动物细胞培养实验设计
动物细胞培养实验报告
动物细胞培养实验报告第一篇：一、实验目的1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。
2、学习并掌握细胞传代培养的方法。
3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。
二、实验原理细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。
动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。
传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。
被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
三、细胞培养相关设施及材料1、细胞培养室无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。
孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。
制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。
储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。
清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。
2、细胞培养常用基本设施：荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。
动物细胞培养实验设计教案：选材与变量控制策略
动物细胞培养是生物学和生命科学领域中应用广泛的一种重要实验技术。
在科学研究和临床医学等领域，动物细胞培养实验被广泛运用，用于药物筛选、疾病模型构建、生长因子和信使分子生物学研究等。
本篇文章将从动物细胞培养实验选材和变量控制策略两个方面进行讲解，以帮助读者更好地设计动物细胞培养实验教案。
一、动物细胞培养实验选材1.培养物资料的准备动物细胞培养实验中，培养物资料的准备是非常关键的一个环节。
我们需要选择适当的生物材料，如细胞株、药物和微生物等，以确保实验结果的可靠性和稳定性。
细胞株的选择应该根据实验目的来确定，如需要研究某种疾病模型，我们可以选择与病理学相关的人类细胞株，如乳腺癌细胞株MCF-7；如果需要筛选新型潜在药物，我们可以选择与药物代谢和药效相关的肝癌细胞株HepG2。
此外，在选择细胞株时还要考虑其生长速度、细胞数、生长条件等因素。
药物的选择应该以实验的目的和细胞株稳定性为基础。
比如，如果需要研究某种药物的毒性，我们可以选择其不同浓度的药物进行培养，并观察细胞的生长及形态变化。
在选择药物时还需注意其溶解度、稳定性等因素。
2.培养条件的设置动物细胞培养实验中，培养条件的设置是确保实验稳定性和可重复性的前提。
培养条件包括培养基配方、培养温度、CO2浓度、培养时间等因素。
培养基的选择要根据培养细胞株的需求，可以根据文献资料中的配方或进行适当的调整和优化。
在培养过程中，需要注意培养基的PH值、温度、灭菌等因素，以保证细胞的健康生长。
温度和CO2浓度的设置对细胞的生长、代谢和分化具有非常重要的影响。
在一般的培养条件下，温度一般设置在37℃，CO2浓度一般为5%。
当然，在不同实验情况下，温度和CO2浓度的设置也会有所不同。
二、变量控制策略动物细胞培养实验中，各种因素的变化都可能会影响实验结果。
如何控制变量，确保实验结果的可信性和稳定性，是每个研究人员需要仔细思考和控制的问题。
下面我们就来探讨一些常见的变量控制策略：1.正确执行实验正确的实验操作是确保实验结果可重复性的基础。
动物细胞工程设计方案模板
动物细胞工程设计方案一、项目名称：____________________二、项目背景：____________________三、项目目标：____________________四、实验材料：1. 动物细胞：____________________2. 试剂：____________________3. 仪器设备：____________________五、实验方法与步骤：1. 动物细胞的培养：（1）取动物组织，剪碎并加入胰蛋白酶分解成单个细胞。
（2）制备动物细胞培养液体培养基，将细胞接种至培养基，放入二氧化碳培养箱中进行初代培养。
（3）当细胞增殖达到一定程度，出现接触抑制现象时，用胰蛋白酶再次处理，并用细胞悬液吹打贴壁生长的细胞。
进行细胞计数。
（4）依照计数结果，分瓶培养，进行传代培养。
获得细胞系或细胞株。
2. 动物细胞融合：（1）选择适当的融合方法，如电融合、聚乙二醇诱导融合等。
（2）将目的细胞和辅助细胞进行融合实验。
（3）筛选融合细胞，并进行鉴定。
3. 动物细胞核移植：（1）取成熟雄性青蛙的体细胞，去除细胞核。
（2）将正常雄性青蛙的体细胞的细胞核移植到去核卵细胞中。
（3）将移植后的卵细胞培养至胚胎阶段。
（4）将胚胎移植到受体青蛙中，观察发育情况。
六、预期结果：1. 成功培养出所需的动物细胞株。
2. 实现动物细胞融合，获得具有特定性状的融合细胞。
3. 成功进行动物细胞核移植，获得具有全能性的核移植胚胎。
七、实验结果分析与讨论：1. 分析培养出的动物细胞株的特性，与预期目标进行对比。
2. 分析融合细胞的性状，探讨融合效率和稳定性。
3. 分析核移植胚胎的发育情况，探讨细胞核全能性的实现程度。
八、实验结论：1. 成功实现了动物细胞工程的实验目标。
2. 掌握了动物细胞培养、融合和核移植的基本技术。
3. 为后续相关研究提供了实验基础和参考。
九、实验注意事项：1. 严格遵守无菌操作原则，确保实验材料的纯净度。
动物细胞培养实验方案
实验一清洗与灭菌一、实验目的：能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。
二、实验原理清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。
体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。
细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。
清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。
如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。
灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。
假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。
以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。
三、实验材料、用品1．材料：无臭氧型紫外灯，微孔滤膜(直径25)：孔径为0．22μm，微孔滤膜(直径90)：孔径为0．22 μm，过滤器(直径25)。
2．药品：70％或75％酒精，0．1％新洁尔灭，煤酚皂溶液(来苏儿水)，0．5％过氧乙酸，乳酸，37％甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸(工业)。
3．仪器：超净台，干燥箱，高压蒸气灭菌锅，过滤器，过滤泵。
四、实验步骤(一)清洗1．新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡5％稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物质和其他有害物质。
2．使用过的玻璃器皿的清洗(1)使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。
(2)用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥。
(3)浸酸性洗液过夜。
(4)从酸性洗液捞出后自来水冲洗10．15次去除残余酸液，蒸馏水涮洗3次，倒置烘干。
(5)包装(牛皮纸或一般纸)。
(6)高压(15磅20 min)或干热(170℃2 h)灭菌。
(7)贮存备用。
3．胶塞的处理(1)新胶塞应先用清水清洗之后再用0．2％NaOH煮沸lO-20 min。
(2)自来水清洗10次。
(3)再用1％稀盐酸浸泡30 min。
动物代培养实验报告(3篇)
第1篇实验名称：动物细胞代培养实验实验目的：1. 学习动物细胞培养的基本原理和方法。
2. 掌握动物细胞传代培养的操作步骤。
3. 观察细胞生长、增殖和衰老过程。
实验时间：2021年X月X日实验地点：实验室实验材料：1. 动物细胞系：小鼠成纤维细胞（NIH3T3）2. 培养基：DMEM培养基3. 细胞消化液：0.25%胰蛋白酶4. 抗生素混合液：青霉素（100U/ml）、链霉素（100μg/ml）5. 细胞培养瓶：25cm²6. 移液器：200μl、1000μl7. 吸管：5ml、10ml8. 酶标仪：波长450nm9. 电子显微镜10. 计时器实验方法：1. 细胞复苏：将冷冻保存的细胞从-80℃冰箱中取出，放入37℃水浴中解冻，然后将细胞转移到含有抗生素的DMEM培养基的细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
2. 细胞传代：待细胞生长至70%-80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，收集细胞，用DMEM培养基清洗细胞，计数，按照1:10的比例传代。
3. 细胞培养：将传代后的细胞接种于细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
4. 观察细胞生长：每隔24小时观察细胞生长情况，记录细胞数量、形态和活力。
5. 细胞衰老：培养细胞至第30代，观察细胞衰老特征，如细胞形态、活力等。
实验结果：1. 细胞复苏：复苏后的细胞呈圆形，细胞活力较高。
2. 细胞传代：细胞传代过程中，细胞活力保持稳定，细胞数量逐渐增加。
3. 细胞培养：培养过程中的细胞形态良好，细胞活力较高。
4. 细胞生长：细胞数量在培养过程中呈指数增长，符合细胞增殖规律。
5. 细胞衰老：细胞培养至第30代时，细胞形态发生改变，细胞活力下降，出现衰老特征。
实验讨论：1. 动物细胞培养过程中，细胞的生长、增殖和衰老是细胞生命活动的基本过程。
本实验通过观察细胞生长、增殖和衰老过程，了解了动物细胞代培养的基本原理和方法。
2. 细胞传代过程中，细胞活力保持稳定，细胞数量逐渐增加，说明本实验操作规范，细胞培养条件适宜。
动物细胞培养实验方案
动物细胞培养实验方案一、实验目的：1.掌握动物细胞的培养技术；2.了解动物细胞的生长特点和培养条件要求；3.学习观察和分析动物细胞的形态变化和生长状态。
二、实验器材与试剂准备1.器材：细胞培养器皿（如培养皿、蜡烛罩、CO2培养箱等）、离心机、显微镜、细胞计数板、计时器等；2.试剂：细胞培养基、培养液添加剂（如酶、抗生素等）、PBS缓冲液、生长因子、染色剂等。
三、实验步骤1.细胞培养基的配制：按照制定的配方将培养基粉末加入适量的无菌去离子水中，搅拌均匀后，进行高温高压灭菌，冷却后分装至培养器皿中；3.细胞处理和接种：将收集到的组织先用PBS缓冲液洗涤，然后使用细胞裂解酶或胰酶等消化酶消化组织，使细胞分散，处理成单个细胞后，用细胞计数板计数，并将细胞悬液接种到预先准备好的培养器皿中；4.细胞培养条件的控制：将培养器皿置于CO2培养箱中，设定适当的温度（通常为37℃）、湿度和CO2浓度（通常为5%），并保持稳定；5.细胞培养的观察和记录：观察培养皿中细胞的形态变化和生长状态，记录细胞的外观、增殖情况、易于观察的指标等；6.细胞的子培养和冻存：当细胞达到一定密度时，可以进行子培养，即将细胞从一个培养皿中转移到新的培养皿中，以促进细胞的增殖和保存细胞生物资料。
此外，也可以将分散的细胞加入由培养液和冻存剂组成的试管中，通过冷冻的方式保存细胞，并用于后续的实验。
四、实验控制与常见问题的解决1.环境控制：细胞培养箱中的温度、湿度和CO2浓度的调整应尽量保持稳定；2.培养基的配制：根据细胞培养物的不同，可以选择不同配方的培养基，确保培养基的质量符合要求；4.洗涤步骤：组织或细胞的洗涤步骤应轻柔，避免对细胞的损伤；5.细胞的接种量：对于粘附性细胞，接种量应适当，以避免细胞过度堆积或过度稀释。
五、实验结果和分析观察培养皿中细胞的生长状态、细胞数量以及形态的变化，记录生长状态、增殖情况和其他可以观察到的指标，并进行数值化分析和统计。
动物细胞培养的教案
动物细胞培养的教案教案标题：动物细胞培养的教案教案目标：1. 了解动物细胞培养的基本原理和技术；2. 掌握动物细胞培养的步骤和操作方法；3. 培养学生的实验技能和科学思维。
教案内容：一、前导活动：1. 引入：通过展示一些关于动物细胞培养的图片或视频，引起学生的兴趣，并与学生讨论动物细胞培养的重要性和应用领域。
2. 激发问题：提问学生关于动物细胞培养的问题，如为什么要进行动物细胞培养？培养动物细胞有哪些应用？二、知识讲解：1. 基本原理：讲解动物细胞培养的基本原理，包括培养基的选择与配制、细胞的来源与处理、培养条件的控制等。
2. 培养步骤：详细介绍动物细胞培养的步骤，包括细胞的分离与传代、培养基的制备、细胞的接种与培养、细胞的观察与记录等。
三、实践操作：1. 实验准备：组织学生进行实验前的准备工作，包括实验器材和试剂的准备、消毒操作等。
2. 细胞的分离与传代：指导学生进行细胞的分离与传代实验，要求学生掌握正确的操作技巧和注意事项。
3. 细胞的培养与观察：指导学生进行细胞的接种与培养实验，并引导学生观察细胞的形态变化、生长情况等，并记录实验结果。
四、实验总结：1. 结果分析：引导学生对实验结果进行分析和总结，让学生思考实验中出现的问题和现象。
2. 实验讨论：组织学生进行实验讨论，鼓励学生发表自己的观点和意见，促进学生之间的交流和思想碰撞。
3. 实验评价：对学生的实验操作和实验报告进行评价，给予学生鼓励和建议，激发他们对科学实验的兴趣和热情。
五、拓展延伸：1. 应用探究：引导学生了解动物细胞培养在医学、生物工程等领域的应用，并鼓励学生自主探究相关的研究进展和前沿技术。
2. 实验设计：鼓励学生设计自己的动物细胞培养实验，培养他们的实验设计能力和创新思维。
六、教学反思：1. 教学效果评价：对本节课的教学效果进行评价，总结教学过程中存在的问题和改进的方向。
2. 教学反思：反思自己的教学方法和策略，思考如何更好地提高学生的学习兴趣和学习效果。
动物细胞培养技术实验指导(全面)
实验篇实验一实验器材的清洗实验物品（一）每一大组公用物品（每班分6大组）吸球4个、酒精棉球瓶两个、消毒水一瓶、吸瓶两个、计数板1块、洗液缸一个、95%酒精1瓶。
（二）每一小组公用物品（两人一小组）刻度吸管5毫升4支, 小漏斗1个、 80-200铜滤网1块、培养皿2个、 l00毫升盐水瓶及塞子4个、l0毫升盐水瓶及塞子1个、100ml培养瓶及塞子4个、10ml 培养瓶及塞子1个、镊子1个、剪刀1把、冻存管（1.5毫升，2毫升）2个、软毛刷2个、塑料盆一个。
（二）公用物品小滤器、大滤器2个、1000毫升量筒2个、100毫升量筒2个、家用剪刀、耐酸乳胶手套长的两双、短的四双、酒精一壶、玻璃棒几个、 0.22μm的小滤膜一盒、电炉3个。
清洗注意事项和要求（一）使用后的实验器材应立即投入清水中。
带毒的玻璃器皿需先浸泡在5％来苏儿或1％盐酸溶液中（依病毒的种类而定）1天以上或高压灭菌。
（二）浸泡、煮沸、酸泡的器皿内要充满液体，不得有气泡。
（三）煮沸前的水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗涤剂（直径35厘米的铝锅，用洗衣粉10克左右）；若洗涤剂和实验器材同时从冷水煮至沸腾或使用过量洗剂均易腐蚀玻璃表面，使玻璃碱化PH值上升。
（四）软毛刷的刷端已掉毛的应该弃去，否则会损害玻璃。
玻璃划痕处易残留洗涤剂,会改变培养液PH和毒害细胞。
（五）浸泡器材的蒸馏水容器要专用，并做好标记，如“蒸馏水1盆”、”蒸馏水2盆。
（六）器材清洗干燥后，在以后各步操作时，手指不可接触器材的使用端。
清洗者可戴一次性薄膜手套进行操作，这样省时又保证清洗质量。
（七）清洁物品应及时包装消毒，应注意妥善保存，防止落人灰尘、蟑螂、蚂蚁等引起二次污染。
（八）刷洗、酸泡后的器材要用流水振荡冲洗；不得残留洗涤剂、清洁液。
操作方法（一）清洗液（俗称酸液）的配制方法常用清洁液配方重铬酸钾100g，浓硫酸200ml，蒸馏水800ml。
以配置10000ml常用清洁液为例介绍如下：先在搪瓷盆或塑料盆中加入蒸馏水8000ml，称取1000g重铬酸钾，用玻璃棒搅拌直至溶解（可加热以辅助溶解），待重铬酸钾液冷却后，缓慢加入浓硫酸，边加边用玻璃棒搅动，以混合液温度不过快上升和不出现重铬酸钾结晶为度。
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动物细胞培养技术实验报告生物技术1004班第四组实验一仪器的清洗与灭菌及培养基的配制一、实验目的能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。
二、实验原理清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。
体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。
细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。
清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。
如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。
灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。
假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。
以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。
常用的消毒灭菌方法有：(1)紫外线消毒用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。
这是常使用的消毒方法之一。
(2)湿热灭菌此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。
主要应用范围是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。
(3)滤过除菌用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。
采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。
滤器型号按直径大小划分。
以0．22 μm除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。
(4)化学消毒法70％(或75％)酒精：超净台里常备70％酒精棉球(卫生级酒精)，用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。
三、实验材料、用品1．材料： PH试纸、三蒸水、量筒烧杯（1000ml 2个250ml 4个100ml2个10ml 3个）、玻璃棒（3个）、250ml盐水瓶（8个）10ml盐水瓶(10个) 250ml玻璃螺口培养瓶（27支）1.5ml离心管一瓶微量可调移液器3个（1000ul配套枪头2盒）注射滤器（0.22微米微孔滤膜）（4只）带旋盖离心管10ml （3个）、离心管架一个1把小镊子，3把剪刀，3把弯镊3个100目钢丝筛网牛皮纸橡胶皮筋标签纸记号笔若干2．药品：75％酒精，DMEM培养基试剂干粉一包、胰蛋白酶250mg，青霉素、链霉素（双抗液0.3g) KH2PO4，NaCl，NaHCO3，KCl ，葡萄糖Na2HPO4.H2O3．仪器：超净台，高压蒸气灭菌锅，磁力搅拌器、电子天平。
四、实验步骤(一)仪器的清洗与灭菌玻璃器皿（16支250ml玻璃螺口培养瓶、3个培养皿、10ml小烧杯3个）1．玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡30分钟2．用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次，倒置自然干燥。
3．包装(牛皮纸或一般纸)，要标明班级及小组，防止混用丢失。
4．高压蒸汽灭菌。
5．贮存备用。
金属器械（1把小镊子，3把剪刀，3把弯镊3个100目钢丝筛网）1．先用清水清洗之后再用洗洁精清洗。
2．用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次，倒置自然干燥。
3．包装(牛皮纸或一般纸)，要标明班级及小组，防止混用丢失。
4．高压蒸汽灭菌。
5．贮存备用。
塑料制品（1.5ml离心管一瓶1000ul配套枪头2盒）1．用洗涤剂清洗塑料制品，自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次，倒置自然干燥。
2．包装(牛皮纸或一般纸)，要标明班级及小组，防止混用丢失。
3．高压蒸汽灭菌。
（二）试剂及培养基的配制1. 水：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。
需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.2. Hanks液的配制（《动物细胞培养技术》28页：（1）甲液KCl 0.04g 1甲液搅拌溶解，乙液单独溶解。
Na2HPO4.H2O 0.06g 2将乙液徐徐加入甲液中。
KH2PO40.06g 3将0.35g NaHCO3 单独溶解到37℃100ml三蒸水中MgSO4`H2O 0.20g 4用数滴NaHCO3液溶解0.02g酚红葡萄糖 1.00g 5将(3) (4)液移入甲乙混合液中NaCl 8.00g 6用三蒸水定容至1000ml，充分混匀调pH到7.4，膜三蒸水100ml 封口4℃冰箱过夜。
（2）乙液7次日滤过，分装4℃冷藏。
CaCl2 0.14g三蒸水100ml3. 胰蛋白酶溶液：称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂0.25g溶入小烧杯中的100ml双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。
搅拌混匀，置于4℃内过夜。
用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。
使用前用无菌NaHCO3调pH到7.2.然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。
4．DMEM培养基（加入青、链霉素双抗）：将青、链霉素双抗各0.3克和DMEM试剂粉一袋倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的DMEM溶液。
无菌NaHCO3调PH到7.0—7.2。
用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。
然后分装成小瓶于-4℃保存以备使用。
4.pH调整液0.74g NaHCO3 单独溶解到37℃100ml三蒸水中，过滤膜除菌，分装4℃保存以备使用。
五、注意事项1．清洗玻璃制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。
千万不要用硬毛刷，否则损害塑料表面后细胞不易贴壁。
2．高压灭菌后器皿务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。
3．牛血清、大部分培养基、胰酶、Hanks溶液和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压灭菌和紫外灭菌，可用过滤灭菌。
5．滤过除菌时，过滤时压力不宜过大。
压力太大时微孔滤膜可能破裂。
6．超净工作台紫外灯开启时严禁进行其他操作，以防紫外对皮肤的伤害。
实验二小鼠肾脏、脾脏细胞原代培养一、实验目的能独立地进行细胞的原代培养，掌握细胞培养技术。
二、实验原理细胞培养是生物学和医学研究最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。
原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。
由于细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。
这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。
Hanks液主要用于组织或细胞的漂洗。
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。
不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。
胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。
使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。
因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks 液。
终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
三、实验材料、用品（每组）1、材料：9支250ml玻璃螺口培养瓶、3个培养皿、10ml小烧杯3个，1.5ml离心管24个1000ul 配套枪头一盒带旋盖离心管10ml 3个，废液缸，8周小鼠，75％酒精棉球微量可调移液器1000ul3个1把小镊子，3把剪刀，3把弯镊3个100目钢丝筛网酒精灯3个2、药品：DMEM培养基（含小牛血清和青霉素和链霉素双抗液)，胰蛋白酶，Hanks液，75％酒精。
3、仪器：CO2培养箱，超净台，恒温水浴锅，离心机。
其他：火柴记号笔四、实验步骤（一）细胞培养胰蛋白酶消化法（以脾细胞胰蛋白酶处理为例）1、将小白鼠引颈处死后于含有75%酒精的大烧杯中浸洗3~5S。
2、用剪刀剪开小鼠腹部,迅速取出肝脏并用Hanks 液中进行漂洗3次，之后放入培养皿去除脂肪剪下肝组织小块。
将小块用镊子移到小烧杯中用眼科剪子将鼠脾组织剪成的小块加入Hanks 液漂洗除去血细胞后移入1.5ml的离心管中剪成1mm左右的小快。
3、加入800ul胰蛋白酶消化液后，封口。
置于于37 ℃恒温水箱中消化15~20min。
4、不断检查肝组织是否消化完全，可适当晃动帮助打散细胞直到组织变白疏松为止。
5、用移液枪吹打混匀，制成细胞悬液6、用差速离心法400转/分钟离心2分钟去除大块未消化组织。
7、吸取上清700转/分钟离心7分钟8、离心完后, 弃上清，再加入1ml DMEM完全培养基重悬单细胞，收集肝细胞于培养瓶中，加大约15 ml DMEM培养基，倾斜30°瓶内液体高度约为3mm，做好标记于37℃、5%CO2条件下培养一周。
（二）细胞培养(以脾脏细胞机械挤压过塞法处理为例)1、将小白鼠引颈处死后于含有75%酒精的大烧杯中浸洗3~5S。
2、用剪刀剪开小鼠腹部,迅速取出肝脏并将其放入装有Hanks 液中进行漂洗3次。
3、用镊子夹取肝脏在套有200目不锈钢网的小烧杯上研磨，并不断用移液枪吸取适量Hanks 缓冲液冲洗，过滤到小烧杯中，之后将过滤后的悬液装到一个1.5ml离心管中。
6、用移液枪补到相同体积，做好标记以700转/ 分离心7min, 弃上清。
7、再加入1ml的DMEM完全培养基重悬沉淀细胞，收集肝细胞于培养瓶中，加大约15 ml DMEM培养基，使瓶内液体高度为3mm，做好标记于37℃、5%CO2条件下培养一周五注意事项1 用胰蛋白酶消化细胞时不能消化过度，否则会导致细胞死亡，活力下降2使用机械研磨法时动作要轻柔，过度用力会使非细胞物质过网3整个过程严格控制无菌操作，加试剂后试剂瓶过火焰再盖上实验三细胞观察及活力测定一、实验目的1.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；2.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；二、实验原理A细胞活力检测倒置显微镜是组织培养实验中最重要的工具之一，将培养物放在显微镜的载物台上，打开电源，选择合适的镜头，聚焦于标本上，可以观察体外培养的细胞。
体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长和悬浮型生长两大类。
贴附型细胞在培养时能贴附在支技物表面生长。
如羊水细胞为贴附型细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞生长。
悬浮型细胞在培养中悬浮生长。
培养细胞随贴附支持物形状不同而形态各异，最常见的是贴附于平面支持物细胞。
在一般光镜下生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。
细胞在生长期常有1-2个核仁在细胞机能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。
若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔泡等，表明细胞代谢不良。
活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。
基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。