识别与切 割的顺序。
4、限制性内切酶的类型 限制性内切酶可分为三大类型： • 类型I和类型III ：由于识别位 点并非严格专一，很少被应用。 • 类型II ： 是DNA重组技术最为 常用的工具酶。
类型II 限制性内切酶的特点: • 识别位点严格专一 • 识别序列的碱基数一般为4、6、 8个bp • 识别位点经常是一种回文序列 的DNA
II、沸水浴法 a、菌体浮在含有EDTA的缓冲液中 b、加溶菌酶破细胞壁 c、放入沸水浴中煮40秒 d、离心，用无菌牙签挑去沉淀物 e、乙醇异丙醇沉淀
2、噬菌体载体 • 噬菌体的繁殖方式有两种： ①溶菌性方式（lytic ）： λ DNA先经多次复制合成 许多子代λ DNA，再装配成 许多子代的λ 噬菌体，最 后裂菌，释放出许多新的 λ 噬菌体。
• 稳定性：质粒在宿主细胞 中保持着一定的考贝数 • 寄生性：质粒只能在宿主 的细胞内复制 • 表现型：不同的质粒有不 同的表型，如对抗生素的 抗性等。
复制类型 • 严紧型质粒的复制受到宿主 细胞蛋白质合成的严格控制。
• 松弛型质粒的复制不受宿主 细胞蛋白质合成的严格控制。
（2）质粒DNA的构型 • SC构型:两条核苷酸链均保持着完 整的环形结构，DNA呈现超螺旋。 • oc构型:两条链中只有一条保持着 完整的环形结构，另一条链出现 缺口，称之为开环DNA。 • L构型:DNA的双链均发生断裂而形 成线性分子。
重组DNA技术基础
二、DNA的变性(denaturation) 定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。 方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、 酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。 变性后其它理化性质变化： OD260增高 粘度下降 浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变生物活性丧失
两条DNA单链分子反向平行环绕，右手螺旋走向，表面大沟与小沟相间。 螺旋直径为2nm， 主链：戊糖－ 磷酸骨架位于外侧 侧链：碱基对位于内侧 碱基平面垂直于螺旋轴 碱基距：0.34nm； 螺距： 3.4nm； 周长：1 0对碱基。
碱基形成氢键配对，配对形式为：A=T; GC） 。
05
核苷酸(ribonucleotide)
06
核苷（脱氧核苷）——磷酸
07
磷酸酯键
体内重要的游离核苷酸及其衍生物
cAMP
AMP
５. 核苷酸的连接
３，－５，磷酸二酯键
二、核酸的一级结构
定义： 核酸中核苷酸的排列顺序（碱基序列）。
书写方法
A
G
P
5 P
T
P
G
P
C
P
第二章 重组ＤＮＡ技术基础
目录
（一）核酸的分类
90%以上分布于细胞核，其余分布于核外如线粒体，叶绿体，质粒等。
分布于胞核、胞液。
(deoxyribonucleic acid, DNA)
(ribonucleic acid, RNA)
脱氧核糖核酸
核糖核酸
携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。
核 酸 的 理 化 性 质 The Physical and Chemical Characters of Nucleic Acid
两条DNA单链分子反向平行环绕，右手螺旋走向，表面大沟与小沟相间。 螺旋直径为2nm， 主链：戊糖－ 磷酸骨架位于外侧 侧链：碱基对位于内侧 碱基平面垂直于螺旋轴 碱基距：0.34nm； 螺距： 3.4nm； 周长：1 0对碱基。
碱基形成氢键配对，配对形式为：A=T; GC） 。
05
核苷酸(ribonucleotide)
06
核苷（脱氧核苷）——磷酸
07
磷酸酯键
体内重要的游离核苷酸及其衍生物
cAMP
AMP
５. 核苷酸的连接
３，－５，磷酸二酯键
二、核酸的一级结构
定义： 核酸中核苷酸的排列顺序（碱基序列）。
书写方法
A
G
P
5 P
T
P
G
P
C
P
第二章 重组ＤＮＡ技术基础
目录
（一）核酸的分类
90%以上分布于细胞核，其余分布于核外如线粒体，叶绿体，质粒等。
分布于胞核、胞液。
(deoxyribonucleic acid, DNA)
(ribonucleic acid, RNA)
脱氧核糖核酸
核糖核酸
携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。
核 酸 的 理 化 性 质 The Physical and Chemical Characters of Nucleic Acid
DNA重组技术
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② 工具酶
DNA重组技术中对DNA的“精雕细刻”主要用酶作 为工具。分子生物学研究过程中发现的酶，许多 都用作工具，所以称在核酸及有关研究中像基本 工具一样不可缺少的酶类为工具酶。这类酶包括 限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、末 端修饰酶、RNA聚合酶、逆转录酶等。
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限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
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PCR 的特点及应用： PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和 量要求低。因此，广泛应用于许多领域。 1. 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外 获得突变体、提供大量DNA用于测序等； 2. 遗传病的产前诊断； 3. 致病病原体的检测； 4. 癌基因的检测和诊断； 5. DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证； 6. 动、植物检疫； 7. 在转基因动植物中检查植入基因的存在。
限制性核酸内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶， 可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀； 是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。 是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚 合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶； 限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且 与电泳技术相结合还可以用于基因组酶切图谱的鉴定 以及法医鉴定等。 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开 创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。 13
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30
6 重组体的转化及鉴定
转化 转化过程是指将DNA重组体或质粒转到适宜的宿主细 胞中。通过这个过程，使目的基因片段得到大量扩 增、或产生需要的基因表达产物、或使宿主生物具 备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳 定遗传。 若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对 转化的大肠杆菌进行扩大培养使目的基因大量表达 和积累。通过对表达产物分离纯化便可获得想要的 产品。
重组DNA技术
一、定义
是指能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子。
克隆载体：用于在宿主细胞中克隆和扩增外源DNA片段。
表达载体：用于在宿主细胞中获得外源基因表达产物。
二、特点
1、具备复制能力。 2、具备一个或多个筛选标志。 3、具备较多拷贝数，易从宿主细胞中分离纯化。 4、具备一个或多个限制性内切酶的单一识别点（多克隆位
• 4.诊断疾病 基因诊断是一种使用DNA分析技术来检测和鉴定出疾病的方法。利用重组DNA技术，可以制造出一 些特定的探针或引物，用于检测和分析DNA序列的异常和变异。例如，肿瘤细胞或乳腺癌细胞中常常伴随着某些基 因的改变，可以利用重组DNA技术制备出一些与变异基因相对应的探针或引物，用于检测和诊断疾病。
ACG-OH TACTTAA-P
P-AATTCGT OH-GCA
-ACGAATTCGT-TGCTTAAGCA
3、DNA聚合酶
具有5`→3`聚合活性、5`→3`外切酶活性、3`→5`外切酶活性。 可用于合成双链cDNA分子或片断连接，探针制备，序列分析等。
4、碱性磷酸酶
去除DNA、RNA、dNTP和NTP 5ˊ端的磷酸根。 （1）5’端标记 （2）制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身 连接， 提高重组效率。
2.来源：原核生物
3.分类：根据结构、作用特点不同，分为三类。 Ⅰ型酶、Ⅲ型酶：具有限制切割与甲基化修饰活性，都没有多大的实用价值。 Ⅱ型酶：应用广泛，能在DNA分子内部的特异位点，识别和切割双链DNA，其切割位点 的序列可知、固定。
通常所说的限制性内切酶就是指Ⅱ型酶。
2、DNA连接酶
催化DNA中相邻的5ˊ端磷酸基和3ˊ-OH末端之间形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯键。 大肠杆菌连接酶，只能连接粘性末端，T4噬菌体连接酶不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。
重组DNA-分子克隆技术
202X
重组DNA技术 Recombinant DNA Techniques
单击此处添加正文具体内容
主要内容
CONTENTS
基本知识
实验流程
实验操作
01
相关问题
02
03
04
克隆与克隆化
01
克隆：指同一副本或拷贝的集合
02
克隆化：获取同一拷贝的过程称为克隆化。
03
分子克隆：为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多相同分子的集合。
粘端连接
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CGG C
C GGC
CGG C
C GGC
08
上幸存并形成菌落。
09
标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌
01
表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷
02
互补，那么就可以利用营养突变菌株进
03
行筛选，这就是标志补救筛选。
04
01
挑取单菌落，于液体培养基中培养；
03
对质粒进行限制性内切酶酶切；
05
根据酶切产物的大小，鉴定阳性克隆。
02
收集菌体，提取纯化质粒；
在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向
DNA合成体系中引入热稳定的Taq DNA聚
合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环
自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶促合
成，使目的基因按指数增长。
变性、退火、延伸三步曲
变性：双链DNA解链成为单链DNA
退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互
补部位相配对和结合
04
琼脂糖凝胶电泳检测；
酶切和电泳
挑取平板上生长的单菌落直接进行PCR；
重组DNA技术 Recombinant DNA Techniques
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主要内容
CONTENTS
基本知识
实验流程
实验操作
01
相关问题
02
03
04
克隆与克隆化
01
克隆：指同一副本或拷贝的集合
02
克隆化：获取同一拷贝的过程称为克隆化。
03
分子克隆：为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多相同分子的集合。
粘端连接
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CGG C
C GGC
CGG C
C GGC
08
上幸存并形成菌落。
09
标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌
01
表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷
02
互补，那么就可以利用营养突变菌株进
03
行筛选，这就是标志补救筛选。
04
01
挑取单菌落，于液体培养基中培养；
03
对质粒进行限制性内切酶酶切；
05
根据酶切产物的大小，鉴定阳性克隆。
02
收集菌体，提取纯化质粒；
在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向
DNA合成体系中引入热稳定的Taq DNA聚
合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环
自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶促合
成，使目的基因按指数增长。
变性、退火、延伸三步曲
变性：双链DNA解链成为单链DNA
退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互
补部位相配对和结合
04
琼脂糖凝胶电泳检测；
酶切和电泳
挑取平板上生长的单菌落直接进行PCR；
dna重组技术名词解释
dna重组技术名词解释
DNA重组技术是指通过将不同来源的DNA分子进行拼接、融合或交换,创造出新的基因或基因组的过程。
以下是与该标题相关的一些名词解释:
1. 重组DNA:指从不同来源的DNA分子中获取的DNA片段,这些DNA片段可以来自于同一物种的不同细胞、不同组织或不同来源。
2. 基因重组:指在基因组中发生的基因组合或序列替换,导致新的基因产生或改变生物的性状。
3. 基因编辑:指使用CRISPR等技术手段,对基因进行精确地剪切、删除、替换等操作,以调节或改变生物的性状。
4. 基因组重组:指不同物种之间的基因组重组,可能导致新物种的产生。
5. 非同源重组:指重组DNA中不同的DNA片段之间的非同源性结合,这种结合可能会导致新的基因产生或改变生物的性状。
6. 同源重组:指两个DNA分子中的相同序列之间的结合,这种结合通常不会导致新的基因产生或改变生物的性状。
7. 基因表达:指DNA信息被转化为蛋白质信息的过程,是生物学中非常重要的一个过程。
8. 基因敲除:指通过基因工程技术,去除目标基因的表达,以达到特定目的的过程。
9. 基因修饰:指对目标基因进行修饰,以改变其表达水平、稳定性或活性等特性。
10. 基因转移:指将从父或母物种中获得的DNA片段转移至另一个物种中的过程,通常用于改良植物、动物或微生物的遗传特性。
DNA重组技术在生物学、医学、工程学等领域都有广泛的应用,例如基因编辑、基因敲除、基因修饰、基因转移等。
这些技术的应用可以帮助人们更好地理解生命的基本原理,探究生命的奥秘,推动人类健康和社会进步。
基因工程1.0-DNA重组技术
理想克隆载体的特性
分子量小、多拷贝、松驰控制型 具有多种常用的限制性内切酶的单切点 能插入较大的外源DNA片段 具有容易操作的检测表型。 常用质粒载体大小在1kb至10kb之间，如pBR322、pUC系列、pGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。
4362 bp
pBR322 old-style general purpose plasmid
DNA重组技术示意图
One basic cloning technique begins with the insertion of a foreign gene into a bacterial plasmid.
Fig. 20.1
DNA重组技术
质粒、DNA或RNA提取(Extraction) 酶切（Enzyme digest) 连接（ligation) 转化（transformation) 筛选（selection) 蛋白表达（Protein expression)
5000g离心15分钟。 取上清,加入RNA酶A(10mg/ml), 37℃水浴20分钟。 加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀, 12000g离心10分钟。 取上层水相, 加入等体积氯仿,振荡混匀, 12000g离心10分钟。 取上层水相, 用70%冷乙醇洗涤，12000g离心5分钟。 倒置离心管，风干沉淀，溶于500ml TE或水中。
CTAB法的优缺点
优点：避免使用氯仿等腐蚀性试剂 缺点：得率较低
3、质粒DNA的大量提取
（A）碱法
取对数生长后期菌液250ml，5000g离心10分钟,弃上清, 离心管倒置使上清流尽。 细菌沉淀重悬浮于5ml溶液I中。 加入10ml新配制的溶液II, 缓缓地颠倒离心管数次,以混匀内容物,冰浴10分钟。 加10ml用冰预冷的溶液III, 摇匀离心管,冰置15分钟,此时形成白色絮状沉淀。
重组DNA技术
重组DNA技术
重组DNA技术
1 重组DNA技术的基本概念 2 重组DNA技术的基本原理 3 重组DNA技术所需的基本条件
1 重组DNA技术与基因工程的基本概念
A 重组DNA技术的基本定义
重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与
载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受
体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质
修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键 nick
OH P
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … P OH nick 5’
DNA连接酶
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G …
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：
BamHI SmaI
5‘ 3‘ …GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’ CGATGTACCTAGGGCCC AAGCGTA…5’ 5‘… … GCTACATG GATCCCGGG TTCGCAT…3’ 3‘ …CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA…5’ 5‘ …GCTACATGGATCCC 3‘ …CGATGTACCTAGGG GGGTTCGCAT…3’ CCCAAGCGTA…5’
MgCl2
NaCl DTT Volume TT
10 mM
0 - 150 mM 1 mM 20 - 100 ml 37 ℃ 1 - 1.5 hr
0 - 50 mM 低盐酶
100 mM 中盐酶
重组DNA技术
1 重组DNA技术的基本概念 2 重组DNA技术的基本原理 3 重组DNA技术所需的基本条件
1 重组DNA技术与基因工程的基本概念
A 重组DNA技术的基本定义
重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与
载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受
体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质
修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键 nick
OH P
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … P OH nick 5’
DNA连接酶
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G …
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：
BamHI SmaI
5‘ 3‘ …GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’ CGATGTACCTAGGGCCC AAGCGTA…5’ 5‘… … GCTACATG GATCCCGGG TTCGCAT…3’ 3‘ …CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA…5’ 5‘ …GCTACATGGATCCC 3‘ …CGATGTACCTAGGG GGGTTCGCAT…3’ CCCAAGCGTA…5’
MgCl2
NaCl DTT Volume TT
10 mM
0 - 150 mM 1 mM 20 - 100 ml 37 ℃ 1 - 1.5 hr
0 - 50 mM 低盐酶
100 mM 中盐酶
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载体DNA分子，需要具备：
具复制原点(ori)，在宿主细胞中不仅能独立地自我 复制，而且能带动携带的外源DNA片段一起复制
具有多克隆位点(multiple cloning site, MCS)，而每 一种酶的切点只有一个，用于克隆外源DNA片段。 这些酶切位点不存在于复制原点或抗性选择标记基 因内
Southern blot
Northern blot
analysis of BLTR mRNA
Tracing and Assaying Molecules Inside Cells
In situ hybridization for RNA localization in tissues.
Fluorescent In situ hybridization
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)
聚合酶链式反应是体外快速扩增DNA的方法
PCR反应包括三个步骤： 变性(denature)：在94-95℃使模板DNA的双链变性成单链 低温退火(annealing)：两个引物分别与单链DNA互补复性
延伸(extension)：在引物的引导及Taq酶的作用下，于72℃ 合成模板DNA的
☆现在广泛使用且商品化的质粒，很多都具有重组表型检 测标记，在DNA克隆中根据宿主细胞的表型即可推知质粒 是否携带外源DNA片段
λ噬菌体
◆ λ噬菌体基因组全长49kb。λ噬 菌体DNA中间约三分之二的序列为 中间基因簇，位于两端的为DNA左、 右臂。λ基因组的中间基因簇序列 可被外源DNA片段取代, 而不影响 噬菌体感染细菌及形成噬菌斑的能 力
至少具有一个选择标记基因，使有或无载体的宿主 细胞具有易鉴别的表型
易从宿主细胞中回收。 较小的相对分子量和较高的 拷贝数
安全性
载体(vector)的种类
细菌质粒载体 λ噬菌体 柯斯质粒(cosmid) 穿梭载体 酵母人工染色体（yeast artificial
chromosome，YAC） Ti质粒
基因工程重要特征：
可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系 的任何其他受体细胞中，可以任意改造ห้องสมุดไป่ตู้物的 遗传特性，创造出生物的新性状
某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备 大量纯化的DNA片段提供了可能
基因工程技术路线
DNA片段的取得（目的基因的分离和制备） DNA片段和载体的连接——重组体DNA 外源DNA片段引入受体细胞——基因克隆和基
限 制 性 内 切 核 酸 酶
粘性末端 平整末端
其它工具酶
T4 DNA连接酶(ligase) 反转录酶（reverse transcriptase)
载体(vector)
一个DNA片段只有与适合的载体(vector) DNA 连接构成重组DNA后，在载体DNA的运载下， 才可以高效率地进入宿主细胞(host cell)，并 在其中复制、扩增、克隆出多个拷贝。可作为 DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵 母菌人工染色体（BAC、YAC）等
这三个步骤称为一个循环，PCR反应常有25-35个循环
RT-PCR
限制性内切核酸酶
限制性内切核酸酶或限制性酶(restriction enzymes) 是细菌中这些酶的功能是降解外来DNA分子的一类 酶。以限制(restriction )或阻止病毒侵染
限制性酶据其作用特点，可分为两类 ※第Ⅰ类限制性酶每隔一段DNA序列随机切割双链 DNA分子，没有序列特异性 ※第Ⅱ类限制性酶能识别一段特异的DNA序列，准确 地酶切双链DNA的特异序列。第Ⅱ类限制性酶识别的 序列是对称的，即在一条链中从5’到3’方向的序列，与 其互补链从5’到3’方向的序列完全相同。这种从两个方 向阅读而序列相同的序列称为回纹对称序列 (palindrome)
重组DNA技术（基因工程）
基因工程 基因工程的风险和伦理学问题
基因工程
基因工程概述 基因工程的相关技术 基因工程的工具酶 载体 基因工程的基本步骤 基因工程的应用
基因工程的概念 genetic engineering
基因工程一般可分为广义和狭义的两种。广义的基因 工程包括：整体水平，如生物的有性杂交；细胞水平， 如细胞融合；分子水平，染色体工程、基因克隆等。 狭义的基因工程即是通常讲的基因克隆。因 筛选目的克隆 基因表达与产物分离
基因工程的相关技术
核酸的分子杂交 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction):
PCR和RT-PCR (reverse transcription PCR)
核酸的分子杂交
Southern blot-DNA Northern blot-RNA In situ hybridization Fluorescent In situ hybridization
◆ λ噬菌体载体可接受15 kb-23 kb 的外源DNA片段，它既可作为克隆 载体，也可作为表达载体，在基因 库筛选中，λ噬菌体作载体与细菌 质粒相比，具有易操作、阳性克隆
数多等特点，现广泛用于各类基因 库的构建
柯斯质粒(cosmid)
➢ 柯斯质粒(cosmid)是利 用部分λ噬菌体DNA与 部分细菌质粒DNA序 列组建而成的
目的: 是生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状， 并能稳定遗传。
基因工程的概念
genetic engineering
定义： 又称为重组DNA技术，指将某些特定的基因或DNA片 断，通过载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受 体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。基因工程是 采用分子生物学、核酸生物化学以及微生物遗传学的 现代方法和手段建立起来的基因操作技术。
细菌质粒载体
◆质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能 自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子
☆这些质粒的适应范围广，拷贝数多。进入宿主细胞复制 后，每个细胞的质粒拷贝数可高达1000个
◆早期用于基因工程的载体是经遗传改良的细菌质粒，它 们仅能用于克隆分子量小于10kb( 1000bp =1kb)的外源 DNA片段