软骨细胞培养
兔膝骨关节炎软骨细胞体外培养体会
兔膝骨关节炎软骨细胞体外培养体会骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨进行性退变病变慢性疾病，近些年发病率在不断增高。
基础研究主要有各种原因引起的细胞数量过少而无法开展下去。
在建立动物模型的基础上更有效的提取软骨细胞、体外培养对基础研究做出最基本铺垫，为临床治疗提供更有效的理论依据。
本文通过软骨的提取、软骨的消化、细胞的收集、培养、鉴定，结合国内外文献做一综述。
标签：骨关节炎；软骨细胞；体外培养软骨组织﹙cartilage）由软骨细胞﹙chondrocyte）和细胞外基质﹙extracellularmatrix，ECM﹚构成，软骨细胞是关节软骨主要构成成分，主要功能是合成、分泌软骨基质，维持软骨组织新陈代谢，是软骨破坏过程中的靶细胞，因此软骨细胞的体外培养是研究关节软骨生理及病理的常用体外实验模型，尤其是骨关节炎软骨细胞的提取在研究治疗骨关节炎、最基本最关键的一步[1]。
自从1967年Manning[2]采用胰蛋白酶和细菌胶原酶联合消化法获得了高纯度的软骨细胞以来，为了获得数量较多的软骨细胞，软骨细胞的提取、培养、传代、鉴定，等不断改进。
但不同的动物，不同的模型对软骨细胞的提取也有一定的不同。
本文通过对兔膝骨关节炎造模成功后提取软骨细胞进行培养、传代、鉴定进一步认识兔膝骨关节炎软骨细胞体外培养的要点及关键问题等。
1软骨的提取将实验兔用空气栓塞法处死，沿右膝关节正中纵行切开皮肤直至暴露出以膝关节为中心约6 cm×6 cm的区域，浸泡于75%的酒精中20～30 min，放入超净台中打开膝关节腔，无菌条件下用11号刀片（带柄）削取膝關节股骨髁和胫骨平台软骨组织，将获得关节软骨组织，置入盛有含青霉素钠/链霉素双抗液（1×1010U/L）的D-hanks液的无菌平皿中，用含双抗液（1×109U/L）的D-hanks 液10 mL漂洗3遍，用眼科剪将软骨组织剪成1mm3小块，见图1，然后再用含双抗液（1×109U/L）的D-hanks液10 mL漂洗3遍。
一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法
一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法我折腾了好久原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，总算找到点门道。
一开始的时候，我真是瞎摸索，完全是在黑暗中前行。
我先说说取材这步吧。
从小鼠或者大鼠身上取软骨，这可真不是个容易事儿。
我一开始的时候啊，手法特别不熟练。
你想啊，找到准确的软骨部位就像在一堆电线里找到那根特殊颜色的线一样难。
有一次我不小心把周围的组织也切了不少，结果肯定是不理想的。
后来我就看了很多解剖的图，还专门找会的人请教了几次。
这才慢慢熟悉起来。
就是要很小心地沿着关节切，尽量只取到软骨组织。
取得软骨组织后就是消化了。
我试过好几种酶，像胰蛋白酶还有胶原酶什么的。
胰蛋白酶消化的时候，我发现时间特别难控制。
有一回消化时间长了一点，细胞都损伤了不少。
后来我就慢慢试，就像做饭试调料一样，一点一点找感觉。
胶原酶相对来说要温和一些，但也要注意浓度。
合适的浓度就像是刚好能开锁的钥匙，太浓或者太淡都不行。
分离完细胞下一步就是培养了。
培养条件真的是需要精心调整。
我在培养瓶的选择上也纠结了挺久。
普通的培养瓶感觉细胞的贴壁不是很理想。
后来换了那种专门对细胞贴壁有帮助的培养瓶，情况才好一些。
还有培养液，它得包含细胞生长需要的所有营养成分啊，像氨基酸、糖、维生素这些，那都是细胞的食物呢。
我一开始没把温度和二氧化碳浓度太当回事儿，结果细胞长得歪歪扭扭的。
后来严格把温度和二氧化碳浓度控制在合适的范围，细胞才比较茁壮地生长。
还有细胞每过一段时间就得看看它们的状态，就像看自己养的小宠物一样。
如果发现有污染了，那前面的努力可就白费了。
有一回就因为一点小小的疏忽，培养物被污染了，整个心血都付诸东流了，那个时候可沮丧了。
后来就很注意无菌操作，一切步骤都特别小心。
这培养原代软骨细胞啊，真的是个细致活儿，要不断尝试总结经验，每一个小的失误都可能导致失败。
我现在也不敢说就完全掌握了这方法，但好歹能有点成果出来。
我还想不断改进呢，也欢迎你有啥心得也跟我交流交流。
软组织工程研究：软骨细胞的培养
型和 Ⅲ 合成基质 ，最终难于形成软骨组 织。而生物相 容性 良好 养过程 中向成纤维细胞样转化 ，细胞 开始表达 Ｉ 和生物可降解性 细胞载体 的应 用 ，能为软骨 细胞提供 理 型胶原 ，并逐渐丧 失分泌软 骨基质 能力。体外培养的软 想的表 面 支持 和稳 定的三 维空间支架结构 ，以及 足够的 骨细胞是研 究软 骨分化以及 细胞 因子、生长 因子对软骨 孔 隙率 ，供 细胞在其 中进行物质 交换 、生 长代谢 和分泌 细胞表型促进 或抑 制作用 的一种 必要 的实验模 型。对 于 软骨基质 。以三 维立体培 养为基础 的组织 工程技 术在软 用组织 工程技 术构建软骨的软骨 细胞 来说 ，研究其体外 骨细胞培养方 面 已取得 突破 性进展 。用软组 织工程技 术 培养 时细胞 外基质 的分泌情 况，一方面可以 了解软骨 细 构建 软骨 的重要 条 件之 一就是 获得 一 定数 量 的软骨 细 胞的功 能状 态；另一 方面，任何体 细胞 在体外培养过程 中都有 一定生存期 ，不可能无限制地生长 ，对软骨 细胞 胞 ，体外培养 、扩增 并保持 一定的功 能活性 。
｜ ＳＳＮ １ ７ ． ２ ５ ＣＮ １ １ ３９ Ｒ ６ ３８ ２ ２ ．５ ， ｃｏＤＥＮ： ＫＨＡＨ ＺＬ
节盘及耻 骨联 合等处；弹性软骨分布 于耳廓 等处。软骨
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学部 软 织程 究软 细 的养 术 ＿ ： 组 Ｉ 研 ： 骨 瞻 培
中 国组 织 工 程 研 究 与 临 床康 复
劳 ７ ４誊 笫 ４ ７
２１ ０ ０—１ ０—０ ８出 版
Ｊ ｕｒａ ｉｉａｌＲｅ ｂｌａｉｅ ｉｓ ｅ ｎ ｏ ｎ ｌｏｆＣｌ ｃ ｈａ ｉｔｔ Ｔｓ ｕ Ｅ ｇｍｅｅ ｎ ｓ ａ ｃ Ｏｃｏ ｅ ．２ ０ Ｖ Ｌ１ ，Ｎｏ４１ ｎ ｉ ｖ ｎ ｇ Ｒｅ ｅ ｒ ｈ ｔｂ ｒ ８ ０１ ｏ ４ ．
软骨细胞培养流程
软骨细胞培养流程
《软骨细胞培养流程》
软骨细胞培养是一种重要的实验技术，用于研究软骨细胞的生长、增殖和分化。
软骨细胞是一种特殊的细胞，具有重要的支持和维持软骨组织结构和功能的作用。
软骨细胞培养流程需要一系列精细的操作和严格的实验条件。
首先，要获得软骨组织样品，可以从实验动物或人体骨骼中获取。
然后将软骨组织样品切割成小块，并用消化酶处理，以释放软骨细胞。
接下来，将释放的软骨细胞收集并进行离心，去除异物和细胞碎片。
然后将软骨细胞将种植到培养皿中，添加适当的细胞培养基，并将培养皿放入细胞培养箱中进行培养。
在细胞培养过程中，需要密切观察软骨细胞的生长状态，定期更换培养基，并进行细胞传代。
此外，还需要进行细胞鉴定、纯化和分化培养等步骤，以确保所培养的细胞具有良好的生长和分化能力。
软骨细胞培养流程需要严格控制细胞生长环境的温度、湿度、气体和营养物质等条件，以确保细胞的稳定生长和繁殖。
另外，在细胞培养过程中也需要注意防止细菌、真菌和病毒的污染，保持细胞培养环境的洁净和安全。
通过细胞培养技术，研究人员可以获取大量的软骨细胞用于进一步的实验研究，以深入了解软骨细胞的生物学特性和功能，为软骨组织工程和临床治疗提供重要的基础和支持。
自体软骨细胞体外培养用于法规的要求
自体软骨细胞体外培养用于法规的要求全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：自体软骨细胞是一种重要的细胞类型，具有重要的生物学功能和医学应用价值。
在现代医学领域中，利用自体软骨细胞进行体外培养已经成为一种常见的治疗手段，尤其在关节炎、软骨缺损修复等方面具有重要的临床应用前景。
为了确保自体软骨细胞的体外培养安全有效，必须遵守一系列的法规和规定。
一、生物安全规范在进行自体软骨细胞的体外培养过程中，首要保证的是生物安全。
需要遵守相关生物安全规范，确保实验室环境清洁、无菌，并采取必要的生物安全措施，避免污染和交叉感染的发生。
还需要对实验室设施进行定期检查和维护，确保实验环境符合生物安全要求。
二、细胞质量控制在进行自体软骨细胞的体外培养过程中，需要严格控制细胞的质量。
细胞来源必须合法合规，采集方式符合相关伦理规定，并确保细胞的纯度和活性。
在培养过程中，需要严格控制培养基的成分和质量，确保细胞在最适宜的环境中生长和分化。
三、质量管理体系为了确保自体软骨细胞的体外培养质量和安全，需要建立完善的质量管理体系。
这包括建立标准操作程序（SOP）、记录管理系统和质量控制流程，确保各项操作符合规范和标准。
还需要建立相关的质量标准和指标，对自体软骨细胞的培养过程进行全面监测和评估。
四、临床试验规范在进行自体软骨细胞的体外培养临床应用前，需要进行严格的临床试验。
这包括临床试验设计、试验伦理和数据分析等方面的规范，确保临床试验的结果可靠、科学和合法。
还需要遵守相关临床试验规定，如《临床试验管理办法》等，确保试验过程合规。
五、知识产权保护在利用自体软骨细胞进行体外培养时，必须遵守相关知识产权规定，保护相关技术和成果。
这包括专利申请、技术保密和合作协议等方面的保护措施，确保相关成果的合法性和可持续发展。
要保证自体软骨细胞的体外培养安全有效，必须严格遵守各项法规和规定，确保操作符合规范和标准。
只有在遵守相关法规的前提下，才能更好地保障自体软骨细胞的体外培养质量和安全，为其临床应用提供可靠保障。
软骨实验报告总结
摘要：本研究旨在通过体外培养软骨细胞，探讨软骨细胞的生长特性、增殖能力及其在生物医学领域的应用潜力。
通过一系列实验，我们对软骨细胞的体外培养条件、增殖状态、细胞形态及功能进行了深入研究。
以下为实验总结。
一、实验目的和要求：1. 建立软骨细胞体外培养体系，优化培养条件。
2. 观察软骨细胞的增殖状态、细胞形态变化及功能表达。
3. 探讨软骨细胞在生物医学领域的应用前景。
二、实验仪器设备：1. 培养箱2. 超净工作台3. 移液器4. 倒置显微镜5. CO2培养箱6. 电热恒温水浴锅7. 流式细胞仪8. 低温离心机9. 低温冰箱三、实验设计及调试：（一）实验内容：1. 软骨细胞分离与培养2. 软骨细胞增殖实验3. 软骨细胞形态观察4. 软骨细胞功能实验（二）实验电路：无（三）实验设计及调试步骤：1. 对实验内容和实验电路进行分析，理出完成实验的设计思路。
2. 列出程序设计所需的特殊标志位、堆栈sp、内部ram、工作寄存器等资源的分配列表，分配列表时注意考虑资源在程序执行过程可能会出现冲突的问题。
3. 画出程序设计流程图，包括主程序和各子程序流程图。
4. 根据上述内容写出实验程序。
5. 调试程序，使用模拟仿真器进行模拟实验，观察结果，修改程序，继续调试，直至实验成功。
（四）实验调试过程中所遇到的问题、解决问题的思路和方法：1. 问题：软骨细胞在培养过程中出现污染。
解决方法：加强无菌操作，提高实验室空气质量，定期更换培养箱内的空气。
2. 问题：软骨细胞增殖缓慢。
解决方法：优化培养条件，调整细胞密度，增加生长因子。
3. 问题：软骨细胞功能表达不足。
解决方法：延长培养时间，提高细胞浓度，优化培养条件。
四、实验结果与分析：1. 软骨细胞在体外培养条件下，成功分离并建立了稳定的细胞系。
2. 软骨细胞增殖实验结果显示，细胞在体外培养条件下具有较好的增殖能力。
3. 软骨细胞形态观察表明，细胞呈典型的软骨细胞形态，细胞质丰富，细胞核清晰。
软骨细胞钙化实验报告
一、实验背景软骨钙化是软骨退行性疾病中常见的病理变化，是导致关节疼痛、功能障碍的重要原因。
近年来，随着对软骨钙化研究的深入，发现软骨细胞在钙化过程中起着关键作用。
本研究旨在通过体外实验，观察软骨细胞钙化过程，探讨软骨细胞钙化的影响因素。
二、实验材料与方法1. 实验材料（1）细胞：购自国内某生物技术公司的大鼠原代软骨细胞。
（2）试剂：细胞培养基、胎牛血清、钙离子、磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、胰蛋白酶、EDTA、硝酸铝、碳酸钙等。
2. 实验方法（1）细胞培养：将大鼠原代软骨细胞接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
（2）软骨细胞钙化诱导：在细胞培养第3天，加入一定浓度的钙离子，模拟体内钙化环境。
（3）钙化程度观察：分别在钙化诱导后第1、3、5、7天，取细胞爬片，用硝酸铝溶液染色，显微镜下观察钙化程度。
（4）钙化相关基因表达检测：采用实时荧光定量PCR技术检测钙化相关基因（如碱性磷酸酶、钙结合蛋白等）的表达。
（5）钙化相关蛋白表达检测：采用Western blot技术检测钙化相关蛋白（如碱性磷酸酶、钙结合蛋白等）的表达。
三、实验结果1. 钙化程度观察显微镜下观察发现，随着钙化诱导时间的延长，细胞逐渐出现钙化现象，钙化程度逐渐加深。
第1天钙化程度较轻，细胞周围出现少量钙化结节；第3天钙化程度有所加重，细胞周围出现较多钙化结节；第5天钙化程度明显加重，细胞周围钙化结节增多；第7天钙化程度达到最高，细胞周围钙化结节密集。
2. 钙化相关基因表达检测实时荧光定量PCR结果显示，随着钙化诱导时间的延长，碱性磷酸酶、钙结合蛋白等钙化相关基因的表达水平逐渐升高，提示钙化相关基因在软骨细胞钙化过程中发挥重要作用。
3. 钙化相关蛋白表达检测Western blot结果显示，随着钙化诱导时间的延长，碱性磷酸酶、钙结合蛋白等钙化相关蛋白的表达水平逐渐升高，与钙化相关基因表达趋势一致。
四、讨论本研究通过体外实验，成功诱导了软骨细胞钙化，并观察到随着钙化诱导时间的延长，细胞钙化程度逐渐加深，钙化相关基因和蛋白表达水平逐渐升高。
人体软骨培养实验报告
一、实验目的本次实验旨在了解和掌握人体软骨的生物学特性，通过体外培养技术，观察软骨细胞的生长、增殖、形态变化以及分泌功能，为进一步研究软骨组织的再生和修复提供实验基础。
二、实验材料与仪器1. 材料：- 人体软骨组织样本- DMEM培养基- 胎牛血清- 胶原酶- 细胞培养板- CO2培养箱- 显微镜2. 仪器：- 高速离心机- 离心管- 移液器- 电子天平三、实验方法1. 软骨组织样本处理：- 取新鲜的人体软骨组织样本，用生理盐水清洗后，剪成1mm×1mm×1mm大小的组织块。
- 将组织块用胶原酶消化，消化时间为30分钟，期间每隔5分钟搅拌一次。
- 消化结束后，将消化液以1000 r/min离心5分钟，弃去上清液，沉淀物用DMEM培养基重悬。
2. 软骨细胞培养：- 将重悬后的细胞悬液接种于细胞培养板，每孔1ml。
- 将细胞培养板放入CO2培养箱，培养温度为37℃，CO2浓度为5%，培养24小时后更换新鲜培养基。
- 每隔3天更换一次培养基，观察细胞生长情况。
3. 细胞形态观察：- 使用显微镜观察细胞形态变化，包括细胞增殖、细胞集落形成等。
4. 细胞功能检测：- 通过检测细胞培养液中硫酸软骨素（CS）的含量，了解软骨细胞的分泌功能。
四、实验结果1. 细胞形态观察：- 培养第3天，细胞开始贴壁生长，呈圆形或椭圆形。
- 培养第7天，细胞逐渐融合成集落，细胞形态开始分化，部分细胞呈长梭形。
2. 细胞增殖：- 细胞接种后第3天，细胞数量开始增加，第7天细胞数量达到最高峰，之后细胞增殖速度逐渐减慢。
3. 细胞功能检测：- 培养第7天，细胞培养液中CS含量为（2.5±0.3）mg/L，表明软骨细胞具有一定的分泌功能。
五、实验讨论1. 体外培养的人体软骨细胞能够生长、增殖，并具有一定的分化能力，说明软骨细胞具有再生和修复的潜力。
2. 细胞培养过程中，细胞增殖速度逐渐减慢，可能与细胞接触抑制有关。
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实验方法各种溶液的配制1、配制D-Hanks液(无钙镁)1L，PH8-9（1）称量Nacl8.0g，kcl0.4g,Na2Hpo4.H2o 0.06g, kH2po40.06g，NaHco30.35g，酚红0.02g（2）依次将各成分逐个溶解于800ml水中。
（3）用5.6% NaHco3溶解酚红0.02克。
（4）将酚红液（３）加入（２）中。
（5）补加水至1000ml，混匀。
（6）将Hanks液分装盐水瓶内，110℃、8镑高压蒸汽消毒灭菌20分钟，4℃冰箱保存备用。
2、配制0.25%胰蛋白酶溶液75ml（1）称取胰蛋白酶187.5mg，用少量D-Hanks液先将胰蛋白酶粉末调成糊状。
（2）补足Hanks液至75ml，搅拌混匀，置40℃水浴搅拌帮助溶解。
（3）冷却至室温后，置4℃冰箱过夜。
（4）用滤纸粗滤，再用0.22μm微孔过滤膜过滤除菌。
（5）分装小瓶，低温冰箱冰冻保存备用。
3、配制0.3%Ⅱ型胶原酶溶液49.5ml（1）称取Ⅱ型胶原酶150mg，用D-Hanks液溶解。
（2）补足Hanks液至49.5ml，搅拌混匀。
（3）用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
（4）分装小瓶，低温冰箱保存备用。
4、配制闪烁液（1）用电子天平称取POPOP 0.2g，PPO 2.0g。
（2）将上二者溶解在500ml二甲苯中，避光保存，备用。
取材与培养（1）取3kg重6月龄青紫蓝兔一只(购自首都医科大学动物房)，兔耳静脉注射5ml空气致死。
（2）无菌条件下取双侧下肢膝，髋关节面软骨，置于D-Hanks液中漂洗2次,并用眼科剪将软骨剪碎至1mm3大小,继续用D-Hanks液漂洗2次。
（3）吸去漂洗液，加入0.25%胰蛋白酶溶液，并置入37℃、5%CO2孵箱中消化30分钟,中途不时摇晃。
（4）吸出胰蛋白酶溶液，加入0.3%Ⅱ型胶原酶溶液，置入37℃、5%CO2孵箱中继续消化3小时。
每1小时更换Ⅱ型胶原酶溶液1次。
用离心管留取各次消化液，离心2000rpmX10min，去除上清液。
（5）用加了青霉素及链霉素的Hanks液洗1次，以同样方法再离心一次。
（6）过120目纱目，去除上清液。
（7）用含10%FBS的DMEM制成细胞悬液，调细胞悬液浓度至7.5X104。
（8）将细胞悬液接种于24孔培养板（1ml）及96孔培养板（200μm）中，24孔板及96孔板各2板。
（9）置于37℃、5%CO2孵箱中培养48小时。
更换部分培养基（1）用移液枪从24孔培养板中每孔吸出0.5ml旧的培养基，更换同等数量新的培养基。
（2）同法从96孔培养板中每孔吸出100μl旧的培养基，更换同等数量新的培养基。
加药按照预前设计给培养孔中加A药（牛膝健步）及B药（鹿茸生长素），具体加药方法如下图。
具体加药情况0.04%。
测定测II胶原的合成关节软骨细胞DNA的合成用3H TdR的掺入量来检测。
3号板加药后48小时加同位素3H TdR及3H脯氨酸（1）用1ml注射器抽取0.1ml 3H TdR （即0.1μci）(3H TdR及3H脯氨酸购买时浓度为1mci/ml)。
（2）加DMEM至0.5ml，将3H TdR配制成0.2 mci/ml浓度。
（3）同法配制相同数量的3H脯氨酸。
（4）根据试验前设计，按每孔5μl（即1μci）的量加入同位素。
（5）置于37℃、5%CO2孵箱中培育12小时。
测定同位素的量固定3号板细胞，测定同位素的量1、配置0.25%胰蛋白酶溶液（1）用电子天平称取0.25g胰蛋酶，放入烧杯内。
（2）加入少量的D-Hanks液，充分搅拌，使其成糊状。
（3）再加入D-Hanks液至100ml，不停搅拌，直至完全溶解。
2、固定细胞（1）用移液管将3号板（加药后48小时加同位素）各孔的培养液按顺序吸出并置入相应的试管内。
（1）往各孔内加入少量的0.25%胰蛋白酶溶液，并同时吹打细胞，使贴壁细胞消化脱落，消化不少于5分钟，形成细胞悬液，将细胞悬液再依次加入上面的相应试管内。
（2）将真空泵与玻璃纤维滤膜连接。
（3）用滴管依次将试管中的液体吸尽，滴加在玻璃纤维滤膜上，真空抽吸过滤。
（4）用注射器分别依次抽取2ml 5%三氯乙酸（细胞固定）、5ml蒸馏水（洗去多余的同位素）、1ml无水乙醇（细胞脱色），依次加至滤膜，使细胞固定在滤膜上。
（5）待真空泵将滤膜上的液体吸尽后，用镊子将滤膜取下，有序的置于托盘内。
（7）同上述3号板方法，根据试验前设计往4号板各培养孔中加入5μl（1μci）3H TdR或3H脯氨酸，并置于37℃、5%CO孵箱中培育12小时。
2（8）同昨日方法固定4号板细胞。
（9）将固定3号板及4号板细胞的滤膜依次置入对应的装有闪烁液的小塑料瓶内，闪烁液要覆盖滤膜。
3、用美国产BECKMAN LS6500 multi-purpose 液闪仪测定各孔细胞3HTdR或3H脯氨酸的掺入值。
MTT法测细胞增殖MTT染色(1) 用电子天平称量MTT染料0.02g。
（2）用DMEM溶解并稀释至4ml，PH值测定7.2。
（3）用0.22μm滤膜过滤除菌。
（4）根据试验前设计，往1号板与2号板相应的培养孔内，按0.1ml/孔加入MTT 染色液。
（5）置于37℃、5%CO2孵箱中培育5小时。
（6）按二甲基甲酰胺：Triton-X100：水=3：1：2的比例配置42ml脱色液（用柠檬酸调节PH至5～6）。
（7）按每孔1ml将脱色液加至1号及2号培养板相应的培养孔中。
（8）置于37℃、5%CO2孵箱中培育3小时，期间间歇振荡十分钟，使结晶充分溶解。
（9）用移液枪在1号板与2号板各孔中抽吸0.2ml溶液按顺序加入96板培养孔中。
（10）选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值。
甲苯胺蓝染色及蛋白多糖的测定甲苯胺蓝染色1、试剂配制：甲苯胺蓝乙醇液（甲苯胺蓝0.2g溶于30%乙醇100ml中）。
2、根据试验前设计，将行甲苯胺蓝染色的培养孔中的培养液吸去。
3、用PBS漂洗二次。
4、用70%乙醇固定30分钟。
5、用甲苯胺蓝乙醇液染20分钟。
6、倒置显微镜下观察并照相。
由于35-硫同位素试剂至今未买到,故软骨细胞体外培养后蛋白多糖的测定用甲苯胺蓝染色法完成。
软骨2-型胶原的合成用同位素标记的脯氨酸掺入量进行检测。
组织胺诱导软骨细胞凋亡及吖啶橙染色1 根据预前设计，往培养孔中加入30μl组织胺，置于37℃、5%CO2孵箱中继续培育24小时。
2 细胞离心，去上清后将细胞悬浮于50μlPBS中。
3 加入100μl吖啶橙染色液，混匀，置于冰中染色30分钟。
4 加入1。
85ml细胞固定液，混匀。
5 倒置显微镜观察。
6 进行流式细胞仪分析。
试剂DMEM培养基（Gibco）胎牛血清（FBS）：五江制药厂Ⅱ型胶原酶：Sigma，北京吉泰联科公司分装0.3%Ⅱ型胶原酶：取100mg胶原酶加入33ml D-Hanks液，0.22μm滤膜过滤；DMEM培养液：90mlDMEM+10mlFBS+0.1ml青霉素+0.1ml链霉素青霉素160万u加Hanks16ml，即10万u/ml链霉素100万u加Hanks10ml，即10万u/mlTrypsin（胰蛋白酶）：Gibco，邦定分装0.25%Trypsin：0.125g Trypsin加入50ml D-Hanks液中实验过程2002年12月13日星期五一、配制D-Hanks液(无钙镁)1L，PH8-91、称量Nacl8.0g，kcl0.4g,Na2Hpo4﹒H2o 0.06g, kH2po40.06g，NaHco30.35g，酚红0.02g2、依次将各成分逐个溶解于800ml水中。
3、用5.6% NaHco3溶解酚红0.02克。
4、将酚红液（３）加入（２）中。
5、补加水至1000ml，混匀。
6、将Hanks液分装盐水瓶内，110℃、8镑高压蒸汽消毒灭菌20分钟，4℃冰箱保存备用。
二、配制0.25%胰蛋白酶溶液75ml1、称取胰蛋白酶187.5mg，用少量D-Hanks液先将胰蛋白酶粉末调成糊状。
2、补足Hanks液至75ml，搅拌混匀，置40℃水浴搅拌帮助溶解。
3、冷却至室温后，置4℃冰箱过夜。
4、用滤纸粗滤，再用0.22μm微孔过滤膜过滤除菌。
5、分装小瓶，低温冰箱冰冻保存备用。
三、配制0.3%Ⅱ型胶原酶溶液49.5ml1、称取Ⅱ型胶原酶150mg，用D-Hanks液溶解。
2、补足Hanks液至49.5ml，搅拌混匀。
3、用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
4、分装小瓶，低温冰箱保存备用。
四、取材1、取3kg重6月龄青紫蓝兔一只(购自首都医科大学动物房)，兔耳静脉注射5ml空气致死。
2、无菌条件下取双侧下肢膝，髋关节面软骨，置于D-Hanks液中漂洗2次,并用眼科剪将软骨剪碎至1mm3大小,继续用D-Hanks液漂洗2次。
3、吸去漂洗液，加入0.25%胰蛋白酶溶液，并置入37℃、5%CO2孵箱中消化30分钟,中途不时摇晃。
4、吸出胰蛋白酶溶液，加入0.3%Ⅱ型胶原酶溶液，置入37℃、5%CO2孵箱中继续消化3小时。
每1小时更换Ⅱ型胶原酶溶液1次。
用离心管留取各次消化液，离心2000rpmX10min，去除上清液。
5、用加了青霉素及链霉素的Hanks液洗1次，以同样方法再离心一次。
6、过120目纱目，去除上清液。
7、用含10%FBS的DMEM制成细胞悬液，调细胞悬液浓度至7.5X104。
8、将细胞悬液接种于24孔培养板（1ml）及96孔培养板（200μm）中，24孔板及96孔板各2板。
9、置于37℃、5%CO2孵箱中培养48小时。
2002年12月6日星期一一、更换部分培养基1、用移液枪从24孔培养板中每孔吸出0.5ml旧的培养基，更换同等数量新的培养基。
2、同法从96孔培养板中每孔吸出100μl旧的培养基，更换同等数量新的培养基。
二、加药：按照预前设计给培养孔中加A药（牛膝健步）及B药（鹿茸生长素），具体加药方法如下图。
具体加药情况0.04%。
2002年12月17日星期二一、配制闪烁液1、用电子天平称取POPOP 0.2g，PPO 2.0g。
2、将上二者溶解在500ml二甲苯中，避光保存，备用。
2002年12月18日星期三一、3号板加药后48小时加同位素3H TdR及3H脯氨酸1、用1ml注射器抽取0.1ml 3H TdR （即0.1μci）(3H TdR及3H脯氨酸购买时浓度为1mci/ml)。
2、加DMEM至0.5ml，将3H TdR配制成0.2 mci/ml浓度。
3、同法配制相同数量的3H脯氨酸。
4、根据试验前设计，按每孔5μl（即1μci）的量加入同位素。
5、置于37℃、5%CO2孵箱中培育12小时。
2002年12月19日星期四一、MTT染色1、用电子天平称量MTT染料0.02g。