《细胞工程》第4章(2)：动物细胞培养工程52

●生物反应器设计和操作参数对传质系数有影响：
传质系数（KL）——受氧在培养液中的扩散速度影响， 气泡大小可改变传质系数与扩散系数相互关系， 鼓泡式 小气泡（<2.5mm）传质系数与扩散系数的 反应器 2/3次方成正比， 大气泡（>2.5mm）传质系数与扩散系数的 1/2次方成正比。 传质比表面积（A）——与通气量成正比，而与气泡直径 的三次方成反比，如增加气量、 减少气泡直径，会提高细胞死亡率 实际要优化细胞破损与供氧混合过程，在最大限度满足细胞对 传质要求的前提下，减少细胞破损。
生 物 反 应 器
生 物 反 应 器 的 操 作
生 物 反 应 器 的 监 控 系 统
生 物 反 应 器 连 接 和 排 流 管 道
低 温 调 整 离 心 机
系 统 控 制 面 板
国产生物反应器及操作
C、无血清流加培养工艺
【习题】
1、概述肝癌单抗片段Hab18F(ab’)2无血 清流加培养工艺技术流程？
●悬浮培养 的驯化 贴壁生长转化为悬浮生长的驯化
B、贴壁培养 （anchorage-dependent culture）
——是指让细胞贴附在某种基质上进行增殖的培养 方法。主要适用于贴壁细胞或兼性贴壁细胞，如 CHO、BHK、Vero等，用灌流培养模式可维持较 长的培养周期，关键是提高细胞密度，进行放大培 养；适于贴壁依赖性和非依赖性细胞。 ● 优点：易于灌注和优化控制，细胞生长密度高， 产率高，产物易收取和纯化，培养液利用率高；
● 防止细胞机械破裂的培养液成分——
4．4 动物细胞培养工艺
●动物细胞培养工艺是指动物细胞表达生物技术产品的 生产工艺； ● 动物细胞表达产品的种类繁多，生物合成各具特点， 其培养工艺过程也不同； ●动物细胞培养工艺的设计要根据细胞本身的生长特点、 生长形式、目标产品的表达量、稳定性等进行综合考虑， 以选择相应的生物反应器系统，确定培养条件、培养环 境和各种参数控制指标等； 目前，成熟的蛋白治疗药物生产工艺有：流加培养工 艺、灌注培养工艺、批式培养工艺和反复批式培养工艺。
4．4．1 动物细胞培养工艺基础
实验室规模（laboratory scale） A 、工艺实验研修阶段 中试规模（pilot scale） 生产规模（production scale） 实验室设施 B、实验室管理 ——选址、装修、净化、布局 无菌室管理（国家相关法规） D、无菌操作技术 培养前准备、培养室和超净台的消毒、洗手与着装 无菌培养操作、生物反应器的安装与消毒
●用重组技术或细胞融合技术建立的工程 细胞系，在进行无血清悬浮培养或高密度 培养时，都需经过一定时间的细胞适应能 力驯化； ●细胞对无血清培养条件的适应能力和生 长形式的驯化，对于建立优化的无血清高 密度培养工艺非常重要；
●通过驯化期可以逐渐修复那些不适应的细胞群 体，在驯化过程中监控并筛选那些具有优化性能 特性（如细胞生长率、产出率、细胞死亡率、基 因稳定性等）的细胞克隆或细胞群；
B、主要设备
1L悬浮搅拌培养瓶Superspinner（德，BraunBiotech） ——杂交瘤细胞悬浮培养种子细胞 （磁力搅拌无气泡供气，10um细胞连续 旋转过滤器，其它全控） 5L细胞发酵罐（德国，BraunBiotech） ——杂交瘤细胞连续悬浮培养 30L细胞发酵罐BiostatRC20（德国，BraunBiotech） （冷热循环蒸汽控温，四气混合控制供气） ——杂交瘤细胞连续悬浮培养的放大
4．3．3 动物细胞培养的操作方式
4．4．4 培养过程的监测与控制
4．4．5 动物细胞培养工艺
4．4．6 工艺的选择与设计
（反应器投入占整个部分50%）
B
、 生 产 工 艺 的 设 计 原 则
4．4．7 杂交瘤细胞大规模培养制备 抗体的工艺
A、工艺流程图
——肝癌单抗片段Hab18F（ab/）2体外制备工艺
B、具体关系：
● 动物细胞对培养环境传质和混合的要求 对于大规模动物细胞培养过程，其生物反应器提供的细胞培养环 境必须满足细胞生长、代谢和产物生成对传质和混合的要求，主要 因素是细胞生长对氧的要求； 反应器的传质能力必须满足：KLA（C*O2-CO2· ）≥qO2· C，其中， min KL——液体一侧氧传质系数，A——气液比表面积， qO2——单位细胞耗速率，C——细胞密度， C*O2——液体中氧的饱和浓度，CO2· ——液体中最低氧浓度。 min 一般而言， 提高反应器的能量输入，如增加搅拌转速和通气量 减少气泡直径等，有利于提高传质速率，但增加细 矛盾 胞操作速率
4．4．2 动物细胞培养方法
原代细胞 ●依细胞来源，可分 传代细胞培养 液体培养 ●依培养液种类不同，可分 固定培养 静止培养、旋转培养、搅拌培养 ●依反应器类型和操 中空纤维培养 作方式不同，可分 固定床或流化床培养 悬浮培养 ●依在反应器生长 贴壁培养 形式不同，可分 贴壁-悬浮培养（假悬浮培养）
Cell Engineering
细 胞 工 程
Chapter 4、动物细胞培养工程
4．1 概述 4．2 生产用动物细胞系 4．3 培养液和培养环境 4．4 动物细胞培养工艺 4．5 动物细胞培养过程的放大与优化 4．6 动物细胞代谢工程 4．7 动物细胞工程产品制备及质控 4．8 动物细胞工程表达产品的应用
通气搅拌 生物反应器
传质系数（KL）——氧传质系数仍与扩散 系数的2/3次方成正比，但流体主体 的湍（tuan）流强度对传质系数也有贡献
气液传质比表面积（A）——气泡直径和传 质比表面积主要与搅拌功率和通气 量有关
强化传质和抑制细胞损伤，达到合适度（优化）
● 决定动物细胞剪切敏感性的因素： 不同细胞剪切敏感性不一，人细胞最敏感，细胞表面形 态与功能特性（细胞膜流动性）直接决定细胞剪切 敏感性，流动性越强，剪切越敏感，如杂交瘤细胞； 细胞骨架结构影响细胞耐剪切能力； 细胞所处生长期（生理状态）对细胞耐受剪切力有影响。 ● 微载体细胞培养系统中的细胞损伤——微载体湍流涡旋 相互作用是主要因素； ● 悬浮细胞在生物反应器中的细胞损伤——鼓泡式、气升 式相对温和，决定于气泡聚并与破裂速率；
A、悬浮培养 （suspension culture）：
——是指细胞自由地悬浮于培养液内生长 增殖的一种培养方法；适用于悬浮培养的 生产细胞有杂交瘤与骨髓瘤细胞（SP2/0， NSO），不适用于正常细胞培养。此种方 法操作简便，传质和传质比较好，易放大， 条件均一；但需产物截流。1996-2000年， 美国，FDA批准70%重组治疗药物。
4．3．5 培养环境与生物反应器
A、原因 ● 动物细胞生长、代谢和产物生成受培养环 境的控制，而生物反应器提供的培养环境 能否满足需要，直接与反应器的型式、操 作状态有关； ● 为了给细胞生长提供足够的溶氧水平和均 一的培养环境，必须使反应器的保持一定 的混合水平和通气条件；
● 动物细胞较大、无壁，它对流体作 用力敏感（剪切敏感性），易损，所 以，反应器的设计、放大和操作过程 必须解决供氧混合与细胞损伤间的矛 盾； ● 必须了解生物反应器的传质与混合 特性、培养环境液体力学现象对动物 细胞生长、代谢及细胞操作的影响；