3D细胞培养和试验系统
简介
哺乳动物细胞培养作为一个无价的细胞生物学工具已有几十年。生长在扁平和僵硬的二维(2D)底物(如
聚苯乙烯或玻璃)上的单层贴壁细胞已成为传统细胞培养系统的中流砥柱。二维细胞培养的研究在扩宽
我们对发育生物学、组织形态发生、疾病机制、药物发现、大批量蛋白生产、组织工程和再生医学方
面的知识方面扮演了至关重要的角色。与此同时，随着2D培养系统而来的缺陷也显现了出来，尤其是
其不能模拟体内环境以提供生理相关的数据。
在体内，几乎所有组织的细胞都处在由一个复杂三维(3D)结构的细胞外基质(ECM)中，它们和相邻的
细胞通过生化和机械关系产生着相互作用1。细胞-细胞和细胞-细胞外基质间的相互作用构建成了一个
用于维持组织特异性和稳态的3D通讯网络2。细胞生命周期的关键事件通过受到周边细胞微环境的控
制3。2D培养试验中，细胞无法实现类似于体内的结构组织和连接，这使得细胞形态、存活力、增值
能力、分化、基因和蛋白表达、对刺激的反应、药物代谢及一般的细胞功能受到了限制或减弱。
2D 培养的限制对临床前基于细胞的药物和毒性筛选试验的可预测性造成了影响。超过90&的药物通过了体外临床前研究，却在随后的临床实验中未能达到预期的疗效或安全范围4。癌症药物的失败率更高
5, 12，因为2D培养系统常常无法构建有效的肿瘤生物学模型6,7。而且，在使用2D模型进行临床前药物研
发时，生物利用率和毒物学的研究严重依赖于动物模型的使用。这一高失败率表明动物模型可能并不
适用和/或并非人用治疗方案安全性评测的代表4,16,17。
为了克服这些短板，大量的3D细胞培养模型在近20年被开发了出来。由于3D模型显著促进了癌生物
学、组织工程和再生医学的研究，又得到了进一步的发展。为此，细胞生物学家们、材料科学家们、
生物医学工程师们以及其他开发更有用的模拟体内环境的3D模型来缩短2D培养与活体组织间差距的
人，携手参与了多学科的研究。越来越多的证据表明，3D培养建立起来的生理细胞-细胞与细胞-细胞
外基质相互作用可以模拟天然组织的特异性，并且比传统2D培养的生理相关性更强8-10。这在干细胞培
养和分化、癌生物学、药物和毒性筛选及组织工程中显得尤为突出。
Suparna Sanyal, Ph.D.3D细胞培养和试验系统
综述文章
3D细胞培养的范围很广泛，而且由于不同细胞类型和应用的需求而更不想用。每个模型都有各自的优
缺点，一种模型并不能使用于所有应用。但是，有些方法学已发展的远比其他的快，比如说体外3D培
养。根据3D细胞培养趋势报告提供的信息11，天然ECM基的水凝胶（如Corning?Matrigel?基质和胶
原）和3D细胞培养聚合物（如球体）是体外3D培养最常用的模型。这些3D模型具有越来越多种细胞
类型的生理代表性，比并被广泛用于干细胞分化、肿瘤发生和药物发现中。球体和/或天然凝胶还有一
个优点就是它们能被轻易地键入到更加复杂的类似体外的共培养系统中，这样的系统整合了多种细胞
类型。而且，像可通透支持物（如Transwell?小室）这些装置可以和水凝胶底物一起整合到3D培养模型
中，用于协助不同细胞类型、可溶性因子和培养微环境之间相互关系的研究。
这篇综述将聚焦于体外3D细胞培养系统的基本概念和优缺点，并尤其关注以下三个方面：1) 细胞生物
学和组织建模，2) 药物发现 和3) 药物毒性。从这个角度看，将会额外注重最常用的体外3D培养基
质，如ECM基水凝胶，及其应用。
1.2D及3D细胞培养模型对比
2D与3D细胞培养体系在微环境上的基本区别可造成多种细胞行为上的影响，包括细胞吸附、伸展和生
长，细胞形态和极性，基因与蛋白表达，存活，增值，运动，分化，对刺激的反应，细胞代谢和总体
功能。二者对比时最首要的一个区别在细胞形态上。细胞首先根据整合素介导的粘附对细胞外基质的
取向而采取2D或3D形状。在2D培养中，细胞吸附发生在细胞的一侧（和2D表面接触的一侧），而3D
培养中的细胞吸附则是围绕着整个 细胞表面进行的13。一般来说，细胞在无约束的2D底物上的吸附和
伸展在几分钟之内完成。相比较而言，3D培养中则是在其生理环境蛋白酶解前进行，可长达数小时，
甚至于好几天18。
细胞伸展的程度可以影响到其增值、凋亡和分化19-22。许多细胞当从组织中分离出来并置于平面细胞
培养表面时，会逐步变得更加扁平，分裂异常，并丧失其分化表型23,24。有意思的是，有些细胞类型在
3D培养环境中又会重新恢复期生理形态和功能。比如说，3D培养条件下去分化的成骨细胞能够恢复期
生理表型，包括细胞形状及其软骨标记物的表达25。相似地，包被在3D环境下的乳腺上皮细胞停止了
不受控制的分裂，组装为腺泡样的结构，并建立了全新的基底膜24,26,27。
除了细胞伸展以外，细胞采取的形态可对其功能有影响28-32。比如说，3D环境中腺上皮细胞的组织、
信号传导和分泌相比较2D表面更接近于体内培养的状态33,34。成纤维细胞的形态，包括细胞骨骼的组
织和细胞粘附的类型，也在3D基质中与体内行为更加类似35。而且，已经发现，3D环境最有利于帮助
成纤维细胞细胞内信号传导36-38。
3D模型赋予的另一个重要的生理特性是合适的细胞极性。体内的极性取决于细胞类型和组织为微环
境。上皮细胞通常都是计划的，有顶面和基底面，这对组织的结构和生物活性分子的定向分泌很重
要。组织结构随着细胞移植到平面的2D组织培养底物上而丢失。当回到合适的3D培养条件中，上皮细
胞通常能重新获得顶面-基底面极性，腺细胞则会形成细胞因子分泌入的腔口3。像Transwell小室这样
的可通透支持物在重建具有活体组织类似的细胞形态、细胞-细胞相互作用、极性和分泌功能的上皮细
胞3D模型时尤其有用39-42。图1展示了一个子宫内膜腺3D体外模型。这一模型中的子宫内膜腺上皮细
胞培养于含有Corning?Matrigel?基质的培养基中，在7到8天后使用不同的极性标记物进行免疫荧光染
色。标记物表达分析结果证实，腺体结构专门由上皮细胞起源的细胞组成(图1A 和1F)。而且，代
表子宫内膜腺的球体展现出了正确的顶面-基底面极性(图1B 和1G)，高尔基体的方位(图1C 和1I),
粘着小带(图1D 和1H)及紧密连接(图 1E)。
2
图1. 体外培养的子宫内膜腺展示出上皮细胞的顶面-基底面极性。使用BIE培养基极性体外培养8天后的腺体(A-E) 或小鼠子宫内膜腺(F-I)的冷冻切片双免疫染色。A 和 F: 细胞角蛋白 (绿色) 和波形蛋白 (红色). B 和 G: 层纤连蛋白 (绿色) 和鬼笔环肽 (红色). C 和 I: GM130 (绿色) 和鬼笔环肽 (红色). D 和 H: ZO-1 (绿色) 和 E-钙黏着蛋白 (红色). E: ZO-1 (绿色) 和b-连环蛋白(红色). 白色比例尺为20 mm. BIE 培养基 = 基本培养基加入 5 ng/mL EGF 和100倍稀释的 ITS 和3% 新鲜的 Corning? Matrigel? 基质; EGF = 表皮生长因子; ITS = 胰岛素转铁蛋白硒. (Eritja等, 2010)143.
基因表达和mRNA剪切的模式根据细胞在2D还是3D条件下培养而有着显著的区别43,44。比如说，黑色素瘤细胞培养在扁平底物上时展现出独特的基因表达模式，而3D环境下黑色素瘤细胞球体则不一
样。3D球体中上调的基因被发现也在体内的肿瘤中发生了上调。还有研究表面，细胞培养底物的特征还会影响到整合素mRNA的表达和蛋白的生物合成。扁平2D塑料底物上培养的乳腺上皮细胞a1整合素mRNA表达明显上调。相比较来说，同样的细胞在3D条件下使用重构的基质膜（如Corning Matrigel基质）进行培养时，其mRNA表达水平可以和活体乳腺组织相媲美(13,46详述)。
原代细胞和干细胞的分化群落是天然3D的环境，其生化和拓扑学也对分化过程有巨大的影响47。比如说，单层培养的原代肝细胞在几天内去分化并死亡48。去分化肝细胞首先丧失的一大功能就是药物代谢酶的生物合成能力，这些酶对药物研究的毒性试验很关键48。2D表面的肝细胞功能亏损可以通过将原代肝细胞嵌入3D基质（如I型胶原49, Corning Matrigel基质49, 合成肽支架50, 或维持在灌注流条件下51）中来克服。
总的来说，这些发现说明了3D细胞培养系统可用于帮助体内不同程度的细胞复杂性和功能的实现，具体由细胞类型和培养环境决定。而大多数情况下，2D培养模型能够帮助实现的细胞分化和类似体内的功能则很有限。
2.3D细胞培养技术
体外3D模型的一大关键特性就是能够模拟体内特定的细胞行为，使得能够精确预测组织的发育和形态发生、细胞分化、药物和毒性筛选试验中基因型和/或表型对化合物的反应。有些更基础的3D模型还引入了悬浮培养细胞团，并在不使用基质基的底物情况下完成。但是，多数更复杂的3D细胞培养模型要么利用水凝胶基的基质，要么使用固态支架。大量的材料和制造技术用于开发具有不同物理和生物特性的支架，以满足体内不同类型细胞的需求。在这多种方法中，天然来源的ECM基水凝胶最常用于体外的3D细胞培养应用。
3
3D球体培养
细胞球体作为简单的3D模型，利用广泛种类的细胞制备，由于贴壁细胞趋向于聚集的特性从而形成球
体。常用的球体包括胚胎小体、乳腺球、肿瘤球体、肝细胞球和神经球。贴壁细胞的天然特性就是易
于聚集并在有阻碍其粘附到培养底物的条件下形成球体。常见的用于制备球体的无基质方法包括使用
抗吸附细胞培养表面（如 Corning? 超低吸附力表面），或通过维持细胞在培养基中悬浮培养（如悬滴
技术，旋转培养和生物反应器）。一些类型的细胞根据材料的结构和物理特性也能在3D水凝胶，一定
程度上还能在一些固态支架中形成球体。球体的总体大小仅限于几百微米，球体中心还会信还会形成
坏疽52。
球体能够天然地模拟固态组织的多个特性，并自身具有能够高效运送氧和养分的梯度，还能保证代谢
废物的运出。这些细胞聚集物比标准的2D环境更能有效模拟无血管固体肿瘤的行为，因为球体和肿瘤
类似，通常都具有异质的暴露和深埋在表面的，增殖和非增殖的，以及供养充足和缺氧的细胞53。此
外，多能干细胞（PSC）的分化通常都会涉及到被称为胚胎小体的球状结构的形成，这是体外后续细
胞分化研究的重要步骤。因此球体代表了一种用于研究固态肿瘤发生和干细胞分化尤其重要的生理3D
模型。除此以外，球体很容易通过光学、荧光和共聚焦显微镜等成像技术来进行分析，跟更复杂的3D
细胞培养模型相比是一大优势。而且，相对来说更容易实现均一大小3D球体的大量生产，因而适用于
许多体外高通量和毒性筛选应用。
利用水凝胶和细胞外基质的3D培养
水凝胶由交联的多聚链或复杂的天然或合成蛋白分子组成的网络构成。由于含大量水，水凝胶具有和
天然组织非常相似的生物物理学特性，因而可以作为高效的3D细胞培养基质。水凝胶可单独或和其他
技术（如固体支架、可通透支持物、细胞微阵列和微流体设备）联用。
在3D培养系统中有多种方法可以利用水凝胶。可为包括固体支架在内的多种细胞培养表面做包被试
剂。也可以将细胞包在或压在基质中间。水凝胶基质中细胞的形态、生长和功能取决于生物物理学和
生物化学特性，以及如通透性和基质硬度在内的物理特性。
天然水凝胶和细胞外基质(ECMs)
天然来源的细胞培养水凝胶通常由蛋白和ECM成分（如胶原、层纤连蛋白、纤维蛋白、透明质酸、壳
聚糖或Corning Matrigel? 基质）构成。由于来源于天然成分，这些凝胶本身具有生物兼容性和生物活
性54。因为存在多种有助于多种细胞存活、增殖、功能实现和发育的内源因子，这些水凝胶有利于细
胞功能的完成55。
包围细胞的ECM具有多种关键功能。首先，它能够提供一个复杂的纳米级的结构蛋白（如胶原、层纤
连蛋白和纤连蛋白）架构，以构建细胞微环境中本就存在的机械特性90,91。细胞通过其细胞表面整合
素感受到机械力，并结合ECM蛋白上具有的特定粘附模体。正如这篇综述上面提到的，3D系统的细胞
粘附会导致并影响一系列的的后续细胞反应，这些反应和2D表面上生长的细胞相比更接近于生理情况
13。而且，ECM对隔绝可溶性生物分子和生长因子，通过时间和空间上的限制来控制这些信号分子的
释放来指导包括细胞迁移、基质降解和沉积的过程至关重要90,91。ECM模型重构对于实现组织内稳态
是必要的，尤其是在发育和疾病过程中。因此，想要真正地模拟体内的ECM，需要构建具有ECM机械
和化学特性的3D培养模型，而不只是停留在细胞接种的初级阶段，而要考虑到细胞生长和发育的动态
和可控过程。
4
Corning? Matrigel? 基质是ECM基的天然水凝胶，已广泛运用于各种体外和体内3D细胞培养中。这种重构的基底膜提取自EHS（Engelbreth-Holm-Swarm）小鼠肉瘤，含有基底膜中具有的所有常见ECM分子（包括层纤连蛋白、IV型胶原、肝素硫酸蛋白聚糖和巢蛋白）56。Matrigel基质的ECM成分能够激活癌症细胞中的多条信号通路，这些通路控制着血管生成57,58，癌细胞运动59和药物敏感性60。因为Matrigel基质能够模拟体内的基底膜，它常常用于研究类似于上皮组织细胞的癌症细胞61。Mina Bissell 博士首先使用Matrigel基质研究了乳腺上皮细胞和乳腺癌，展现了3D培养用于构建类似体内环境的模型系统的能力62，以及癌症中整合素信号通路重要性63,64。
I型胶原是另一种常用的3D细胞培养天然水凝胶。I型胶原是间质隔室和骨中常见的ECM分子。可分离自多种生物来源，包括牛皮、大鼠尾腱和人胎盘。I型胶原还可以静电纺丝为膜65,66，并帮助细胞进行3D生长于分化。除此以外，I型胶原和整合素受体相互作用，调节基因表达67。目标基因包括那些改变基质金属蛋白酶（MMP）产生的基因，降解ECM以促进肿瘤细胞侵袭的酶68，以及那些影响细胞对抗癌药物敏感度69、细胞增殖和细胞迁移的基因70,71。
天然水凝胶也有一些缺陷，如从动物来源的分离提取，以及天然存在成分上的批次间差异。而且，它们包含着像生长因子这样的内源生物活性成分，虽然有利于构建一些3D模型，但有些情况下也会混淆所研究的特定的细胞表现或反应。
为了规避一些随动物源生物材料而来的麻烦，有一些不含动物源或利用重组核酸技术而来的基质以及被开发了出来。透明质酸（HA）是一种越来越受欢迎的生物源基质72-74。多数商业级的HA来源于细菌，高纯度且同质性高。这些凝胶可通过加入ECM成分来改造，从来促进细胞粘附和生长。
合成水凝胶
合成水凝胶适用于不宜使用天然源生物基质来进行的3D细胞培养应用。合成水凝胶完全由非天然的分子（详见75），如聚(乙二醇) (PEG)76, 聚(乙烯醇)77和聚(甲基丙烯酸羟乙酯)78组成。它们具有生物学惰性，但能给多种类型的细胞提供结构支撑。
PEG水凝胶能够维持封入的细胞的存活，而同时也能和水凝胶一样实现ECM降解79，由此可以看到，合成凝胶能够在没有整合素结合配体情况下充当3D细胞培养平台。这样的惰性凝胶高度可再生，能轻易条件机械特性，易于操作和生产。
也可以利用适当的生物成分改造惰性合成水凝胶。可调节合成水凝胶的一个例子就是Corning PuraMatrix? 肽水凝胶，一种自组装的纳米级纤维合成多肽。纳米大小的纤维和孔径对保证3D细胞环境是必需的80,81。另一大优点就是可以使用特定序列的肽来定制材料，以促进细胞粘附、细胞归巢及其他行为82。为了使用PuraMatrix肽水凝胶来实现最佳的细胞生长和分化，需要用适当的生物活性分子来补充水凝胶（如生长因子，ECM蛋白和/或其他分子）。图2展示了一个例子：功能化的PuraMatrix肽水凝胶用于帮助神经元细胞增殖和分化。在这一研究中，Ortinau及其同事在人神经前体细胞的神经元分化中利用添加了层纤连蛋白（PML 0.25%）的PuraMatrix肽水凝胶。使用透射光镜（图2A和2B）和扫描电镜（图2C和2D），研究人员发现神经前体细胞发育出密集的神经元过程网络（图2B和2D）。而且，免疫组化实验发现，在Corning PuraMatrix-层纤连蛋白支架中分化了7天后，神经元前体细胞开始表达神经元标记物（b III-微管蛋白和酪氨酸羟化酶 [TH]）（图2E和2F）。这些发现表明，使用适当的生物因子功能化后，能将惰性的合成基质（如Corning? PuraMatrix?肽水凝胶）转变为有用的体外模型，帮助干细胞和前体细胞分化。随着这一领域的发展，会产生对兼有天然和合成水凝胶特性的基质的需求。
5
图 2. 3D 支架中的增殖和分化。（A, B）添加了0.25%层纤连蛋白（PML）的Corning PuraMatrix肽水凝胶中的增殖
细胞和分化细胞透射光镜照片。（C, D）添加了0.25%层纤连蛋白（PML）的Corning PuraMatrix肽水凝胶中的增殖
细胞和分化细胞扫描电镜照片（B, D）诱导分化后，发现形成密集的3D过程网络。（）PML 0.25 %条件下，未
诱导细胞（）的b III-tubulin和TH 免疫组化结果，（F）分化7天后的细胞形成密集的b III-tubulin阳性细胞网络。TH
+细胞被发现能够控制这些过程，但并不能构建密集网络。（Ortinau等， 2010）133。
固态支架
3D细胞培养的固体支架是使用各种材料生长而成的，这些材料包括金属、陶瓷、玻璃和多聚物。特别
是多聚物，它常用于制备不同大小、结构、硬度、多孔性和通透性的固体支架61。多种生产技术正用
于制备3D细胞培养所需的固体支架，包括软光刻，静电纺丝，微阵列，生物打印等。使用固体支架的
主要缺陷在于细胞成像的范围有限，以及其他一些随着从基质中复苏细胞而来问题。
为3D细胞培养设计支架需要考虑到的一个重要问题就是支架内部结构的尺度和拓扑结构。体内的ECM
提供着支撑细胞的错综复杂的纳米级基础结构，指导性地控制着细胞的行为83-87。结合在微尺度结构
支架上的细胞 会像培养在扁平表面一样变平并扩散开88。细胞环境的地貌即便发生了细微的纳米级变
化也会导致不同的细胞行为89。除了大小和结构，用于构建自家的材料、表面化学特性、基质硬度、
通透性和机械力都会对细胞粘附、生长和行为产生显著的影响10。
3.体外3D培养的应用
尽管涌现出了各式各样的3D培养系统，天然ECM基水凝胶依然是最有影响力的体外3D细胞培养方法
11。许多新式的3D培养系统针对于特定类型的细胞，但却未能为各种应用进行优化。而且，细胞分化
和肿瘤发生过程中的许多复杂生物学过程尚未明确，因而需要额外分离与添加的特定生物成分的培养
体系的构建并不容易。
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细胞生物学和组织模型
干细胞分化和类器官生成
干细胞和特定体细胞的培养和分化已经得到了令人瞩目的研究成果，这得益于3D细胞培养系统的使
用。干细胞，尤其是多能干细胞（PSC），具有生成体内任何类型细胞群的巨大潜能。纯前体细胞群
或终分化的细胞，尤其是难以从组织中分离出来的细胞，对药物发现、细胞治疗和组织再生具有巨大
的价值。
最近，在使用3D培养系统进行干细胞分化的领域取得了巨大的突破，包括体内信号通路发展和时间控
制(表 1)。值得注意的是，在Koehler及其同事进行的一项复杂研究中，小鼠胚胎干细胞（mESC）在含
有Corning? Matrigel?基质的培养基中作为漂浮细胞团培养时，成功地分化成内耳感受上皮细胞92。在感
受上皮细胞中，自发产生了内耳中具有天然机械敏感毛细胞结构和功能特性的毛细胞92。这一新型的
方法有助于阐明控制内耳发育的复杂机制，并可用于体外疾病模型的建立、药物发现及细胞疗法。
表1. 组织和疾病模型
7
8近期研究实现了从干细胞衍生为肾细胞谱系。Morizane等发现在使用Corning? Matrigel基质对mESC进行3D培养时，它可分化为复杂的肾小管细胞93。Xia等将hPSC分化为肾前体样细胞94。通过构建一个3D 培养系统，这些细胞进一步成熟为输尿管芽结构，在这一系统中，分化的人细胞和鼠细胞一起组装并结合为嵌合的输尿管芽94。这两项研究发现了在构建肾发育模型中的关键步骤，并共同阐明了用于支持高度组织化器官细胞分化的3D系统的重要性。
干细胞分化的另一个重大进步就是自组织3D迷你器官（类器官）的形成。类器官中可看到明显的组织细节，并具有体内器官中多种类型细胞的功能特性。最近已出现了许多使用由Corning Matrigel基质组成的3D模型开发出的肠95,96, 视网膜97, 胰腺98, 乳腺99, 结肠100,和大脑组织101类器官（表1）。图3展示了帮助分离的小鼠胚胎胰腺前体细胞高效扩散的3D培养条件98。通过控制培养基的组分，研究人员制备出了主要由胰腺前体细胞组成的空心球体，以及自发实现胰腺形态发育和分化的复杂类器官。图4展示了另一个由Lancaster等人完成的案例，他们成功制备了具有大脑组织显著结构相似性的大脑类器官101。这些大脑类器官比典型的细胞球体生长的大，可存活数周甚至数月。类器官的体外培养朝着阐明器官发育原理和遗传病发病机制跨出了一大步。
图 3.类器官再现了前体的扩增和有组织的分化。(A-E) 7天类器官的免疫组化切片，显示 (A) 全部细胞 (DRAQ5, 红
色细胞核) 都是上皮细胞(E-钙粘蛋白) 且许多都在增殖[磷酸化组蛋白H3 (pHH3)] 并 (B, C) 包含胰腺标记物PDX1, SOX9 和 HNF1B. (C) 细胞极化并形成内衬黏蛋白 1的管道. (D)周围可见外分泌分化 (淀粉酶) . (E) 中心检测到内分泌分化 (胰岛素) . B中的该区域接近于A中，D中的接近于C中。(F) 用于检测植入背部的在胰腺群落中类器官内培养的细胞内分泌分化的实验策略。WT, 野生型. (G-J) 原先体外培养的细胞接入宿主上皮中 (G中为白色，H-J中为绿色). 一些依然是前体细胞 (G; HNF1B), 一些分化为腺泡(H; 淀粉酶) 或管道细胞(I; DBA)，其他分化为内分泌细胞 (胰高血糖素或胰岛素). 插图为虚线框部分的放大图。比例尺50 μm (Greggio等, 2013)98
.
9
癌症和肿瘤细胞生物学
Corning? Matrigel? 基质用于3D细胞培养的最显著的应用可能在于癌生物学领域。Matrigel基质是从小鼠肿瘤中分离出来的重构基底膜，因此这一生理材料具备着模拟肿瘤生长、血管生成和转移过程中关
键步骤的重要微环境特征。肿瘤细胞在3D悬浮培养或水凝胶中通常会形成球体。球体中的细胞是异质
性的，其组织形态有助于梯度形成，其扩散动力学更接近于体内形成的肿瘤102。球体的内核具有一个
类似于体内癌症坏死区域的空腔102。这些区域缺少氧气，通常能在缺乏养分和氧气供应的条件下观察
到。除此以外，3D系统中肿瘤细胞的增殖明显慢于单层培养102,103。
源于上皮的肿瘤细胞在3D 系统中培养时表现出形状上的变化，丢失了和体内肿瘤发展相关的极性104。
而包括增殖、基因表达和药物敏感性在内的其他参数也跟2D 表面培养的肿瘤细胞相比更加接近体内的
情况（详见61，105）（表2）。例如，Cichon 等人发现肺癌细胞在2D 组织培养塑料上展现出扁平的形
态，而3D Corning? Matrigel?基质上培养的细胞则形成光滑、圆形的球体、葡萄状结构、或具有侵袭性
的分支结构106。基因表达分析结果发现了导致3D 模型中肺癌细胞光滑生长或形成分支结构的区别。这
类信息有利于理解腺癌病人的不同预后效果106。在另一个由Harma 等人进行的研究当中发现，当使用3D Matrigel 基质进行培养时，原代或未转化的前列腺上皮细胞以及一些前列腺癌上皮（PrC ）细胞系形成显著不同的圆形球体，而大多数PrC 细胞系形成差异不大的球体或是侵袭性强的结构107。而且，
侵袭性PrC 团中一些特定信号通路被激活，发现了3D 模型中阻碍肿瘤细胞侵袭的潜在靶标107。而另一
个小组研究了3D 微环境对常见结直肠癌细胞系表型、基因表达和EGFR 抑制的影响108。3D Matrigel 基
质培养的PrC 细胞系发生了剧烈的表型变化，并在基因表达模式上和2D 培养相比具有明显的不同，这
与体内对抗EGFR 靶标的治疗敏感性相一致108。能够模拟活体肿瘤中具有的癌细胞表型和基因型变
化，这对为化疗开发更有效更具有预测性的筛选试验至关重要。
图 4. 大脑类器官培养系统。 (A) 用于制备大脑类器官的培养系统概述。展示了每个阶段的示例图片。bFGF, 碱性成纤维细胞生长因子; hES, 人胚胎干细胞; hPSCs, 人多能干细胞; RA, 视黄酸. (B) 类器官和小鼠大脑结构的比较重现
了背皮质组织。大背皮质组织免疫组化染色，神经元(TUJ1, 绿色)，放射状胶质干细胞 (PAX6, 红色) 。(C), 切片和
免疫组化结果显示出含神经前体(SOX2, 红色)和神经元(TUJ1, 绿色) (箭头)的异质区域复杂形态。(D) 低放大倍数
亮视场图显示出充满液体的脑室（白色箭头）和视网膜组织空腔，视网膜色素上皮（黑色箭头）。(Lancaster 等,
2013)141
。
10
大多数体内细胞培养模型涉及到培养单种类型的细胞来研究其分离状态的生长和行为。但是在体内，
不同类型细胞之间的通讯对于维持组织内稳态至关重要。通过共培养来模拟两种以上相关联细胞之间
的相互作用，可以改善细胞培养模型的总体生物学相关性。
3D共培养模型对研究癌细胞和其他类型细胞间的复杂相互作用非常有用，并有助于阐明其对肿瘤生
长、血管生成和转移的作用（表3）。例如，已发现基质细胞能够诱导化疗抗性，以保护肿瘤细胞免受
抗癌药物的毒性效应109。内皮细胞及相关脉管系统提供的血液供应促进了肿瘤的生长和存活，同样也
帮助治疗药物进入癌细胞110。最近的一项共培养研究发现，内皮细胞可在体外提高肿瘤球体对化疗药
物毒性的敏感度，并在植入体内后诱导血管生成和转移111
。
表2. 3D 癌症和肿瘤细胞模型
11
可通透支持物（如Transwell 小室）可为共培养研究提供独特的优势，因而广泛地被整合入这些系统
中（表3）。含孔的可通透支持物膜具有可使生物活性因子或可溶性分子跨膜传递的小孔径（如0.4微
米），以实现膜两侧细胞的物理分离。最近两项研究使用可通透支持物来研究包埋在3D C Corning?
Matrigel?基质中乳腺上皮细胞112和人肺上皮细胞42生长中内皮细胞的作用。两项研究中，内皮细胞都
诱导了癌上皮细胞的生长和形态学改变，这些变化可以通过可溶性分子的分泌来实现。另一项研究
将成纤维细胞和内皮细胞与肝细胞球体进行了共培养，可用于显著提高肝细胞的功能113。通过可通
透支持物的使用，进一步发现内皮细胞需要直接的细胞间接触来提高肝细胞的功能，而成纤维细胞
可通过可溶性分子的作用或通过直接接触培养细胞时来实现这一功能。在一个更复杂的可通透支持
物共培养模型中，将四种类型的细胞（肺泡、巨噬样、肥大和内皮细胞）一起培养以能够模拟肺泡
屏障来研究肺上的颗粒潜在毒性39。这项研究中，膜通过为整个共培养系统提供支撑扮演了最中心的
角色，使得细胞的3D 组织接近于肺泡屏障的体内组织学（图5）。其中，将内皮细胞接种在多孔膜的
基底外侧，其他三种细胞接种在顶端部分，培养在气液界面（ALI ）上39。除了细胞通透反应，可通
透支持物还被用于研究细胞迁徙和侵袭。在一个有意思的3D 共培养模型中，羊膜支架中的间充质干
细胞被发现能通过MSC 分泌的IL-6的作用来提高卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力。这些使用可通透支持
物共培养模型的发现说明，这种方案可显著改善现有的药物筛选和组织工程方法116
。
表3. 3D 共培养模型
药物发现
由于后期人体临床试验甚至上市后的药物高损耗率，药物研发的成本变得难以预计14,16。药物失败的
首要原因就是药效缺乏、药物动力学差以及需要使用细胞水平和动物实验的临床前研究过程中未能发
现的不利或毒性副作用4,12,15。药物发现的这些挑战呼吁着改进的临床模型的出现；这些模型要能够再
现人体特定组织器官疾病的病理生物学过程，还要更加精确地预测对治疗药物和毒性筛选的生理反
应。
生理相关的3D细胞培养模型是用于缩小传统2D临床前模型和人类体内临床研究之间差距的最优选择。
过去的几十年间该领域取得了重要的进展，然而将3D细胞培养模型广泛运用于药物发现中还有许多实
际的限制。首先，许多3D模型还太新，使用这些方法获得的数据需要体内实验数据的证实，以避免对
观察到的结果的误读。而且，3D试验的结果由于缺乏标准化实验流程以及使用了异质的、甚至是多种
细胞类型而充满变数。许多3D实验操作起来很麻烦、很困难，需要用到专业性强且不常见的检测手
段。还有，有些3D基质通透性有限，或是扩散动力学很差，对细胞活力和功能造成影响。此外，有些
3D支架中细胞的复数和可视化受到严重限制。还有一大局限性就是许多3D培养模型很难实现自动化或
扩大用于高通量筛选。除了这些因素，一些3D细胞培养系统的花费高的令人却步，从而限制了其在药
物发现上的运用。但是，这些缺点正积极谨慎地被不断出现的新技术和改进的3D体外实验所克服。
Aerosol chamber
图 5.使用四培养系统构建气溶胶暴露实验流程图。(Klein等，2013)
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悬滴和细胞磁悬浮技术近来用于无基质细胞悬浮培养3D体外试验的商业化。这些试验过程中的液体培
养基有助于使用传统显微镜进行可视化。药物和可溶性因子的渗透也可以通过这些模型轻易实现。
在天然ECM基水凝胶中，Corning? Matrigel? 基质一直以来都是3D细胞培养，特别是重建肿瘤膜型的
金标准材料。这种基质最常用的体外3D应用就是癌症药物发现中的(如内皮细胞管道的形成)。限制
Matrigel基质在药物发现中引用的一大原因就是如何在高通量3D试验中可重复地分发小容量的这种粘性
凝胶。最近Hongisto等人的一项研究成功地使用Matrigel基质构建了一个高通量3D筛选试验，他们用液
体操作系统将稀释后的Matrigel基质（3倍稀释）装入384孔板中115。在使用Matrigel基质系统分析63个著名的癌症药物时，发现乳腺癌细胞（JIMT1)的敏感性和基因表达情况非常接近于肿瘤异体移植物115。同一个研究中，多聚HEMA诱导的非锚定依赖性3D培养的乳腺癌细胞未能展现出相似的药物敏感型或基因表达情况，相反其结果更接近于2D培养中的细胞。这项研究是这类试验更加有预测性和效果的典型。
最近在微尺度工程学技术（如微阵列和微流控设备的生产）上的进展有可能会转变当下的药物发现行业。微阵列由一个固体支架组成，支架中小体积的不同生物分子和细胞可以放在特定位置上，以便于多元化研究活细胞及其对刺激的反应。微流控设备操控小容量 (10-9 to 10-6 L) 来制备并精确控制动态液体流动和时间-空间梯度，还能向细胞中传输营养物质和其他化学成分116-118。微流控网络已经和几种其他基质被直接整合到嵌着细胞的水凝胶中，以帮助营养物质和其他可溶性物质高效地在3D支架中传输117。这些技术的使用能够有效改进肝细胞这类静态培养时生长状态不佳的细胞的存活力和功能。而且，这些技术还能提高通量，并显著降低由于需要低剂量试剂而造成的花费。
毒性筛选
最先进的药物代谢和毒性筛选试验常常使用来源困难和昂贵的原代细胞（如肝细胞、心肌细胞和神经元）在2D 细胞培养模型中进行。长期的毒性测试通常在动物模型中进行。正如之前讨论的，这些模型非常不精确，而且可能会误导对人体内药物反应的预测4,16,17。有几种3D细胞培养模型可能能够改善临床前毒性研究的预测性。
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微加工和微流控技术已被用于制备了集中芯片器官模型（详见117）。它们本质上是微缩的具有类似
于体内功能的3D器官模型，可能证实可用于毒性测试(表 4)。例如，Toh等人开发了一种用于体外毒
性测试的3D肝细胞芯片。 这个模型中的肝细胞保留了其合成和代谢功能，并且可利用这个系统同时
对多个药物进行测试119。被测药物的IC 50 值和之前报道的体内值非常一致。Lee等建立了另一个用于
高通量筛选潜在药物及其细胞色素p450生成的代谢产物的3D微阵列120。这种微阵列芯片由包在胶原
或海藻酸钠凝胶中的细胞组成，它们排列在功能化的载玻片上面，芯片还包含一个含人P450的微阵
列，适用于同时筛选多种化合物120
。
表4. 药物发现和毒性模型
使用可通透支持物在气液界面培养细胞促进了药物发现中许多体外3D模型的发展(表4)。其中最出名的一个应用就是肺上皮的3D模型。这些细胞模型模拟体内的组织，具有顶面-基底面极性，顶面有纤毛，能够分泌粘液（详见121）。使用新鲜分离的鼻和支气管活组织制备的ALI培养已经有了商业化成品——M uc i lA i r?(Epi thel ix)，可用于研究对纳米颗粒、气体、烟和病毒感染的吸入性毒性反应。利用疾病供体的细胞结合使用M uc i lA i l?可用于模拟如哮喘、过敏、病毒感染和囊性纤维化之类的肺部疾病。ALI培养可在内稳态中维持达3-4周，这通常仅在动物模型中可行，而非体外2D细胞培养系统121。另一种商业化的ALI培养是EpiDerm? (MatTek)，它是一种人类表皮模型，是通过在化学修饰的胶原包被细胞培养小室分化上皮角质形成细胞得到的。这一体外皮肤模型可重现正常人类皮肤的形态、结构和屏障功能特性，可用于研究皮肤毒性。已经使用MatTek制备了一些用于毒性测试的模型，如EpiOcular? (角膜), EpiAirway? (肺), EpiOral? (内颊) 等。
另一个潜在的改进药物发现的方法是通过制备分化自PSC的细胞。PSC能够提供不受限制来源的难以分离的细胞，用于研究疾病机制、药物筛选和毒性测试。尤其是分化的心肌细胞、肝细胞和神经元一直被寻求用于毒性筛选。限制PSC使用的一大关键因素就是在酶解时容易凋亡，从而限制了这些细胞的大批量培养生产。Faulkner-Jones对人最近第一次发现ESC可以生物打印到能在悬滴中培养的微滴中，以构建一致的球体并同时维持活力和功能123。这些发现表明，可能可以使用定向分化的多能干细胞进行高通量筛选试验。使用hPSC源的细胞还可以规避药物反应研究中的物种特异性差异问题，这种问题在使用动物模型预测人体毒性时频发。
前瞻
体外3D细胞培养模型正变得越来越复杂，并逐渐运用到了支持细胞生长、组织形态发生、干细胞分化、疾病模型、药物发现及毒性测试当中。显而易见的是，各种具有不同特征的3D模型需要满足具体细胞类型或应用的需求。迄今为止，许多复杂的肿瘤发生、干细胞分化和类器官发生的3D模型使用了天然ECM基的水凝胶，如Corning? Matrigel?基质或胶原。将最新的科技（如微阵列芯片、微流控系统、生物打印）和生物相关的材料，如Matrigel基质，结合起来，可以用于协助扩大化，实现某些复杂3D细胞培养模型的高度可预测化，也有利于相关药物筛选试验和毒性测试，还可以为基础研究提供新型的系统和模型。
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细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结)
细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结) 一、消化与吹打 版上很多朋友讨论细胞培养问题，见到很多很好的经验总结，这里说一些我个人的经验，因为一些比较特殊的原因，我自己培养接触过近300种细胞，常用于做实验的，累积有百余种，可以说遇到过许多各式各样古怪的细胞。这里挑细胞消化开始做我的第一篇专题，并不是因为细胞消化最重要，而是近期看到大家频繁讨论这个话题，我就抛砖引玉，下面几点拙见，可能与其它朋友总结的一些经验有点出入，仅供大家参考。 许多同学对细胞消化做了许多研究，得出了很多有价值的经验，也见到很多人的困惑。其实细胞培养，尤其是细胞系的培养，就消化而言，不是太难，做得多了，善于总结经验，就能把细胞越养越好。一般的程序步骤，细节操作，我这里就不讲了，只讲一些基本操作背后的知识，如果不对之处，欢迎指正，一起讨论： 1，其实绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可，吸去胰酶后，残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足够消化细胞（绝大部分1min不到）。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后37度消化。 2，什么算是消化好了呢？不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙壮移动，其实已经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打成完全分离细胞，这是没有必要的。一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。细胞就是完全成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养
细胞培养实验技术大全
细胞培养实验技术大全 第一章细胞培养的基本原理与技术 现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。 第一节体外培养的概念 一、基本概念体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。 组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。 细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。 器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。 二、体内、外细胞的差异和分化 1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。 2、分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。 第二节细胞培养的一般过程 一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。 二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则
细胞培养技术个人总结
总结---细胞培养 一．基本理论概论 原代培养: 也叫初代培养，指直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养。 传代培养：将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养。 细胞系：原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。(如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系。) 细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。 培养类型：细胞培养，组织培养，器官培养。 细胞生长的方式：贴附生长，悬浮生长 培养细胞的形态（形态不一定，环境改变形态可能改变）：成纤维性型细胞，上皮型细胞（单层膜样生长），游走性细胞（游散生长，常有伪足跟突起） 二．培养过程及要点（切记无菌操作） （一）工作环境的处理 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % 酒精擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % 酒精擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 实验用品以70 %酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。吸管口切勿碰到容器瓶口 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒 感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目： CO2 钢瓶之CO2 压力。CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。 （二）试验用玻璃塑料用品清洗及其消毒灭菌 清洗： （1）玻璃器皿的清洗（酸液由重铬酸钾，浓硫酸，蒸馏水配置） 浸泡—刷洗—浸酸—冲洗 （2）胶塞的清洗 刚买回的常含滑石粉等杂质，先用自来水冲洗后再按常规方法处理。2%NaoH或洗衣粉煮沸10-20分钟---1%稀Hcl浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟—晾干备用 （3）塑料制品的清洗 2%NaoH浸泡过夜—自来水冲洗--5%稀Hcl浸泡30分钟—自来水和蒸馏水冲干备用。
(完整版)细胞实验技术
（一）干扰引物（shRNA）设计： 1、NCBI上下载基因序列 2、在sigema网站输入基因号设计一对21个碱基的干扰引物（上下游） 3、从起始密码（ATG）下游25bp开始； 4、GC含量介于40%~60% 5、干扰引物至少一个在SDS区，一个在3’UTR区 6、选择脱靶率低的 （二）、干扰载体构建 1、引物退火（引物加水看标签X 50,弹匀，瞬离） 退火体系： 上游：5ul 下游：5ul 10X M buffer 5ul H2O 35ul 水浴锅100℃2min，锅里隔夜 （三）、酶切plko.1载体 1、AgeI 酶切，反应体系： plko.1载体4ug AgeI 2ul 10X AgeI buffer 5ul H2O 39ul 37℃水浴2~3h 2、切胶回收AgeI 酶切产物，30ul 水洗脱 3、EcoRI酶切，反应体系： AgeI 酶切产物30ul EcoRI 2ul 10X H buffer 5ul H2O 13ul 37℃水浴2~3h 切胶回收，30ul 水洗脱，测浓度 （四）、连接 连接体系：T4连接： 退火引物2ul 退火引物5ul 酶切载体1ul 酶切载体1ul Solution I 5ul T4连接酶1ul H2O 2ul T4连接酶Buffer 1ul H2O 2ul 室温下连接4h。 （五）、转化 -80℃取感受态细胞于冰上融化，在1.5ml离心管加33ul感受态，将连接产物加入，冰上放置30min，42℃水浴60~90s，冰上放置2min，加入无氨苄培养基，37℃摇床1h，涂布在氨苄平板上，37℃，16h。 （六）、挑菌 用枪头挑取5个菌落（可送测序）扩大培养，加有氨苄的培养基，37℃过夜培养。 （七）、提质粒
细胞培养技术原理及应用
细胞培养技术原理及应用研究进展 姓名：赵鹏学号：158033038 专业：流行病与卫生统计学 摘要：细胞培养是指将采集体内组织的细胞模拟体内生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术，已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法。文章对细胞培养技术的应用作一综述。 关键词：细胞培养；应用；研究进展 细胞是构成机体的基本单位，是生命活动的基本单位。一切有机体（除病毒）都是由细胞组成的。细胞具有独立的、有序的自控代谢体系。因此，对细胞的深入研究是揭开生命奥秘、征服疾病的关键。细胞培养是指将采集体内组织的细胞模拟体内生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术。细胞培养技术的优点是可以直接观察活细胞的形态结构、生命活动及其变化；提供大量生物性状相似的试验对象，特别是研究大型动物（奶牛）时具有耗资少的优点。但模拟体内环境仍与实际有很大的差异，因此利用细胞培养技术的试验结果不可以轻易做出与体内等同的结论。 动物组织（细胞）培养开始于20世纪初，现已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法[1 ]。随着细胞培养技术的不断发展，现在也广泛应用于动物生产研究。20 世纪60 年代，该技术应用于水产动物的病毒分离和纯化，对于鱼类疾病的防治具有重要作用。近年来研究发现单一种子细胞难以完成构建复杂组织的需要，因此产生了联合培养细胞技术。联合培养下的细胞之间存在着精细的相互调控关系，因而更符合仿生学的原理且更有利于种子细胞的增殖与分化，为复杂的细胞诱导分化以及体外组织构建提供了新思路、新方法[2 ]。 1 细胞培养 细胞培养是将活体组织或细胞从试验动物体内取出，放在模拟体内生存环境的体外环境（无菌、适温、营养丰富）中，使高体细胞生长、发育的一种方法。按照培养的结构成分不同，将其分为组织培养、细胞培养及器官培养等。根据细胞是否在支持物上生长，将其分为贴壁型和悬浮型。一般来说，圆形细胞如淋巴细胞属于悬浮型，而胞体梭型（成纤维型细胞）、扁平不规则（上皮型细胞）等属于贴壁型，贴壁型细胞必需贴附在支持物表面生长。细胞培养开始于1906 年，Harrison 用蛙新鲜淋巴液培养蛙胚神经组织4 周，首次成功地利用体外培养液培养神经元，标志着组织细胞的体外培养模式的基本建立。随着细胞培养技术的不断发展和完善，20 世纪50 年代进入繁盛阶段，细胞培养逐渐被基础研究与应用领域所应用，特别是在医学领域得到迅速的发展。目前，细胞培养技术已经涉及到生物学、农业、环境保护等领域[ 3 ]。 目前，在细胞培养过程中，只能根据离体细胞的特点和培养条件，提供满足其生长和发育的一些基本生理条件。必须在无菌条件下进行，细胞感染微生物后，会因被夺营养物质而导致细胞生长缓慢或停滞，甚至死亡。需要提供适宜的温度和pH，一般哺乳动物细胞培养的温度控制在37 ℃，鱼类的温度要低一些。温度过高或过低时，均不利于细胞生长甚至会导致细胞死亡。动物细胞最适宜pH一般控制在7.2~7.4，在此范围细胞生长活跃，增殖速度快，如果过低或过高性，细胞会因为细胞膜受损而死亡。细胞离体培养技术的关键是细胞培养液的设计，理想的细胞培养液可以同时解决细胞离体培养所需要的pH、渗透压、营养物质、调节物质的全部需要。细胞培养液中需含有细胞增殖、生长所需要的各种营养物质。如提供能量的物质（N源、C源）、代谢调节控制的物质（无机盐、维生素、激素）。另外，在细胞培养过程中需要提供一定量的气体（O2和CO2）。CO2具有调节pH和缓冲的作用，一般提供5% CO2。
三维细胞培养技术在再生医学研究中的应用
三维细胞培养技术在再生医学研究中的 应用 摘要：体外细胞培养技术已成为细胞生物学、药学、毒理学、干细胞、系统生物学和新药创制等领域必不可少的工具。传统平板细胞培养方法使细胞单层生长于二维环境，不能产生体内的细胞外基质屏障。且细胞表型也异于原代细胞，而三维细胞培养技术通过模拟机体内细胞生长的生理微环境，利用各种支架或设备来促进细胞生长和组织分化，产生具有合理形态结构和功能性的组织，具有细胞培养直观性和条件可控性的优势，故其在再生医学应用方面有着非常大的发展潜力。本文从干细胞、血管再生、器官移植、以及组织修复等方面综述了近期三维细胞培养技术在再生医学研究中的应用，并介绍了三维细胞培养技术在功能性生物材料方面研究中的作用，有助于对功能性生物材料的表面改性设计研究。 关键词：三维细胞培养技术；再生医学；干细胞；血管再生；器官与组织修复 随着生物医学的发展．疾病的治疗方式已得到了极大改进。但组织器官严重损伤后修复缓慢，或由于创伤过大而致组织器官无法修复，使得再生医学成为当今生物医学的关注焦点和研究热点。体外建立适合细胞和组织生长的生理微环境对再生医学研究至关重要，而传统的单层平面培养的细胞无论是在形态，结构和功能方面都与在体内自然生长的细胞相去甚远．由于无基质支持，细胞仅能贴壁生长。从而失去其原有的形态特征及生长分化能力，而三维细胞培养技术以其能为细胞和组织创造一个均衡获取营养物质、进行气体交换和废物排出的理想生理场所。又易于形成具有合理形态和生理功能的组织器官等特点，广泛应用于再生医学的研究[ ]。目前，三维细胞培养方式发展迅速，包括皮氏培养瓶、灌注小室、搅拌式生物反应器、中空纤维生物反应器、以及微重力旋转生物反应器等培养方式。其中微重力旋转细胞培养技术因其特有的微重力环境，使细胞与细胞、细胞与载体的交联度、沉降力、机械力、压力等发生相互作用、相互制约，模拟了近似生物体内细胞的生长状态和微环境，在再生医学领域应用中备受关注.。除再生医学以外，三维细胞培养技术也常被应用于药物载体、药物毒理、药物筛选、肿瘤治疗等方面的研究 1 三维细胞培养技术在再生医学应用中的优势 三维细胞培养技术使用三维支架或设备细胞提供类似体内生长环境的支架或基质．建立细胞问及细胞与胞外基质问的联系．促进细胞近似于体内的基因表达、基质分泌及细胞功能活动，形成一定的三维结构，既保留了体内细胞微环境的物质结构基础．又实现了细胞培养的直观性及条件可控制性，便于研究人体生理、病理状况，以及预防或疾病的治疗。三维细胞培养技术主要通过体内和体外两种方式。实现其在再生医学中的应用，两者皆采用从机体获得功能细胞。细胞体外扩增培养后，与三维结构的生物材料按一定比例混合。前者是直接植入体内
动物细胞培养技术实验教程内容
实验1 细胞培养概述 （一）细胞培养室的设置和无菌操作 【实验原理】 细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。一般标准的细胞培养室应包括配液室、准备室和培养室。三室既相互连接又相对独立，各自完成培养过程中的不同操作。 【实验目的】 ①了解培养室的设置和设备。 ②学习无菌概念和无菌操作要领。 【操作步骤】 1．实验室设置 （1）配液室 （2）准备室 （3）培养室 培养室内要完全密闭，保持恒定的温度，在设计上要注意以下几点： ①培养室的位置最好设在阴面，阳光不能直接照射的地方，防止室内温度增高。 ②天花板的高度不要超过2米，以保证紫外灯的有效杀菌效应， ③门一般用拉门，以防止空气流动。 ④天花板、地板和四周墙壁要光滑无死角，要镶瓷砖或涂油漆，这样设计，一是便于清洗和消毒，另外也不易在墙角堆积灰尘。 2．实验室常用设备 （1）准备室的设备 ①双蒸馏水蒸馏器：制备双蒸水。 ②酸缸：盛洗液，浸泡玻璃器具。 ③干燥箱：洗涤完的玻璃器皿用干燥箱烘干。 ④高压锅：玻璃器皿、解剖用具、部分液体、塑料器具等灭菌。不同物品其有效灭菌压力和时间不同。 ⑤储品柜1：放置未消毒物品。 ⑥储品柜2：放置已消毒物品。 准备室注意事项： ①预防蒸馏器被烤干。 ②勿将酸液溅到衣物或地面。
③勿将高压锅排气阀和安全阀堵塞。 ④已消毒物品应与未消毒物品分柜存放。 （2）配液室的设备 ①天平（扭力天平和电子天平）：称量用 ②pH计。 ③磁力搅拌器。 （3）细胞培养室的设备 ①超净工作台： 超净工作台的种类很多，有单面单人、单面双人、双面双人或双面四人等，其工作原理是利用鼓风机，使通过高效滤气的空气，徐徐通过台面，这样使工作环境中具无菌而均匀的空气。 根据层流方式的不同，超净工作台主要分为水平层流式和垂直层流式两种，基本原理大致相同，都是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器，由此送出的洁净气流从一定的均匀的断面风速通过无菌，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。但两种净化台的气流方向不同。 使用超净工作台应注意的几点问题： A．净化工作台最好安装在无尘的房间内，最好为隔离好的无菌间内，以免尘土过多易使滤器阻塞，降低净化效果，缩短使用寿命。 B．新安装的或长期未使用的工用台，工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作，再采用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。 C．每次使用工作台时，应先用75%酒精擦洗台面，并提前以30~50min紫外线灭菌灯处理净化工作区内积累的微生物。在关闭紫外灯后应启动送风机使之运转两分钟后再进行培养操作。
转化医学论文——3D细胞培养技术
3D细胞培养技术的发展和应用 摘要：传统细胞培养技术在模拟细胞体内生存环境方面做得还不够。 3D细胞培养技术的发明就是为了在细胞培养过程中，为细胞 提供一个更加接近体内生存条件的微环境。本文阐述了何为 3D细胞培养技术，3D细胞培养技术的发展过程以及其最新科 学进展。主要描述3D细胞培养技术的基础理论发展到临床实 践应用的过程，让读者了解并知道什么是3D细胞培养技术以 及其临床实践应用，使3D细胞培养技术更能有效、普遍地应 用于临床治疗中去，造福处在疾病中的人们。 关键词：3D细胞培养技术 3D心脏组织人工器官 正文： 一、什么是3D细胞培养技术 体外细胞培养的一个重要原则是需模拟体内细胞生长环境,该模拟系统中最重要的核心因素是细胞与培养环境之间的相互作用。3D 细胞培养技术(TDCC)是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养,使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长,构成3D的细胞载体复合物。3D细胞培养是将细胞培植在一定的细胞外基质中,细胞外基质(ECM)蛋白充当生长支架,使得细胞能够分化产生一定的三维组织特异性结构,所创建的细胞生长环境,则最大程度地模拟体内环境。TDCC作为体外无细胞系统及单层细胞系统的研究与组织器官及整体研究的桥梁,显示了它既能保留体内细胞微环境的物质及结构基础,又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。近几年3D细胞培养技术在组织形成、血管发育和器官再造等发育生物学的分支领域得到了广泛的应用。 二、3D细胞培养技术的原理 利用磁性微球载体和磁悬浮技术使贴有细胞的微球载体悬浮在培养液中，确保了高质量、高密度的细胞繁殖，突破了传统有盖培养皿、培养瓶或微孔板细胞培养耗时繁琐，细胞产量微小等局限性。 三、3D细胞培养技术的临床应用 1、神经系统
细胞培养全过程
我是细胞培养的新手，在开始养细胞前看到篇文章（老师给的）很实用，希望对大家有帮助。细胞培养室实验操作规范 一、细胞培养室的环境 1. 细胞生长要求严格的无毒无污染环境，因此必须注意培养室的清洁卫生，保持操作空间的无菌条件： 1) 培养室应为独立、封闭的空间。培养室及缓冲间都应保持整洁，不要随意出入； 2) 保持超净工作台的无菌环境，每次使用前打开紫外灯照射消毒15—30分钟；每次使用后将废弃物清理干净，各用具规放整齐，用70%酒精擦净台面，再打开紫外灯照射30分钟以上； 3) 定期擦洗桌面、地板、清洁培养室，并用0.1%的新洁尔灭溶液消毒；定期打开培养室的大紫外灯，将整个房间进行照射消毒； 4) 每次打开培养箱前，或手伸入超净工作台进行操作之前，均应用70%酒精擦手。 5) 定期清理冰箱。将药品试剂分类摆放，过期的试剂应及时清除； 6) 培养箱要定期清洁。隔板及内壁等用0.1%的新洁尔灭溶液清洗，再用70%酒精擦净；并要注意底层水箱的水位，及时补充水份； 7) 注意监测CO2的气压，及时补充。 8) 注意监测液氮罐中液氮的挥发情况，及时补充，液面不能低于最高一层细胞冻存盒的位置。 2. 实验器具的清洗、消毒灭菌： 1) 反复使用的器皿应严格清洗干净，其清洗程序为：清水浸泡——去污剂刷洗
——清水冲洗——超声波洗涤——洗液浸泡（过夜）——充分冲洗（务必冲洗干净，不能残留洗液）——蒸馏水漂洗——烘干；若为新的玻璃器皿，要在刷洗后用5%的稀盐酸浸泡过夜。 *洗液：浓硫酸+重铬酸钾 2) 胶塞的清洗：清水浸泡——2%NaOH煮沸10—20分钟——冲洗——1%稀盐酸浸泡30分钟——充分冲洗——蒸馏水漂洗——烘干 3) 玻璃器皿，如玻璃吸管、离心管、玻璃培养瓶、套管等等以及胶塞，清洗后均可用高压蒸气灭菌，15磅灭菌30分钟。 4) 不能高压灭菌而又需反复使用的器具，如加样枪、多道枪的加样槽、塑料吸头等，应事先用70%的酒精擦洗，置于超净工作台中用紫外线照射2小时以上。 二、细胞培养用水、用液： 1. 胞培养必须使用玻璃蒸馏器制备的三次蒸馏水，二次蒸馏水或外购的金属蒸馏器制备的蒸馏水只能用来清洗器皿； 2. 平衡盐溶液（BSS）严格按照配方配制，含Ca++、Mg++离子的要避免其沉淀。可过滤灭菌或高压灭菌。采用高压灭菌时如含有葡萄糖等成份，应避免高压过度，一般8磅10分钟及即可。灭菌后的BSS于4℃冰箱中保存，如出现浑浊或沉淀时，应废弃，重新配制。 3. 培养液的配制，以配制1000ml RPMI1640为例： 1) 将RPMI1640干粉倒入约800ml三蒸水中，搅拌使其溶解； 2) 加入5.94g HEPES，在磁力搅拌器上搅拌约半小时； 3) 加入2g NaHCO3，继续搅拌约2小时； 4) 定容至1000ml；必要时用1N NaOH凋至PH7.0 5) 过滤除菌。滤纸由上到下为：普通定性滤纸、0.4μm滤膜、0.22μm滤膜；
分子克隆及细胞培养基本实验方法
分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）
①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平 端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴 于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应
细胞培养
实验二细胞传代培养 一、目的和要求 (1) 掌握贴壁细胞传代的培养方法； (2) 掌握细胞计数和存活率计算方法； (3) 培养建立无菌操作意识。 二、实验原理 细胞培养是培养连续细胞系或者离体正常组织或肿瘤细胞的技术。当离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止；若不及时分离、传代培养，细胞将逐渐衰老死亡。传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或其他比例转移，接种到其他培养瓶的培养。贴壁细胞的传代通常是用胰蛋白酶消化，把细胞分散成单细胞再传代；而悬浮生长的细胞则用直接法传代或离心法传代。 细胞计数是观察判别所培养细胞的状态的重要手段，也是细胞传代培养及判断实验处理对细胞的影响所必需的方法。细胞计数的结果一般用每毫升（液体培养）或每平方厘米（固体单层培养）的细胞数来表示。通常细胞计数是运用光学显微镜和血球计数板对细胞进行直接计数。图1为血球计数板一个计数区的示意图。血球计数板具有两个可以计数的区室，每个计数区由9个亚区构成，每个亚区的面积为1mm2，同时血球计数板上覆盖一个具有一定厚度的血盖片，保证计数区与盖片之间的距离为0.100mm。当盖片放置正确，每个亚区上的体积为0.1mm3即1×10-4mL。统计计数区中的4个角亚区中的平均细胞数（或中央亚区中的细胞数），记做N；若在准备过程中，对细胞的稀释倍数为D，则样品的细胞密度 4 N C个/mL。 =D ? 10 ? 图1 血球计数板构造示意图细胞膜是一层选择性通过的半透膜，当细胞膜完整时，某些染料无法进入细胞中。利用这一特性可以进行细胞存活检查。通常使用台盼蓝，活细胞无法被台盼蓝染色，而死细胞则会吸收染料被染色。 三、器材与药品 (1) 实验器材： CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压灭菌锅、水浴锅、离心机、血球计数 板、离心管、培养瓶、移液枪、微孔滤器等。 (2) 实验材料：
2015 动物细胞培养技术实验报告
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
细胞培养技术
细胞培养技术 指的是细胞在体外条件下的生长，在培养的过程中细胞不再形成组织（动物）。 定义 培养物是单个细胞或细胞群。细胞在培养时都要生活在人工环境中，由于环境的改变，细胞的移动或受一些其他因素的影响，培养时间加长，传代导致细胞出现单一化型。 在现代医学和生物科学研究中应用广泛 优点 1.直接观察活细胞的形态结构和生命活动。用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究. 2.直接观察细胞的变化可便于摄影。 3.研究细胞种类如低等到高等到人类、胚胎到成体、正常组织到肿瘤。 4.便于使用各种技术：相差、荧光、电镜、组化、同位素标记等方法观察和研究细胞状况。 5.是分子生物学和基因工程学的研究对象，也是其主要的组成部分。 6.易于施用物理、化学生物的实验研究。 7.易于提供大量生物性状相似的实验对象,耗资少比较经济。 8.成为生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源。 缺点 组织和细胞离体后独立生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内环境，仍有很大差异。因而利用培养细胞做实验时，不应视为体内细胞完全相同，把实验结果推测体内，轻易做出与体内等同的结论。 细胞类型 细胞类型根据是否附于支持物上生长的特性，分为: 贴附型悬浮型（一）贴附型 细胞贴附在支持物表面生长，只依赖贴附才能生长的细胞叫做贴附型细胞(Anchorrage-dependent cells)这种现象与细胞分化有关。 贴附型细胞的分型 1.成纤维型细胞：(fibroblast) 来自中胚层 特点：与体内成纤维细胞形态相似,胞体梭型或不规则三角形,中央有圆形核,胞质向外伸出2～3个长短不同的突起。细胞在生长时呈放射状,漩涡或火焰状走行。 起源：细胞来自中胚层间充质组织。 除真正的成纤维细胞、心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮细胞。
从二维到三维细胞培养的变迁
从二维到三维细胞培养的 变迁 Newly compiled on November 23, 2020
细胞培养技术进展概述及分析 细胞培养一直是细胞生物学中基础且核心的部分。无论是进行细胞性状研究，还是进行细胞产物的研发，都需要以细胞体外扩增技术-即细胞培养技术为基础。随着生命科学的发展，细胞培养技术更是被广泛应用于生物学、、新药研发等多个领域，成为生命科学最重要的基础技术之一。 传统的细胞培养即细胞的平面培养，细胞在培养过程中只能沿平面延伸，属于细胞的二维培养技术。这种培养方式经济、便利、易操作，符合某个历史阶段对细胞培养技术的要求。但随着研究的深入，传统的二维培养技术已经不能满足细胞培养需求。盖因生物体内的细胞是在立体三维的微环境中生长的，二维培养微环境与体内微环境差异太大，影响细胞的基因表达、信号转导等，导致所培养的细胞逐渐丧失其在生物体内的生物学特性及功能，失去研究及应用价值。传统的二维培养技术，已经成为细胞学为基础的众多学科进步的壁垒之一。 科学家开始寻求更贴近自然状态的细胞培养技术。一种与活体组织内的细胞外基质相似的，能更好的模拟细胞在体内生长环境的培养技术，即细胞的三维培养技术。 目前已开发出很多细胞三维培养技术，大致可分为需要支架的三维培养技术和不需要支架的三维细胞培养技术。支架类主要是在三维空间内构建供细胞附着和生长的类似脚手架的多孔结构, 细胞依附于支架进行三维生长和迁移, 主要的支架材料有胶原和水凝胶等；而不需要支架的三维培养技术主要是通过物理方法使贴壁细胞悬浮于培养基中以达到三维培养的目的, 目前主要的技术有微载体、磁悬浮、悬滴板和磁性三维生物印刷等技术。
细胞培养实验技术手册
实验记录 24/2/2014 一、细胞培养 一、培养基的配制 a. RPMI 1640 1×（with L-glutamine）类培养基组分：RPMI ，10%FBS（胎牛血清），双抗生素（penicillin，盘尼西林（青霉素），streptomycin，链霉素）； 配制方法：500 ml RPMI(一瓶) + 50 ml FBS + 5 ml 双抗生素 b. DMEM 1×类培养基组分：DEMI，10% FBS，双抗生素； 配制方法：500 ml DMEM(一瓶) + 50 ml FBS + 5 ml 双抗生素 二、培养细胞RNA的提取 1.从培养箱中拿出6孔板（每孔培养2 ml），吸出培养液； 2.PBS清洗；用大枪管吸取PBS加入每个培养孔中（枪头不要触碰培养板，防止交叉污染），用1 ml枪吹匀清洗（把培养板倾斜，吸溶液指最高处打出）。重复以上操作一次。 3. 每孔中加1 ml Trizol ，吸出放-80℃冰箱冷冻。 三、培养细胞DNA的提取 1.从培养箱中拿出6孔板（每孔培养2 ml），吸出培养液； 2.PBS清洗；用大枪管吸取PBS加入每个培养孔中（枪头不要触碰培养板，防止交叉污染），用1 ml枪吹匀清洗（把培养板倾斜，吸溶液至最高处打出）。重复以上操作一次。 3. 向培养板中加酶消化（时间较长，放进培养箱，看到有白色悬浮后取出），取出加DMEM类培养基； 4. 吸出至1.5 ml 离心管，3600 rpm，4 min离心； 5. 吸出上清（不要触及沉淀），加PBS 1ml清洗，3600 rpm，4 min离心； 四、常用细胞系（人） 名称细胞类型来源核型培养液 A431 上皮型表皮细胞肿瘤非整倍体（76，XX）DMEM+10%FBS HeLa 上皮样宫颈癌非整倍体（81-83，XX）MEM+NEAA 10%FBS Hep G2 上皮样肝细胞癌非整倍体（55，XY）MEM+NEAA 10%FBS MEM：极限必需培养液（Eagle）；NEAA：非必需氨基酸；DMEM：Dulbecco’s MEM改良培养液；RPMI：Roswell Park Memorial 研究所；BrdU：5-溴脱氧尿苷；APRI：腺苷磷酸核糖转移酶 实验室除snu系列与国产7721用1640培养基，其它用DMEM培养基。 五、原代培养----肝细胞 1.切除乳鼠肝脏组织放进小烧杯中，用PBS或培养液漂洗2-3次，去除血污； 2.加少量培养液，用剪子把组织剪碎，1 平方mm左右，再用吸管吹打； 3.加含10%小牛血清的1640培养液，制成均匀的细胞悬液，移入培养瓶，将组织块放在培养瓶底部，采用薄层营养液培养法，盖上瓶盖。 4.换液，只将旧的培养液吸弃，换上新的培养基。 六、传代培养 1.显微镜观察是否需要传代 细胞生长良好：上清液清亮，无悬浮物，折光性好，均质而透明，胞膜完整，胞内颗粒少，无空泡和脂滴。细胞生长不良：悬浮物多，发差增大，胞膜不完整，胞质中颗粒多，出现空泡和脂滴。
细胞培养技术发展史及培养条件 黄璐
学号：20095071126 系（院）生命科学学院 专业生物科学专业 年级 2009 级 姓名黄璐 论文（设计）题目细胞培养技术的发展史及培养条件 指导教师卢东升职称教授 2011 年 5 月16 日
目录 摘要 (2) Abstract (2) 0引言 (3) 1细胞培养技术发展史 (3) 2细胞培养的条件 (4) 2.1 细胞培养的一般条件 (4) 2.1.1温度 (4) 2.1.2 pH (4) 2.1.3 渗透压 (4) 2.1.4 营养物 (4) 2.1.5 水 (5) 2.1.6 无菌条件 (5) 2.1.7 光 (5) 2.1.8 气体 (5) 2.2动物细胞培养的特殊条件 (5) 2.2.1 血清 (6) 2.2.2 支持物 (6) 2.2.3 气体交换 (6) 2.3植物细胞培养的特殊条件 (6) 2.3.1 光照 (6) 2.3.2 激素 (6) 2.4微生物细胞培养的特殊条件 (6) 3小结 (7) 参考文献 (7)
细胞培养技术的发展史及培养条件 学生姓名：黄璐学号：20095071126 生命科学学院生物科学专业 指导教师：卢东升职称：教授 摘要：19世纪英国生理学家Sydney Ringer研制出可维持离体动物心脏跳动的盐溶液，1885年德国人Roux用温生理盐水在体外培养鸡胚组织并存活数月，从而开始了组织培养。1907-1912年，人们创建了悬滴培养法，由此建立了体外培养组织。从50年代起，细胞培养进入了迅速发展的阶段并渗透到其他学科中，目前细胞培养技术已广泛用于生物学和医学研究的各个领域。细胞的生长需要一定的营养环境，细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使期生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。因此离体的细胞培养需要在温度、pH、营养物、无菌环境、气体等方面进行设置。而动植物细胞和微生物细胞的培养均有其自身的特殊培养条件。关键词：组织培养；细胞培养；细胞生长；培养条件 Abstract:The 19th century British physiologist Sydney Ringer developed from the body can maintain the salt solution animal the beating of the heart, in 1885 German Roux with warm saline the in vitro culture of chicken embryos organization and live for months, and thus began the tissue culture. 1907 - 1912, people created suspended drops culture method, creating the in vitro organization. From the 1950s on, cell culture into the rapid development stage and spread to other disciplines, currently cell culture technology has widely used in biology and medicine for different areas of study. Cell growth need certain nutrients environment, cell culture refers to remove cells from body organization in the presence of the environment, echoing the ph and sterile, proper temperature conditions, with certain nutrients that period, and maintain its to grow the structure and function of a culture technology. So the cells from the body in need of cultivation temperature, ph, nutrients, sterile environment, gas, etc Settings. But animals and plants cells and microbial cells cultured in all has its own special cultivation condition.