慢病毒载体法制备红色荧光蛋白转基因小鼠
慢病毒载体法制备转基因动物研究进展
慢病 毒属于逆转 录病 毒科 。慢 病 毒感 染 宿主细
是最 常用 的转基 因方 法 ， 而慢 病 毒载 体技 术 属于 逆 转 录病毒 载体法 。 ２ 显微原 核注射 法和 逆转 录病毒载体 法 显微 原核注 射 法 是 最 常用 的转 基 因方 法 ， 实 在
胞后， 病毒 ＲＮＡ反转 录 为 ＤＮＡ后 可 以整合 到宿 主 细胞 的染 色体上并 长期稳 定表达 。与其他 逆转 录病
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动物 医学进展 。０ ８ ２ （ ） ６ —７ ２ ０ ， ９ ２ ：４６
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慢病 毒 载 体 法 制 备转 基 因动 物 研 究进 展
刘 吉 宏 。 李 峰 。 郝 子悦 ， ， ， 。 李碧 春 陈学进 。 ，
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细 胞 生 物学 研 究 所 ． 海 ２ ０ ３ ； ． 海 交 通 大学 医学 院 ． 海 ２ ０ ９ ） 上 ０ ０ ｌ ３上 上 ０ ０ ２
年美 国科学家 Ｐ ｌ ｔｒ ａｍｉ 等将 大 鼠生 长激 素 （ ｅ ＧＨ）基 因导人小 鼠受 精 卵雄 性 原核 中获 得 超级 转 基 因 鼠。
这种将外源性基 因用试 验方法 插人 动 物生殖 细胞 的
基 因组而获 得具 有插 人 基 因特 性 ， 能 正 常繁 衍 的 并
动物称 为转 基 因动 物 （ｔａ ｓｅ ｉ ａ ｉ ｌ） ｒｎ ｇ ｎｃ ｎｍａｓ 。转 基 因技术 已渗 透到 生 物学 、 医学 、 牧 兽 医 学 等领 域 ， 畜
小动物活体成像技术原理及常见问题分析
小动物活体成像技术原理及常见问题分析活体成像技术是指应用影像学方法，在不损伤动物的前提下，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。
通过这项技术可以非侵入式、直观地观测活体动物体内肿瘤的生长，转移、疾病的发展过程、基因的表达变化等生物学过程。
与传统剥瘤称重测量的方法相比，活体成像能够对同一种实验对象在不同时间点进行观察，跟踪同一观察目标(标记细胞及基因)，数据更加真实可信，成本更低，灵敏度更高。
目前活体成像技术主要采用生物发光（Bioluminescence）与荧光（Fluorescence）两种技术，生物发光技术是用荧光素酶（Luciferase）基因标记细胞或者DNA，而荧光技术则是应用荧光蛋白（如GFP,RFP,Mcherry等）标记细胞或是蛋白等研究对象。
其中生物发光技术因其操作简单，反应灵敏，在肿瘤，分子互作及信号传导等研究中得到了广泛应用。
LUC荧光素酶（Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是来自北美萤火虫（Photinus pyralis）体内的荧光素酶。
萤火虫荧光素酶属于加氧酶（oxygenase），其发光反应需要O2和Mg2+参与；有辅酶A（CoA）存在时能提高反应效率，增加发光时间。
萤火虫荧光素酶无需翻译后修饰，即可表现出荧光素酶活性。
将萤火虫荧光素酶的基因插入慢病毒介导的载体中，通过CAG启动子过表达从而作为报告基因，在细胞中表达。
常用于细胞标记后小动物细胞移植活体成像追踪，从而评估移植后细胞的归巢以及治疗效果等。
GFP绿色荧光蛋白1962年在一种学名Aequoreavictoria的水母中发现。
其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。
这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子（Ca2+）可产生交互作用。
将绿色荧光蛋白的基因插入慢病毒介导的载体中，通过flap-Ub启动子过表达从而作为报告基因，在细胞中表达。
慢病毒载体介导的转人ahsp基因的β654地中海贫血小鼠的制备
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文章编号： Ｏ—０２Ｏ８６０３一３ １ ９０Ｏ（０） —８３Ｏ ０ ２ ０
研 究 报告
慢病毒载体介导的转人 ａｓ 因的 Ｉ ｈｐ基 ３ 地 中海贫血小鼠的制备
王宝斌 ， 或聃 ， 歆冰 ， 兆瑞 ， 方 郭 任 张敬 之
上 海 交通 大 学 医 学遗 传 研 究所 ， 生部 医 学胚 胎 分 子 生 物 学 重 点 实验 室 暨上 海 市胚 胎 与 分 子 生物 学重 点 实验 室 ， 卫 ｏ Ｂ ｎ ＡＮＧ ｕ Ｄａ ，ＧＵＯ Ｘｉ－ ｉｇ Ｙ － ｎ ｎ Ｂ ｎ ，ＲＥ Ｚ ａ － ｉ ＨＡＮＧ Ｊｎ － ｈ Ｎ ｈ ｏ Ｒｕ，Ｚ ｉｇ Ｚ ｉ
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慢病毒载体在制备转基因动物中的最新进展
慢病毒载体在制备转基因动物中的最新进展
谭碧君
【期刊名称】《上海畜牧兽医通讯》
【年(卷),期】2010(000)001
【摘要】@@ 慢病毒 (Lentivirus)属于逆转录病毒科(Retrovidae),为RNA病毒,由于这类病毒的一个重要特点是毒粒中含有依赖 RNA的多聚酶即逆转录酶 ,故现名为逆转录病毒[1].慢病毒载体(Lentivirus vectors)与简单的逆转录病毒载体相比,具有可感染分裂细胞及非分裂细胞,转移基因片段容量较大,目的基因表达时间长,不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为当前制备转基因动物的载体之一.性.近些年发展的慢病毒载体不论从理论上还是实践中都具有广阔的应用前景.
【总页数】2页(P18-19)
【作者】谭碧君
【作者单位】长沙理工大学化学与生物工程学院,湖南,长沙,410077
【正文语种】中文
【相关文献】
1.慢病毒载体在转基因动物研制中的应用 [J], 刘茵
2.慢病毒载体法制备转基因动物研究进展 [J], 黄黎珍;刘光泽;顾为望
3.慢病毒载体法制备转基因动物研究进展 [J], 刘吉宏;李峰;郝子悦;李碧春;陈学进
4.转基因动物中慢病毒载体包装的优化 [J], 谭碧君
5.用慢病毒载体制备转基因动物的研究进展 [J], 邓继先;沈伟
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红色荧光和绿色荧光转基因小鼠模型的建立
红色荧光和绿色荧光转基因小鼠模型的建立冯娟*，高苒*，全雄志，邸冉，董伟，马春梅，黄澜，刘亚莉，曹兴水，秦川**，张连峰**（中国医学科学院实验动物研究所中国协和医学院比较医学中心，北京100021）【摘要】目的建立红色荧光和绿色荧光转基因小鼠，为活体荧光影像系统建立重要的实验动物模型。
方法把DsRed-Express和EGFP基因插入chickenβ-actin 强启动子下游构建转基因载体，建立红色荧光和绿色荧光转基因C57BL/6J小鼠。
PCR鉴定红色荧光和绿色荧光转基因小鼠的基因表型，活体荧光影像系统分析红色荧光和绿色荧光转基因小鼠，荧光显微镜检测红色荧光和绿色荧光转基因小鼠全身组织器官的病理改变。
结果分别建立了3个系的红色荧光和3个系的绿色荧光转基因小鼠。
活体荧光影像系统分析转基因小鼠分别呈现红色荧光和绿色荧光。
经荧光显微镜观察，DsRed-Express转基因小鼠的红色荧光蛋白在多个组织器官中才表达，尤其在胰腺、肝脏、肾脏和脾脏等器官表达量较高。
EGFP转基因小鼠绿色荧光蛋白在全身各个组织器官中表达，尤其在胰腺、心脏、小肠、外周血细胞和脑组织等器官组织中表达量较高。
结论DsRed-Express和EGFP基因在转基因小鼠中系统性高表达，成功建立了红色荧光和绿色荧光转基因小鼠。
DsRed-Express和EGFP转基因小鼠将成为活体荧光影像系统的重要实验动物模型。
【关键词】RFP；GFP；转基因；动物模型T he establishment of the Red Fluorescenceand Green Fluorescence Transgenic Mouse ModelsFeng Juan*,Gao Ran*,Quan Xiongzhi,Di Ran,Dong Wei,Ma Chunmei,Huang Lan,[基金项目]北京市转基因平台建设项目TC2006-02（Z0006303041231）[作者简介]*共同第一作者；冯娟（1978-），博士研究生，研究方向：分子病理学。
慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠T淋巴细胞中的表达
慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠T淋巴细胞中的表达【摘要】本研究构建含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体三质粒系统，并观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。
应用亚克隆技术将多聚嘌呤通道（PPT）元件、泛醌启动子（PUB）和绿色荧光蛋白基因（GFP）连接至pLO134载体，构建成pTK153载体。
之后应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统（包括包装质粒△NRF、转移质粒pTK153和包膜蛋白质粒VSV G）共转染293T细胞，12小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，72小时收集病毒上清并感染小鼠T淋巴细胞，在荧光显微镜下和应用流式细胞仪（FACS）观察感染情况。
结果表明：慢病毒载体的三质粒系统转染293T细胞12小时后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达，FACS分析转染效率为（63.04±7.24）%，病毒滴度测定为（3.09±0.61）×106 U/ml。
感染小鼠T淋巴细胞后，荧光显微镜下观察到GFP的表达，FACS分析转导效率为（37.98±6.26）%。
结论：成功构建了含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体，对小鼠T淋巴细胞有较高的感染效率。
【关键词】慢病毒载体 T淋巴细胞绿色荧光蛋白基因Expression of Green Fluorescent Protein Gene in Mouse T Lymphocytes Mediated by Lentiviral VectorKey words lentiviral vector; mouse T lymphocytes; green fluorescent protein geneJ Exp Hematol 2007; 15(1):125-128逆转录病毒载体（retroviral vector， RV）系统已被广泛应用于临床前及临床的基因转移研究，虽然对其复制以及转导外源目的基因至细胞的相关机理研究得较为深入，但是逆转录病毒载体不能有效转导非分裂期细胞，因而其应用于临床基因治疗受到了一定的限制［1］。
鼠VEGF红色荧光慢病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达
鼠VEGF红色荧光慢病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达王东洋;贾路;陈翀;李艳杰;曾令宇【期刊名称】《四川大学学报：医学版》【年(卷),期】2010(41)2【摘要】目的构建含鼠血管内皮细胞生长因子(mVEGF)红色荧光慢病毒载体,鉴定其在293T细胞中的表达。
方法构建含mVEGF和红色荧光蛋白(DsRed)基因双顺反子重组慢病毒质粒;采用脂染法将慢病毒系统三质粒共转染293T细胞,转染后24 h和48 h荧光显微镜下观察DsRed表达,收集48 h和72 h病毒上清并感染靶细胞239T,荧光显微镜下观察DsRed表达情况,并行Western blot分析培养上清和胞浆内mVEGF表达。
结果成功构建慢病毒表达质粒pTK208-mVEGF-IRES-DsRed,重组慢病毒滴度达5×106PFU/mL,并获得蛋白DsRed和mVEGF的表达。
结论含mVEGF红色荧光慢病毒质粒成功介导mVEGF蛋白的表达,该载体有望为研究VEGF的病理生理学机制及基因靶向治疗提供有效的工具。
【总页数】5页(P199-202)【关键词】慢病毒载体;血管内皮细胞生长因子;红色荧光蛋白;293T细胞【作者】王东洋;贾路;陈翀;李艳杰;曾令宇【作者单位】徐州医学院移植免疫实验室;徐州医学院附属医院血液科实验室【正文语种】中文【中图分类】R392.4【相关文献】1.人骨诱导因子和绿色荧光蛋白基因共表达慢病毒载体的构建和鉴定及在HT-29细胞中的表达 [J], 霍永旭;李宇;刘雁军;郭元彪;杨春蕾;赵聪2.大鼠硬脂酰辅酶A去饱和酶1重组慢病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达[J], 蔡德丰;范建高;陆元善;刘兰;蔡小波3.小鼠骨生成诱导因子基因逆转录病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达 [J], 郑翠侠;张晓娜;韩兵;宋怀东;马勤耘4.人IL-17F重组逆转录病毒载体的构建及其在293T细胞中的稳定表达 [J], 谢宇锋;盛伟华;缪竞诚;杨吉成5.人釉原蛋白基因重组慢病毒载体的构建及在293T细胞中的表达 [J], 程岚;束蓉;宋忠臣;张秀丽;薛京伦;陈金中;田聆;黄璐因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
慢病毒载体法制备红色荧光蛋白转基因小鼠
慢病毒载体法制备红色荧光蛋白转基因小鼠贾俊双;孙妍;姚开泰;肖东;肖高芳;林晓琳;张晟;姚志芳;杜文婷;申红芬;刘科;饶子亮【摘要】目的利用慢病毒介导的转基因方法制备红色荧光蛋白(mRFP)转基因小鼠,并建立转基因小鼠的技术平台.方法将携带mRFP基因的慢病毒注入ICR鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,胚胎移植进假孕母鼠以获得仔代鼠,然后应用小动物活体成像仪、体视荧光显微镜和PCR等鉴定并获得mRFP转基因鼠.结果移植卵周隙注射有慢病毒的胚胎40枚给2只假孕母鼠,共获得仔鼠6只;利用体视荧光显微镜检测mRFP表达,在蛋白水平证实6只F0代中,2只 (R3和 R4) 鼠耳高表达mRFP,其余的弱表达mRFP(R1、R2和R5)或荧光强度(R6)与野生型ICR鼠无明显差别,而DNA水平检测证实,6只F0代中,5只(R1、R2、R3、R4和 R5)基因组中整合有外源转基因hUb-mRFP,预示基因型鉴定结果很好验证了体视荧光显微镜鉴定结果.此外,mRFP转基因首建鼠基因组中整合的mRFP基因可稳定遗传和表达.结论建立了慢病毒法快速制备转基因小鼠的技术平台,这为针对不同基因建立相应转基因小鼠以实现恒定或条件性的转基因过表达或RNA干涉 (RNAi),并进而在体内解析相应基因功能和建立人类疾病模型等奠定了坚实基础.【期刊名称】《中国比较医学杂志》【年(卷),期】2010(020)002【总页数】6页(P12-16,后插1)【关键词】红色荧光蛋白;慢病毒载体法;转基因小鼠【作者】贾俊双;孙妍;姚开泰;肖东;肖高芳;林晓琳;张晟;姚志芳;杜文婷;申红芬;刘科;饶子亮【作者单位】南方医科大学,肿瘤研究所;南方医科大学,肿瘤研究所;南方医科大学,肿瘤研究所;南方医科大学,肿瘤研究所南方医科大学,比较医学研究所暨实验动物中心,广州,510515;南方医科大学,肿瘤研究所;南方医科大学,肿瘤研究所;南方医科大学,比较医学研究所暨实验动物中心,广州,510515;南方医科大学,肿瘤研究所;南方医科大学,肿瘤研究所;南方医科大学,肿瘤研究所;南方医科大学,广东省医学实验动物中心,广州,528248;南方医科大学,广东省医学实验动物中心,广州,528248【正文语种】中文【中图分类】Q78;Q812转基因小鼠已成为研究基因功能、开展发育生物学研究、建造人类疾病动物模型及研究人类疾病发病机制等的最重要的和最佳的模式实验动物［1］。
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对 不 同基 因建 立 相 应 转 基 因小 鼠 以实 现 恒 定 或 条 件性 的转 基 因过 表 达 或 Ｒ Ａ干 涉 （ Ｎ ｉ， 进 而 在 体 内解 析 相 Ｎ Ｒ Ａ）并 应 基 因功 能 和建 立 人 类 疾 病 模 型 等 奠 定 了坚 实 基 础 。
【 关键词】 红色荧光蛋 白； 慢病毒载体法 ； 转基 因小 鼠 【 中图分类号】Ｑ ８ Ｑ １ ７ ．８ ２ 【 文献标识码 】Ａ 【 文章编号 】１７ — ５ （０ ０ ０ － １－５ ６ １７ ６ ２ １ ）２０ ２０ ８ ０
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２１ ０ ０年 ２月
中 国 比较 医学 杂 志
Ｃ ＮＥＳ ＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＯＭＰ ＨＩ ＥＪ ＡＲＡＴＩ ＤＩ Ｉ ＶＥ ＭＥ Ｃ ＮＥ
Ｆ ｂｕ ｒ ｅ ｒ ａｙ，２ １ ００ Ｖｏ ． Ｏ Ｎｏ ２ Ｉ２ ．
第２ Ｏ卷
第 ２期
慢病 毒 载体 法 制备 红色荧 光 蛋 白转 基 因小 鼠
ｍ ＲＦＰ ａ ｓ ｅ ｉ ｉ ｅ Ｇｅ ｒ ｔ ｄ ｂｙ Ｌｅ ｔｖ ｒ ｓ Ｍ ｅ ａ ｅ ｎ ｌ ｅ ｙ Ｔｒ ｎ ｇ ｎ ｃ Ｍ ｃ ｎｅ ａ ｅ ｎ ｉ ｉ ｕ － ｄｉ ｔ ｄ Ｇｅ ｅ Ｄｅ ｉ ｒ ｖ
ＪＡ Ｊ ｎ ｓ ｕ ｎ Ｉ ｕ ．ｈ ａ ｇ ，ＸＩ ａ ．ａ ｇ ，Ｌ Ｎ Ｘｉｏ ｌ ＡＯ Ｇ ｏ ｆ ｎ Ｉ ａ — ｎ ，ＺＨＡ ｈ ｎ ，ＹＡＯ Ｚ ｉ ａ ｇ ｉ ＮＧ Ｓ ｅ ｇ ｈ — ｎ ，ＤＵ Ｗｅ — ｎ ， ｆ ｎｔ ｇ ｉ
贾俊 双 ，肖高 芳 ， 晓琳 张 晟 姚 志 芳 杜 文婷 申红 芬 刘 科 林 ， ， ， ， ， ，
饶 子 亮 ，孙பைடு நூலகம் 妍 ，姚 开泰 ， 东 肖
（ 方 医科 大学 １ 南 ．肿 瘤 研 究 所 ，．比较 医学 研 究 所 暨 实 验 动 物 中 心 ， 州 ２ 广 ３ ．广 东 省 医学 实 验 动 物 中 心 ， 州 广 ５８４ ） ２２ ８ ５０１ ； １５ ５
【 要 】 目的 摘
利 用 慢 病 毒 介 导 的转 基 因方 法 制 备 红 色 荧 光 蛋 白 （ Ｆ ） 基 因小 鼠 ， 建 立 转 基 因 小 鼠的 ｍＲ Ｐ 转 并
技 术 平 台 。 方法 将 携 带 ｍＲ Ｐ基 因 的慢 病 毒 注 入 Ｉ Ｒ鼠单 细 胞 受 精 卵 卵 周 隙 以感 染 受 精 卵 ， 胎 移 植 进 假 孕 母 Ｆ Ｃ 胚
ｄ ｌ ｅ ｆ ｏｅｇ ｅ ｅ（ ） ｉｔ ｚｇ ｔｓ ｅｉ ｒ ｏ ｒｉｎ ｇ ｎ Ｓ ｎｏ ｙ ｏｅ ．Ｍｅｈ ｄ Ｍｏ ｏ ｒ ｅ ｕ ｒｓｅ ｔｐｏｅｎ （ ｖｙ ｆ ｔｏ ｓ ｎ ｍｅｉ ｒｄ ｆ ｏｅｃ ｎ ｒｔｉ ｍＲＦ ｃ ｌ Ｐ）ｔ ｎ ｇ ｎｃ ｍｉｅｗｅｅ ｒ ｓｅ ｉ ａ ｃ ｒ ｇ ｎ ｒｔｄ ｂ ｕ ｚ ｎ ｌｉｊｃｉｎ ｏ ｅ ｔ ｉ ｓ ｈ ｒｏｉｇ ｍＲＦ ｅ ｅ ｉｔ ｉｇｅｃ ｅｔｉｅ ｇ ｓ ｏ Ｃ ｍｉｅ ｔ ｎｅ ｔ ｅ ｅａｅ ｙｓ ｂ ｏ ａ ｎｅ ｔ ｆｌｎｉ ｒ ａｂ ｒ ｏ ｖｕ ｎ Ｐ ｇ ｎ ｎｏ ｓｎ ｌ・ｄｌｆｒｉｚｄ ｅｇ ｆＩ Ｒ ｃ ｏ ｉｆｃ ｌ
鼠 以 获 得仔 代 鼠 ， 后 应 用 小 动 物 活体 成 像 仪 、 视 荧 光 显 微 镜 和 Ｐ Ｒ等 鉴 定 并 获 得 ｍＲ Ｐ转 基 因 鼠 。结 果 移 然 体 Ｃ Ｆ
植 卵周 隙 注射 有 慢 病 毒 的胚 胎 ４ ０枚 给 ２只假 孕 母 鼠 ， 获得 仔 鼠 ６只 ； 用 体 视 荧 光 显 微 镜 检 测 ｍ Ｆ 共 利 Ｒ Ｐ表 达 ， 蛋 在 白 水平 证 实 ６只 Ｆ ０代 中 ， ２只 （ ３和 Ｒ ） 鼠耳 高 表 达 ｍ Ｆ ， 余 的 弱 表 达 ｍ Ｆ （ １ Ｒ Ｒ ４ Ｒ Ｐ其 Ｒ Ｐ Ｒ 、 ２和 Ｒ ） 荧 光 强 度 ５或 （ ６ 与野 生 型 Ｉ Ｒ 鼠无 明 显 差 别 ， Ｄ Ａ水 平 检 测 证 实 ， Ｒ） Ｃ 而 Ｎ ６只 Ｆ ０代 中 ， ５只 （ １ Ｒ 、 ３ Ｒ Ｒ 、 ２ Ｒ 、 ４和 Ｒ ） 因组 中 整 合 ５基 有 外 源转 基 因 ｈ ｂｍＲ Ｐ， 示 基 因型 鉴 定 结 果 很 好 验证 了体 视 荧 光 显 微 镜 鉴 定 结 果 。此 外 ， Ｒ Ｐ转 基 因 首 建 鼠 Ｕ— Ｆ 预 ｍ Ｆ 基 因组 中整 合 的 ｍＲ Ｐ基 因 可稳 定 遗 传 和 表 达 。结 论 Ｆ 建 立 了慢 病 毒 法 快 速 制 备 转 基 因小 鼠 的 技 术 平 台 ， 为 针 这