(完整版)细胞实验技术
生物细胞实验操作步骤详细说明
一、实验目的通过本实验，掌握生物细胞实验的基本操作步骤，了解细胞的基本结构和功能，为后续的生物学实验打下基础。
二、实验原理生物细胞是生命活动的基本单位，具有复杂的结构和功能。
通过观察细胞的结构和功能，可以了解生命现象的本质。
本实验主要观察细胞的基本结构，如细胞膜、细胞质、细胞核等。
三、实验材料1. 实验器材：显微镜、载玻片、盖玻片、滴管、镊子、酒精灯、吸水纸、显微镜镜头、显微镜台、显微镜光源等。
2. 实验试剂：生理盐水、碘液、苏丹Ⅲ染液、醋酸洋红染液、解离固定液等。
3. 实验材料：洋葱鳞片叶、口腔上皮细胞、小鼠睾丸组织等。
四、实验步骤1. 观察洋葱鳞片叶细胞（1）取洋葱鳞片叶，用镊子撕取一小块透明薄膜内表皮。
（2）将撕取的内表皮浸入载玻片上的生理盐水滴中，用镊子展平。
（3）在盖玻片的一侧滴加稀碘液，另一侧用吸水纸吸引，使染液浸润标本的全部。
（4）将盖玻片轻轻盖在标本上，用镊子夹住盖玻片的一侧，用另一侧的镊子夹住载玻片的一侧，轻轻压紧。
（5）用显微镜观察细胞结构，如细胞膜、细胞质、细胞核等。
2. 观察口腔上皮细胞（1）用干净的纱布把载玻片和盖玻片擦拭干净。
（2）在载玻片的中央滴一滴生理盐水。
（3）用凉开水漱口，用消毒牙签从口腔侧壁处轻轻刮几下，牙签上就附着了一些碎屑。
（4）把牙签放在载玻片的生理盐水滴中均匀地涂抹几下。
（5）在盖玻片的一侧滴加稀碘液，另一侧用吸水纸吸引，使染液浸润到标本的全部。
（6）将盖玻片轻轻盖在标本上，用镊子夹住盖玻片的一侧，用另一侧的镊子夹住载玻片的一侧，轻轻压紧。
（7）用显微镜观察细胞结构，如细胞膜、细胞质、细胞核等。
3. 观察小鼠睾丸组织细胞（1）取小鼠睾丸组织，放在解离固定液中，一定时间后漂洗。
（2）将漂洗后的组织放在载玻片上，滴加适量醋酸洋红染液。
（3）一定时间后加盖玻片，并轻压盖玻片，使细胞分散开。
（4）用显微镜观察细胞结构，如细胞膜、细胞质、细胞核等。
五、实验注意事项1. 操作过程中要保持无菌，避免污染。
细胞实验方法-2
细胞解冻工具材料：酒精喷壶，离心管，15ml离心管，移液管，移液器，封口膜，移液枪（枪头），培养基，6cm 培养皿准备工作：1.工作台用酒精棉擦拭一遍2.取一支15ml离心管，加入4ml培养基3.取一个6cm培养皿4.取出一管新鲜培养基操作过程：1.将冻存管从液氮罐中迅速取出2.迅速将冻存管放入37℃水浴中解冻，解冻时摇晃冻存管，加快解冻3.解冻后，迅速将冻存管的细胞用移液枪加入到装有4ml培养基的离心管中，吹打20次4.将离心管中的液体离心（1200r/min，3min）5.离心后，抽取上清液，然后加入新鲜培养基4ml，吹打20次。
6.将6cm培养皿中加入6ml新鲜培养基，然后将离心管中的细胞悬液加入到培养皿中。
7.前后左右摇晃培养皿，使细胞均匀分布（用显微镜观察确认）。
8.将培养皿放入细胞培养箱中培养。
9.待长满后？更新培养基工具材料酒精喷壶，移液管，移液器，封口膜，培养基，PBS准备工作：1.工作台用酒精棉擦拭一遍2.将玻璃管插入抽气泵的胶皮管中3.取一支15ml离心管4.将PBS在37℃预热5.取一个长满细胞的10cm培养皿操作过程1.将带有细胞的培养皿从培养箱中取出，用显微镜观察细胞状况2.用玻璃管吸取培养皿中的培养基3.加入8ml预热好的PBS，圆周状摇晃，静置1min，用玻璃管抽出PBS4.再重复步骤3两次5.加入新鲜的培养基10ml6.将培养皿放入细胞培养箱中培养细胞传代工具材料：酒精喷壶，15ml离心管，移液管，移液器，封口膜，移液枪1000μL（枪头），PBS，培养基，EDTA(Trypsin)，10cm培养皿准备工作：1.工作台用酒精棉擦拭一遍2.将玻璃管插入抽气泵的胶皮管中3.取一支15ml离心管4.将PBS在37℃预热，将EDTA在37℃预热5.取一个10cm培养皿操作过程1.将带有细胞的培养皿从培养箱中取出，用显微镜观察细胞状况2.用玻璃管吸取培养皿中的培养基3.加入预热好的PBS,8ml，圆周状摇晃，静置1min，用玻璃管抽出PBS4.再重复步骤3两次5.用移液枪加入预热好的EDTA 2ml（必须趁热加入），在室温静置2min6.观察细胞脱附情况7.迅速加入6ml新鲜培养基8.用移液管吹打培养皿中的液体，将未脱附细胞冲刷下来9.用移液管将培养皿中的细胞悬液，转移到15ml离心管中10.1200r/min，25℃离心3min。
（完整版）细胞实验技术
（完整版）细胞实验技术（一）干扰引物（shRNA）设计：1、NCBI上下载基因序列2、在sigema网站输入基因号设计一对21个碱基的干扰引物（上下游）3、从起始密码（ATG）下游25bp开始；4、GC含量介于40%~60%5、干扰引物至少一个在SDS区，一个在3’UTR区6、选择脱靶率低的（二）、干扰载体构建1、引物退火（引物加水看标签X 50,弹匀，瞬离）退火体系：上游：5ul下游：5ul10X M buffer 5ulH2O 35ul水浴锅100℃2min，锅里隔夜（三）、酶切plko.1载体1、AgeI 酶切，反应体系：plko.1载体4ugAgeI 2ul10X AgeI buffer 5ulH2O 39ul37℃水浴2~3h2、切胶回收AgeI 酶切产物，30ul 水洗脱3、EcoRI酶切，反应体系：AgeI 酶切产物30ulEcoRI 2ul10X H buffer 5ulH2O 13ul37℃水浴2~3h切胶回收，30ul 水洗脱，测浓度（四）、连接连接体系：T4连接：退火引物2ul 退火引物5ul酶切载体1ul 酶切载体1ulSolution I 5ul T4连接酶1ulH2O 2ul T4连接酶Buffer 1ulH2O 2ul室温下连接4h。
（五）、转化-80℃取感受态细胞于冰上融化，在1.5ml离心管加33ul感受态，将连接产物加入，冰上放置30min，42℃水浴60~90s，冰上放置2min，加入无氨苄培养基，37℃摇床1h，涂布在氨苄平板上，37℃，16h。
（六）、挑菌用枪头挑取5个菌落（可送测序）扩大培养，加有氨苄的培养基，37℃过夜培养。
（七）、提质粒碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA 的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
细胞生物学实验技术
细胞生物学实验技术细胞生物学实验技术是现代生命科学研究中的关键环节，它为研究人员提供了深入了解细胞结构、功能和相互作用的途径。
本文将重点介绍一些常见的细胞生物学实验技术，包括细胞培养、染色技术、分离技术和显微镜观察等。
一、细胞培养技术细胞培养是一项基础性技术，它可以将细胞从体内取出并在适当的培养基中进行增殖和维持。
细胞培养的首要任务是提供适当的培养基，其中含有必需的营养物质、生长因子和适当的温度、湿度和气体条件。
细胞培养技术广泛应用于细胞生物学实验、组织工程、药物研发等领域。
二、染色技术染色技术是细胞生物学实验中常用的方法之一，它使研究者能够对细胞内各种结构和分子进行可视化观察。
常用的染色方法包括荧光染色、酶标染色和核酸染色等。
荧光染色利用荧光标记的抗体或染料，可使特定的细胞结构或分子在显微镜下发出荧光信号，从而观察其位置和表达水平。
酶标染色则通过酶与底物的反应，使细胞或组织显示出颜色等信号。
核酸染色则利用特定染料与细胞核酸结合，以观察DNA或RNA的分布情况。
三、分离技术分离技术在细胞生物学实验中具有重要作用，它可以将不同类型的细胞或细胞组分进行分离和纯化。
常用的分离技术包括细胞离心、流式细胞术和免疫磁珠分离等。
细胞离心是通过离心机将混合细胞悬液分离成上清液和沉淀，从而获得纯化的特定类型细胞。
流式细胞术则通过流式细胞仪测量细胞的大小、形态和表面标记物，从而实现对细胞的高通量分离和分析。
免疫磁珠分离则利用特定抗体结合在磁珠表面，以实现对需要纯化的细胞或细胞组分的选择性捕获。
四、显微镜观察显微镜观察是细胞生物学实验的重要手段，它使研究者能够观察到细胞内不同的结构和过程。
传统光学显微镜可实现对细胞形态和部分细胞器的观察，但其分辨率有限。
近年来，随着超分辨显微镜技术的发展，研究者们能够突破传统光学显微镜的分辨率极限，实现对亚细胞结构和分子过程的观察。
总结细胞生物学实验技术在现代生命科学研究中发挥着至关重要的作用。
细胞生物学实验步骤
冻存细胞的复苏1、于液氮罐中取出冻存管。
2、37℃水浴锅中摇动，使之快速融化。
3、超净台内酒精棉球擦拭，打开冻存管，吸出细胞悬液，注入离心管中，再滴加2倍培养液，混匀。
4、离心：1500转/分，3分钟，弃上清。
5、吸取2-3ml培养液加入到离心管中，吹打制悬，接种到培养瓶中，37℃培养。
组织块法培养骨骼肌细胞1、将新生大鼠处死，再用酒精棉球擦拭其全身消毒，带入超净台内于肩关节和髋关节处剪取四肢（去爪），置培养皿中。
2、PBS液中，清理血污，剥去皮肤。
3、用PBS液洗涤两次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
4、用将肌组织从骨骼上剪切下来，PBS液清洗后转移至干净培养皿中。
5、加少量培养液，将组织剪成1mm3小块，用吸管将其转移到培养瓶，贴附与瓶底面。
翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。
入37℃培养箱静置0.5-1小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。
贴壁细胞的传代和冻存1、超净台中打开细胞培养瓶，用吸管将培养液吸出。
2、加入PBS液，使其覆盖培养瓶底部，轻轻摇动后倒掉。
3、加入消化液，以覆盖整个培养瓶底部，盖好瓶盖，于倒置显微镜下观察，待见到细胞质回缩、细胞间隙增大后于超净台内倒掉消化液。
4、加培养液终止消化。
5、用吸管吸取培养瓶中的培养液，反复吹打瓶壁，制备细胞悬液。
6、将细胞悬液吸入离心管中，离心1500转/分，3分钟，倒掉上清。
7、加入3ml培养液于离心管中，吹打制悬。
8、取2ml细胞悬液进行接种后，剩余细胞悬液继续离心1500转/分，3分钟。
9、去上清，加入1ml冻存液，制悬，转移到冻存管，再按照-4℃1小时→-20℃2小时→-80℃2小时→液氮的顺序进行冻存。
细胞计数血球计数板每一大方格长为1mm，宽为1mm，高为0.1mm，体积为0.1mm3，可容纳的溶液是0.1μl，那么每ml溶液中所含细胞数即是视野中每一大方格中数出的细胞数的10000倍。
细胞生物学基本实验技术(139页)
细胞间连接 细胞外基质
单一细胞
2.分离不同类型细胞 (1) 离心 （centrifugation）
大小 密度 形状
小
轻
不规则
大
重
圆形
(2) 免疫磁珠法
利用带有特定单抗的免疫磁珠 与靶细胞的特异结合，快速地 从多细胞悬液中将目的细胞分 离出来。
Fe2O3或Fe3O4颗粒 +
单克隆抗体
免疫磁珠
(3) 流式细胞仪 ( flow cytometry)
果蝇胚胎原肠胚
（二）电子显微镜技术
利用电子与固体样品作用时所发出的信息, 对样品进行微区观察和分析的技术
亚显微结构 超微结构 1.电子显微镜的特点
高分辨率
理论上 d = 0.002 nm 实际上 d = 0.1 nm 生物标本 d = 2 nm
高放大倍率 1,000,000
2.透射电子显微镜（Transmission electron microscope, TEM） (1)基本构造
➢ 分辨率高 ➢ 可在非真空状态下工作 ➢ 直接观察大分子的三维结构
扫描隧道显微镜下的人红细胞血影
2.原子力显微镜 通过分析探针针尖与样品之间的原子间作用
力来获取所观察表面的微观信息。 ➢ 样品无需具有导电性 ➢ 可在三态下工作 ➢ 活细胞表面及生物大分子空间伸展及其结 晶体表面观测
原子力显微镜下的中国仓鼠卵巢细胞 原子力显微镜观察细胞微丝的动态变化
透射电镜 利用穿透标本的电子进行成像 (散射) 观察组织的二维切片 扫描电镜 利用标本表面发射的二次电子成像 观察组织的表面三维结构
（三）扫描探针显微镜
（Scanning probe microscope, SPM）
细胞生物学实验方法与技术
细胞生物学实验方法与技术1. 光镜观察（Light Microscopy）光镜观察是一种常用的研究细胞形态和结构的方法。
通过使用光学显微镜，可以观察到细胞的外形、细胞器的位置和结构等特征。
该技术使用涂片制备技术，将细胞固定、染色、封装在玻璃片上，然后在显微镜下进行观察。
2. 电镜（Electron Microscopy）电镜是一种高分辨率的显微镜技术，它可以观察到细胞的微观结构和细胞器。
电镜利用电子束来代替光束，通过变焦电镜透射电子显微镜和扫描电子显微镜两种类型，可以观察到更高分辨率的细胞结构。
3. 组织培养（Tissue Culture）组织培养是一种将细胞或组织从活体中分离并培养在人造环境中的方法。
这种方法常用于研究细胞生长、增殖和发育过程。
组织培养可以通过使用培养基、细胞培养皿和细胞培养箱等设备来提供细胞所需的营养和环境。
4. 免疫染色（Immunostaining）免疫染色是一种用来检测和定位蛋白质或其他分子在细胞中的位置的方法。
这种方法利用抗体的特异性结合来检测蛋白质的位置。
首先，细胞固定并渗透，然后使用特定的抗体与目标分子结合，最后通过荧光标记或酶反应等方法来观察染色的细胞。
5. 荧光显微镜（Fluorescence Microscopy）荧光显微镜是利用荧光探针来观察样品的显微镜技术。
该技术可以用来检测和可视化特定分子或结构的位置和数量。
通过对样品进行荧光染色或利用荧光蛋白表达来标记细胞的特定结构或分子，可以在荧光显微镜下直接观察到。
6. 流式细胞术（Flow Cytometry）流式细胞术是一种高通量细胞分析技术，可以快速准确地分析和计数大量的单个细胞。
该技术利用细胞标记剂和流动性流式细胞术仪器，通过激光照射细胞并检测细胞的荧光光谱，可以分析细胞表面分子的表达、细胞大小和复杂性等信息。
细胞生物学实验方法与技术
细胞生物学实验方法与技术1.细胞培养：细胞培养是细胞生物学研究中最基本的实验技术之一、它通过将细胞放入培养基中，在特定的环境条件下进行体外培养。
通过细胞培养，可以获得大量的细胞进行进一步的实验研究。
2.免疫荧光染色：免疫荧光染色是一种常用的细胞实验方法，通过此方法可以检测特定蛋白质或分子在细胞中的分布和定位。
该技术利用特异性的抗体与目标分子结合，并用荧光染料标记抗体，从而利用荧光显微镜观察染色结果。
3. 免疫印迹法（Western Blot）：免疫印迹法是一种用于检测特定蛋白质的定量和分析的方法。
该方法通过将细胞或组织中的蛋白质经过电泳分离，并转移到膜上，然后用特异性的抗体与目标蛋白质结合，最后通过酵素反应或荧光信号检测目标蛋白质的存在和表达水平。
4.转染技术：转染技术是将外源的DNA或RNA导入到目标细胞中的一种常用方法。
常见的转染技术包括植入病毒载体、使用质粒转染剂、电穿孔和化学转染等。
通过转染技术，可以实现基因过表达、基因沉默等实验研究。
5.索引技术：索引技术是一种分析和比较细胞中基因表达的实验方法。
通过索引技术，可以快速筛选出在不同生理状态下表达差异显著的基因，并进一步研究这些基因的功能和调控机制。
常见的索引技术包括差异显著性分析、基因芯片、RNA测序等。
6.荧光显微镜技术：荧光显微镜技术是一种使用荧光染料观察细胞结构和功能的方法。
荧光显微镜可以通过选择不同的染料和光源，实现对细胞核、细胞器等结构的观察。
此外，还可以利用特定的荧光探针，实现对细胞内的信号分子、离子和代谢产物的监测。
7.流式细胞术：流式细胞术是一种通过检测细胞的光学和物理特性，实现对单个细胞的定量分析和分选的方法。
该技术可以实现细胞表面标记物的检测、细胞周期分析、细胞凋亡检测等。
特别是流式细胞术结合细胞分类仪，可以实现高通量的细胞分析。
综上所述，细胞生物学实验方法与技术为研究细胞的结构、功能和特性提供了重要的工具。
随着科技的不断发展，细胞生物学实验方法与技术也在不断更新与创新，为我们更好地理解细胞的生命活动提供了强大的支持。
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（一）干扰引物（shRNA）设计：1、NCBI上下载基因序列2、在sigema网站输入基因号设计一对21个碱基的干扰引物（上下游）3、从起始密码（ATG）下游25bp开始；4、GC含量介于40%~60%5、干扰引物至少一个在SDS区，一个在3’UTR区6、选择脱靶率低的（二）、干扰载体构建1、引物退火（引物加水看标签X 50,弹匀，瞬离）退火体系：上游：5ul下游：5ul10X M buffer 5ulH2O 35ul水浴锅100℃2min，锅里隔夜（三）、酶切plko.1载体1、AgeI 酶切，反应体系：plko.1载体4ugAgeI 2ul10X AgeI buffer 5ulH2O 39ul37℃水浴2~3h2、切胶回收AgeI 酶切产物，30ul 水洗脱3、EcoRI酶切，反应体系：AgeI 酶切产物30ulEcoRI 2ul10X H buffer 5ulH2O 13ul37℃水浴2~3h切胶回收，30ul 水洗脱，测浓度（四）、连接连接体系：T4连接：退火引物2ul 退火引物5ul酶切载体1ul 酶切载体1ulSolution I 5ul T4连接酶1ulH2O 2ul T4连接酶Buffer 1ulH2O 2ul室温下连接4h。
（五）、转化-80℃取感受态细胞于冰上融化，在1.5ml离心管加33ul感受态，将连接产物加入，冰上放置30min，42℃水浴60~90s，冰上放置2min，加入无氨苄培养基，37℃摇床1h，涂布在氨苄平板上，37℃，16h。
（六）、挑菌用枪头挑取5个菌落（可送测序）扩大培养，加有氨苄的培养基，37℃过夜培养。
（七）、提质粒碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA 的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。
碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。
1、取5ml菌液于离心管，12000 rpm 1min ，弃上清2、向沉淀加500 ul P1 ，震荡重悬3、加入500 ul P2 ，温和翻转6~8 次，充分裂解（不超过5 min，一般3min）4、加入700 ul P3 ，温和翻转6~8 次，出现白色絮状沉淀，12000 rpm 10 min5、将上清加入CS柱（已放入收集管），12000 rpm 2min，将收集管中液体加入吸附柱CP4中，12000 rpm ，1min ，弃废液6、CP4柱中加入500 ul PD ,12000rpm ，1 min ，弃液7、CP4柱中加入600 ul Pw,室温放置3 min ,12000rpm ，1 min ，弃液8、空离12000rpm ，2 min，室温放置几分钟（把乙醇蒸发）9、CP4柱置于1.5ml 离心管，向柱中心加35 ul ddH2O ，室温放置2 min ，12000rpm ，1 min。
（八）、测质粒浓度打开软件，ddH2O 清洗仪器3~5次，点击black ，F1，结果不大于0.2每个样品吸取1ul，于仪器上，F1，结果浓度大于500，OD值1.88~1.90质粒置于-20 ℃，保存（九）、细胞复苏1、37℃预热PBS，取8ml PBS 于10 ml 离心管中2、液氮中取出冻存的细胞，37℃水浴融化3、吸取冻存细胞于PBS中，轻混匀，室温800 rpm 3min ，去上清，加入1ml 培养基重悬，4、细胞重悬液加到含8ml 培养基的培养皿中，37℃，5% CO2 ,培养（十）、细胞分盘1、吸去培养液，加入PBS 清洗2、吸去PBS ，加入1ml 胰酶，37℃培养箱消化1min3、用巴氏吸管加入2ml 培养液终止消化，用枪头冲洗培养皿，将液体转到5 ml 离心管中，750 rpm ，室温，5 min4、加入1ml培养液重悬，按1；3 分盘（十一）、转染1、PLP1 625 ng/孔PLP2 625 ng/孔2ml 离心管PLP/VSVG 625 ng/孔混匀目的质粒625 ng/孔Opti 培养基500ul/孔2、脂质体6ul/孔2ml 离心管请轻混匀，室温下孵育，5 minOpti 培养基500ul/孔将质粒和脂质体混合，轻轻混匀，室温孵育20 min3、吸去细胞培养皿中的培养液，加入3 ml PBS 清洗，加1ml 胰酶，37℃消化，加培养液终止消化；收集于5ml离心管，750 rpm，室温，5 min；弃上清，加入Opti 培养液重悬4、在六孔板中加入850ul Opti 培养液，加入包装的脂质体，混匀后加入细胞重悬液，十字摇匀，37℃，5% CO2 ,培养，6~8h 后去除培养基，加入3ml 新转染培养基，继续培养两天（十二）、收病毒培养第四天的转染细胞，用注射器吸取培养基，用0,45um 滤膜过滤到1.5ml 离心管，每管1 ml。
最后向培养皿中再加3ml转染培养基，，继需培养，第二次收病毒。
（十三）、病毒转染细胞1、取培养的目的细胞，吸去培养液，加入1ml 含4 ug/ml polybrene 的慢病毒培养基，再加入1 ml 病毒液，混匀，37℃，5% CO2，培养48h2、将感染的目的细胞加到生长培养基培养，3、用适当浓度的抗生素筛选靶细胞4、收细胞（十四）、收细胞（用于提蛋白，提RNA）1、吸去培养液，加入PBS 清洗2、吸去PBS ，加入1ml 胰酶，37℃培养箱消化1min3、用巴氏吸管加入2ml 培养液终止消化，用枪头冲洗培养皿，将液体转到5 ml 离心管中，1000 rpm ，4℃，5 min4、弃上清，加1ml PBS，重悬，转移到1.5ml 离心管1000 rpm ，4℃，5 min5、弃上清，立刻放入液氮中保存。
（十五）、冻存细胞1、准备冻存液2、吸去培养液，加入PBS 清洗3、吸去PBS ，加入1ml 胰酶，37℃培养箱消化1min4、用巴氏吸管加入2ml 培养液终止消化，用枪头冲洗培养皿，将液体转到5 ml 离心管中，1000 rpm ，4℃，5 min5、弃上清，加入1 ml 冻存液重悬，转移到冻存管。
（十六）、提蛋白1、将收集到的细胞从-140℃液氮中取出置于冰上，加入细胞裂解液（已加入PMSF）,吹打5~6次，冰上裂解30min2、13000 rpm ，4℃，10min ，弃沉淀3、配制蛋白标准液，稀释至0.5 mg / ml ，配制BCA 试剂（A液：B液= 50:1）4、标准液体积按0；1；2；4；8；12；16；20 加入96 孔板，补PBS 至20ul5、96孔板加1 ul 蛋白样品，PBS 补足20 ul ，每个重复3次6、每孔加入200ul BCA ，37℃，30 min7、酶标仪560 nm 测吸光值8、将蛋白样品稀释，加入loding buffer，4℃，瞬时离心，100℃煮10 min，13000 rpm，30 s（十七）、WB1. 清洗玻璃板2. 灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时待胶面升到绿带下线高度时即可。
然后胶上加异丙醇，液封后的胶凝的更快。
（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。
）（3）待胶凝后，倒去胶上层异丙醇并用吸水纸吸干。
（4）配4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌满浓缩胶后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。
（5）将胶板安装到电泳架上（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。
若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。
），倒入电泳buffer，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
点样，marker，10 ul （上样总体积一般不超过15 μl，加样孔的最大限度可加20 μl样品。
）（5）将其放入电泳槽中。
3. 电泳电泳时间一般100 V，90 min 。
电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
4、转膜1. 剪取一张5.5 X 8.5 的PVDF 膜。
将切好膜置于甲醇中浸泡，激活，转移到去离子水中清洗。
最后在转膜buffer 中清洗。
2. 在加有转膜buffer的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块滤纸垫、一支滚棒、带胶的玻璃板。
3. 在转膜盒上面铺一张滤纸垫，加入转膜buffer，用滚棒来回擀几遍以擀走里面的气泡，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
4. 将膜铺于滤纸上；5、将玻璃板撬开，除去大玻璃板后，将浓缩胶切去，取下分离胶盖于膜上上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。
最后盖上另一个滤纸垫，擀几下盖上盖子。
6. 将转膜槽放入转膜仪。
25 V，30min。
5、封闭1、转膜后，移至含有封闭液的平皿中，室温下，摇床上，封闭2 h。
2、封闭后，1 x TBST 清洗3次，加入一抗，4℃，过夜；3、回收一抗，1 x TBST 清洗3次，每次10 min；4、加入二抗，室温1 h5、弃二抗，1 x TBST 清洗3次，每次10 min。
6、显色曝光将膜放到曝光仪上，加入显色液，曝光（十八）、提RNA1、将收集到的细胞从-140℃液氮中取出置于冰上，加入500 裂解液（已加入PMSF）,吹打5~6次，冰上裂解30 min2、13000 rpm ，4℃，5 min ，弃沉淀3、加入适量（350ul ~450ul）的RTL lysis Buffer 至离心管，重悬4、加入等体积RNA Binding Buffer 至离心管，混匀5、把HiPure RNA Mini Column 装在2ml 收集管，转移小于700ul 混合液，12000rpm，30s6、弃滤液，继续转移7、加500 ul Buffer RW1 ,12000rpm，30 s8、弃滤液，加入650 ul Buffer RW2，12000rpm，30 s9、弃滤液，空离10、柱子转移至1.5ml 离心管，加入30~100 ul RNase Free Water 至膜中央，静止1 min，12000rpm，1 min（十九）、PCR 合成cDNA解链反应体系：总RNA 1~2 ul引物 1 ulOligo（dT） 1 ul无RNA酶水补足8 ul70 ℃水浴5 min；冰上5 min逆转录体系：5 X M-MLV buffer 5 uldNTP 2ulRNase 抑制剂 1 ulM-MLV 1 ul无RNA酶水8 ul总体积25 ul42℃，90 min ；70℃，10 min PCR，-20 ℃保存（二十）、RT-PCR利用持家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH 作为内参基因，采用荧光定量PCR 的方法检查基因的表达水品。