iCell原代肾系膜细胞培养体系
iCell原代肾系膜细胞培养体系
产品编号：PriMed-iCELL-021
产品规格：500ml/kit
产品价格：1980
产品介绍：
iCell原代肾系膜细胞培养体系是一个为体外生长的人、大鼠、小鼠、兔等哺乳动物的肾小球系膜细胞设计的理想的完全培养基方案。
本体系是一个基于碳酸氢盐的缓冲体系，可以在孵育的5%的CO2的气体环境下维持一个围绕pH7.2的酸碱缓冲体系。
本体系是一个无菌的液体混合系统，其中包含必须和非必须氨基酸、维生素、激素、生长因子、微量元素和一些其他的有机和无机化合物以及一个低浓度的胎牛血清（2%）。
本培养体系是基于固定配方配制的液态培养体系，可以为体外培养的人、大鼠、小鼠、兔等哺乳动物的肾小球系膜细胞提供一个确定适宜的平衡营养环境，并且可以选择性的促进肾小球系膜细胞的扩增。
运输和保存：
放置于含有生物冰袋的保温箱中低温运输（体系中的各组分请按上述列表中的条件进行储存）
产品使用：
1.本产品仅能用于科研
2.本产品未通过直接用于活体动物和人的审核
3.本产品未通过用于活体诊断的审核。
iCell原代软骨细胞培养体系
iCell原代软骨细胞培养体系
产品编号：PriMed-iCELL-020
产品规格：500ml/kit
产品价格：1980
产品介绍：
iCell原代软骨细胞培养体系是一个为体外生长的人、大鼠、小鼠、兔等哺乳动物的软骨细胞设计的理想的完全培养基方案。
本体系是一个基于碳酸氢盐的缓冲体系，可以在孵育的5%的CO2的气体环境下维持一个围绕pH7.2的酸碱缓冲体系。
本体系是一个无菌的液体混合系统，其中包含必须和非必须氨基酸、维生素、激素、生长因子、微量元素和一些其他的有机和无机化合物以及一个低浓度的胎牛血清（5%）。
本培养体系是基于固定配方配制的液态培养体系，可以为体外培养的人、大鼠、小鼠、兔等哺乳动物的软骨细胞提供一个确定适宜的平衡营养环境，并且可以选择性的促进软骨细胞的扩增。
运输和保存：
放置于含有生物冰袋的保温箱中低温运输（体系中的各组分请按上述列表中的条件进行储存）
产品使用：
1.本产品仅能用于科研
2.本产品未通过直接用于活体动物和人的审核
3.本产品未通过用于活体诊断的审核。
四大基本组织
复层移 行上皮
由多层细胞构成，细胞的层数及形态 可随所在器官的容积变化而发生改变
肾盏、肾盂、膀胱、输尿管等 处的内面及前列腺部
保护
二、腺上皮
分泌功能为主的上皮称腺上皮，构成的器官称腺 分类 根据有无导管：
内分泌腺（无导管，经血液淋巴液输送，甲状腺、肾上腺）
外分泌腺（有导管，汗腺、唾液腺）：
变移上皮模式图（膀胱）
被覆上皮的分类、结构特点、分布和功能
分类 单层扁 平上皮 形态结构和特点 由一层扁平细胞构成，边缘有齿状波 纹，核扁圆形，位于中央 分布 心、血管和淋巴管内表面（内 皮）；胸膜、腹膜和心包等处 （间皮） 小叶间胆管、肾小管、甲状腺 滤泡等处 功能 利于血液和淋巴流动及 物质交换；便于内脏器 官活动，减少摩擦
1、单层扁平上皮 形态：呈薄扁细长, 核椭圆形、位于细胞中央。 功能：表面光滑、可减少摩擦，有利于血液和 淋巴的流动。
内皮：分布于心,血管和淋巴管腔。 间皮：分布于胸膜,腹膜和心外膜表面。 其他：I型肺泡上皮、肾小囊壁层
小血管内皮
腹膜间皮
肾小囊壁层
2、单层立方上皮 形态：立方形，核圆形，位于细胞中央。 分布：肾小管、甲状腺。
复 层 上 皮
单 层 上 皮
脂 肪 组 织
网 状 组 织
疏 松 结 缔 组 织
第一节 上皮组织
上皮组织的特点
细胞多，排列紧密成 层状或膜状，细胞间 质少 细胞有极性，分游离 端与基底端 上皮中无血管，但有 丰富的神经末梢 分布特点：体表或管 腔、囊腔的内表面， 可向深部下陷成腺体
成分：
无机质：（65%）钙盐（骨盐），使骨坚硬 有机质：（35%）少量基质+大量骨胶原纤维 粘合作用，使骨具有韧性 结构形式：骨板。使骨的细胞间质有较强的支持作用， 并可承受多方面的压力
914726-生物-第18章 泌尿系统刘慧雯
肾皮质第18章泌尿系统Urinary system刘慧雯–肾、输尿管、膀胱和尿道等•功能–生成和排出尿液–水分及电解质平衡–分泌激素和生物活性物质重点和难点•重点–肾单位的组成及各部分的光、电镜结构和功能–集合管、球旁复合体的结构和功能•难点–肾的血循环途径及特点※一、肾脏（kidney）•结构–被膜（纤维膜）–间质–实质•皮质–肾柱–皮质迷路•髓质–肾锥体–髓放线•功能肾柱肾椎体髓放线皮质迷路髓质皮质肾脏的大体结构被膜（capsule ）：纤维膜间质（interstitium ）：少量结缔组织、血管、神经实质parenchyma ：肾皮质（renal cortex ）：皮质迷路（cortical labyrinth ）肾柱（renal column ）肾髓质（renal medulla ）：髓放线（medullary ray ）肾锥体（renal or medullary pyramids ）肾叶（lobe ）、肾小叶（lobule）实质肾单位（nephron）肾小体：血管球+ 肾小囊肾小管: 近端小管：曲部直部细段远端小管：直部曲部集合管（collecting tubule）皮质集合管髓质集合管乳头管间质：CT, BV, N……髓襻（medullary loop）肾脏的微细结构乳头管肾小囊曲部直部近端小管细段远端小管曲部直部肾小体肾小管肾单位集合管系血管球泌尿小管髓质集合管集合小管髓袢皮质集合管肾实质微细结构模式图(一)、肾单位（nephron ）肾形成尿液的结构和功能的基本单位肾小体（renal corpuscle）肾小管（renal tubule）根据肾小体在皮质中的位置髓旁肾单位（juxtamedullary nephron）浅表肾单位（superficial nephron）肾单位的比较髓旁肾单位浅表肾单位发生早发生晚靠近肾锥体位于皮质浅层肾小体体积大肾小体体积小数量少，占15%数量多，占85%髓袢长髓袢短尿液浓缩尿液形成1、肾小体（renal corpuscle ）均有两个极：血管极：出、入球微动脉出入（vascular pole）尿极：与近曲小管相连（urinary pole）包括：血管球（renal glomerulus）肾小囊（renal capsule）Development of the renal corpuscle特点：1、入球微动脉管径大于出球微动脉2、毛细血管为有孔型，无隔膜。
荧光探针法测定原代培养家兔肾脏内髓集合管细胞内pH
荧光探针法测定原代培养家兔肾脏内髓集合管细胞内pH夏前明;黄坚;赵志强;钱桂生【期刊名称】《第三军医大学学报》【年(卷),期】1999(21)9【摘要】目的：建立稳定的原代培养肾脏内髓集合管（Ｉｎｎｅｒｍｅｄｕｌｌａｒｙｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇｄｕｃｔ，ＩＭＣＤ）细胞的ｐＨｉ测定方法，为进一步研究ＩＭＣＤ细胞功能奠定基础。
方法：将家兔肾脏ＩＭＣＤ细胞用盖玻片培养成细胞单层，制备ＩＭＣＤ细胞ｐＨｉ标准曲线，然后测定ＩＭＣＤ细胞的ＢＣＥＣＦ／ＡＭ的荧光强度比值（ＦＩＲ），进而将ＦＩＲ转换为ＩＭＣＤ细胞的ｐＨｉ。
结果：本实验观察到ＩＭＣＤ细胞的ＦＩＲ在ｐＨ６．８～７．８范围内呈显著正相关，回归方程为Ｙ＝０．８４８±１．０８９Ｘ（ｒ＝０．９８８，Ｐ＜０．０１）。
１５份标本的ｐＨｉ结果为７．２５５±０．０３０，与Ｍａｎｋｕｓ等报告的结果最接近。
结论：以上结果表明ＢＣＥＣＦ／ＡＭ荧光探针法测定ＩＭＣＤ细胞的ｐＨｉ，具有简单、可靠、经济等优点，ＩＭＣＤ细胞ｐＨｉ测定是研究ＩＭＣＤ细胞功能的基础测定之一。
【总页数】3页(P676-678)【关键词】肾脏内髓集合管;家兔;pH值;荧光探针法【作者】夏前明;黄坚;赵志强;钱桂生【作者单位】第三军医大学附属新桥医院全军呼吸研究所;成都军区总医院呼吸内科【正文语种】中文【中图分类】R334.1;R394【相关文献】1.荧光探针法测定家兔肾脏内髓集合管细胞单层Cl-/HCO3-交换 [J], 夏前明;李福祥;李鸿雁;肖贞良;黄坚;钱桂生2.家兔肾脏内髓集合管细胞的分离与原代培养 [J], 夏前明3.奥美拉唑对家兔肾脏内髓集合管细胞H+/K+交换功能的影响 [J], 夏前明;李鸿雁;全燕;肖贞良;李福祥;金成勇4.原代培养家兔肾脏内髓集合管细胞单层H+/K+交换测定 [J], 夏前明;黄坚;肖贞良;钱桂生5.地塞米松氨茶碱及特布他林对家兔肾脏内髓集合管细胞H+/K+交换和Cl-/HCO3-交换的影响 [J], 夏前明;李鸿雁;李福祥;全燕;肖贞良因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
原代肾小管上皮细胞的提取和培养方法的优化
收稿日期:2017-12-28基金项目:国家自然科学基金项目(21675017);中央高校基本科研项目(DUT17LK25)第一作者:曲玥阳(1988-),女,博士研究生,从事肾脏器官芯片研究,E-mail :yyqu@通信作者:罗勇(1978-),男,博士,副教授,从事器官微流控芯片研究,E-mail :yluo@原代肾小管上皮细胞的提取和培养方法的优化曲玥阳1,陈旭2,岳喜庆2,罗勇1,赵伟杰1,林炳承1(1.大连理工大学制药科学与技术学院/精细化工重点实验室,辽宁大连116023;2.沈阳农业大学食品学院,沈阳110161)摘要:为建立理想的研究农药中毒性肾病体外细胞模型,系统考察了原代肾小管上皮细胞提取和培养的一系列关键因素,经过优化组合,提出了一种更为高效实用的原代肾小管上皮细胞提取和培养方法。
通过显微镜明场观察肾小管节段组织形态和纯度,研究0.1%的Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、Ⅴ型胶原酶在15min 和3h 的时候对组织的消化情况以及Ⅱ型胶原酶作用0min,8min,15min,40min,1h,3h 时组织消化情况。
利用MTT 比色法考察了鼠尾I 型胶原,层粘连蛋白,基质胶对培养皿的包被情况对细胞增殖速率的影响,利用MTT 比色法考察不同浓度的血清对细胞增殖速率以及细胞活性维持的影响,细胞免疫荧光法考察不同浓度血清对肾小管上皮细胞的Na +/K +ATPase 表达的影响。
结果表明:利用Ⅱ型胶原酶,消化15min 可以获得较好的肾小管节段;利用基质胶包被培养皿是性价比最高的促进肾小管上皮细胞增殖的条件;观察到在细胞增殖期内,1%,2%,4%的血清浓度较0%和5%有较好的促进细胞增殖作用;在平台期内,2%,4%,5%的血清浓度较0%和1%有较好的细胞活性维持作用;第3天时,2%血清浓度培养的肾小管上皮细胞的Na +/K +ATPase 表达最强;第14天时,1%和2%血清浓度培养的细胞的Na +/K +ATPase 表达较好,最终确定血清最优浓度为2%。
肾小球壁层上皮细胞在肾小球疾病发生发展中的作用
肾小球壁层上皮细胞在肾小球疾病发生发展中的作用丛月①顾乐怡①戴慧莉①^系膜细胞、内皮细胞、足细胞和壁层上皮细胞(parietP epF the/ai cells,PECs)是肾小球内的四种固有细胞。
人们曾普遍认为PECs仅在新月体性肾小球肾炎的发生发展上发挥直接而重要的作用。
但随着近二十年来对PECs的研究深入,不少学者发现PECs在1糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)、局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)等疾病中均可能发挥重要的作用。
本文对PECs的细胞生物学及其在肾小球疾病发生发展中的作用进行综述。
1PECs的细胞生物学9I PECs的解剖定位和形态特征肾小球鲍曼囊的脏层即为肾小球血管上皮细胞，壁层则由鲍曼囊基膜及覆盖其上的PECs构成［2o PECs为单层的多边形细胞，胞体厚度为49~4.3pm不等,部分有核胞体的厚度则可达7.2-3.5pm。
胞质内仅含有少量的细胞器，包括部分线粒体、囊泡和高尔基体。
扫描电镜下可见约4~2根的初级纤毛附着于PECs表面。
相邻PECs之间存在紧密连接，构成了一个非常复杂的结构。
PECs在肾小球血管极移形为足细胞，在尿极则接续肾小管上皮细胞［］。
90PECs的命名和分类从形态结构上讲，鲍曼囊可分为极周区(血管极)、广泛的中央区、管周区三个区域。
位于血管极的称为极周细胞，是同时表达足细胞标志物和PECs标志物的过渡细胞群。
在血管极附近也存在异位的足细胞，称为“壁层足细胞”，它们能够形成足突，并表达足细胞特异蛋白(如Sy/aptopodin和WT-1)，有时也同时表达壁细胞相关蛋白［cOuPin-1,P—-7,Seratin(K)8和K2］。
覆盖在广阔的中央区域的是表达壁细胞相关蛋白的经典扁平PEC s(4p-PEC s)。
在管周区存在一种立方形PECs(cuboidaWECs7PECs),它与近端小管上皮细胞具有相同的形态学特征。
细胞培养相关技术
培养细胞活力测定
台盼蓝法，trypan blue， 利用染料会渗 入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜 完整，染料无法渗入而不会呈色。用活 细胞占细胞中的百分比表示细胞活力
MTT法
转染 (Transfection)
将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸 在细胞内维持其生物功能
常特指将质粒或以它们为载体构建的重组子导入真 核细胞的过程。
克隆培养（clonal culture），将高度稀释的游离细胞悬 液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经 过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆 （clone）。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个 祖先细胞。
群体培养（左）和克隆培养（右）
培养细胞生长的条件
无污染环境: 生物安全柜，超净工作台
一般说来，含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞 不死，但支持细胞生长一般需加 10％血清。
常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血 清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。
优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、 支原体、病毒污染。
血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟 血清的消毒：过滤除菌
80％一95％ 5％一20％
2.0 g/L 各100单位／毫升
细胞培养基本方法（无菌原则）
无菌工作台用75%酒精擦拭干净，紫外线照射40分钟以 上。
清洗双手及手腕，戴乳胶手套，然后用75%酒精擦拭。 操作时注意无菌台内空间层次。整个操作过程尽量在无
菌台靠里面一点。手及物品不要在暴露的瓶口上方来往， 严格注意无菌操作。
5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。 低速离心10分钟。 去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。
人胚胎肾小球系膜细胞培养与鉴定
人胚胎肾小球系膜细胞培养与鉴定中国中西医结合肾病杂志2006年8月第7卷第8期qIrnvN,August2006,vb1.7,No.8短篇论着?人胚胎肾小球系膜细胞培养与鉴定赵湘①周永列①茅夏娃①祝正明②谢月英③金李君②郭俊华②肾小球系膜细胞(glomerularmesangialcells,GMC)是肾小球内具有活跃功能的固有细胞,多种刺激因素均可使肾小球系膜细胞增生,构成各种肾小球疾病的病理基础,进而因系膜基质增多而导致肾小球硬化.自1975年Fish等【1J首次成功培养分离GMC以来,国内外学者已将肾小球系膜细胞的体外培养作为研究肾脏细胞生物学及细胞免疫病理学的常用方法之一.由于肾小球系膜细胞培养方法各异[2--4],难度较大.为此,我们在借鉴国内外学者研究方法的基础上进行探索,成功地培养了人胚胎肾小球系膜细胞,现报告如下.材料与方法1材料RPMI一1640干粉,HEPES,0.25%胰蛋白酶/0.02%EIYI'A,Gibco公司产品;胎牛血清,杭州四季青生物技术有限公司;L一谷氨酰胺,上海康捷生物科技发展有限公司;丙酮酸钠,上海振翔化学试剂研究所;青霉素,链霉素,两性霉素,华北制药股份有限公司;胰岛素,万邦药业;转铁蛋白,Ⅱ型胶原酶,Sigma公司产品;抗Ⅷ因子相关抗原,鼠抗人结蛋白,兔抗人角蛋白,鼠抗人肌动蛋白,鼠抗人波形蛋白,SantaCruz公司产品;异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG,DAKO公司产品.2方法2.1提取肾小球(1)无菌条件下取人胚胎肾脏(孕16--24周,水囊引产,孕母无肾脏病,糖尿病及高血压病史).(2)将所取组织用生理盐水清洗,除去表面血污,并用手术镊去除黏附的结缔组织和非培养所需组织,再次清洗后,用弯头剪剥除肾包膜及肾髓质.(3)将皮质部位剪成糊状或剪成2～3inrn细条后用消毒玻璃针芯轻研磨,不时用4℃Hankps液冲洗.连续过100目,200目不锈钢筛.(4)在200目不锈钢筛网上收集肾小球,用无菌吸管吸取少许肾小球悬液加0.5%台盼蓝染色,普通显微镜下观察提取肾小球的纯度,着色情况及有无脱去包曼氏囊,并行肾小球计数.若见纯净的小球(肾小球纯度>95%)即可停止冲洗. 收集此层组织收集人15ml塑料离心管中.2.2消化肾小球(1)将收集到的肾小球以低温(5℃)离心机离心,1000r/min,离心5min,弃上清.(2)加入无血清RPMI一1640液10n1l清洗一遍,再以1000r/min (5℃),离心5min,吸尽上清液.(3)加入0.1%Ⅱ型胶原酶3ml,放人37℃水浴箱消化15min以松懈肾小球包氏囊(边消化边观察,以肾小球中有细胞散出但又不破碎为适度).(4)以1500r/min离心(5℃)5min,弃上清.(5)加入无血清RPMI一1640液清洗3遍,每次10ml,震荡后再①浙江省人民医院肾内科(杭州310014)②浙江中医药大学(杭州310053)③浙江医学高等专科学校(杭州310053)409?离心(5℃)1500r/min,离心5min.2.3种植肾小球(1)上述洗涤离心后,弃上清.取沉淀加入含20%胎牛血清(R)的RPMI一1640液5m1,终止消化.(2)混匀分散并计数悬浮的肾小球后,配成适当密度分装于3个25m1塑料培养瓶中,在5%CO2,37℃恒温恒湿培养箱中培养.(3)开始3d内不要晃动培养瓶,以防止影响肾小球的贴壁生长.(4)5d后更换细胞培养液,以后每3d换液1次.(5)培养7～14d后即见细胞生长,呈棱形或星形及少量扁平上皮细胞.20d后细胞长满瓶底,进行转种消化传代.2.4系膜细胞的传代(1)用DHank'S液轻洗培养瓶内细胞2～3遍.(2)加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA 1～2m1(以铺满瓶底为度),置于37℃,5%CO2培养箱中约5min,用倒置显微镜观察,当细胞收缩变圆,似欲脱离瓶底,立即加入4℃20%FCSRPMI一1640终止消化.(3)用弯头吸管,吸取瓶内培养液,反复轻轻吹打瓶壁细胞,吹打过程要按顺序进行,从培养瓶底部一边开始到另一边结束, 以确保所有底部都被吹到.(4)细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液,收集于15ml塑料离心管中,5℃下以1000r/min离心5min,吸出上清,用含20%R的RPMI一1640液重新悬浮细胞.(5)计数:以10/ml密度转接种于25ml塑料培养瓶,置人5%CO2培养箱37℃培养.以后每3～4d换液1次,待细胞长满瓶底(7d)后再次消化传代.3观察方法3.1培养与观察原代培养后第3d.将细胞培养瓶取出于倒置显微镜下观察,记录壁层.肾小囊脱落情况,肾小球贴壁数多少,悬液中含有杂质的量及贴壁肾小球周围系膜细胞生长情况.5d后,肾小球上皮细胞开始爬出,因不适合此培养条件,15d左右,上皮细胞基本死亡.随后,系膜细胞从肾小球中移出生长,约21d左右布满瓶底.3.2形态学观察利用光镜(染色),透射电镜,扫描电镜对原代及传代培养细胞进行形态学观察.以间接免疫荧光的方法,分别将原代培养(21d)及传代培养(5d)的细胞用4℃甲醇固定10min,PBS洗涤3次,吹干;加入鼠抗人Ⅷ因子(FactorⅧ)抗体,抗结蛋白(Desmin)抗体,波形蛋白(Vitronectin)抗体,肌动蛋白(actin)抗体,兔抗人抗角蛋白(keratin)抗体及荧光素标记的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG进行间接免疫荧光染色,对培养的细胞进行鉴定.结果1肾小球的提取经2种不同目数的不锈钢筛网提取的肾小球,用0.5%台盼蓝染色后经倒置显微镜观察显410?中国中西医缝合肾病杂志2006年8月第7卷第8期cJI1wN,August2006,voI.7,No.8示:95%以上的肾小球均脱去包曼氏囊且不着色.视野中基本上无肾小管存在.2细胞生长情况原代培养的小球5d大多贴壁,细胞逐渐从肾小球爬出.最初长出的细胞呈卵圆形,排列呈铺路石状,主要为上皮细胞.10d左右贴壁的肾小球块周围系膜细胞数量明显增多,局部有细胞连成片生长.14d左右上皮细胞死亡消失,代之以梭形,不规则星形或树枝状胞体透亮的系膜细胞.至21d时,上皮细胞完全消失,系膜细胞渐长成融合状.传代后系膜细胞一般于24h贴壁,2～3d更换培养液1次,7～10d细胞即可长成融合状.3系膜细胞的镜下形态3.1倒置显微镜生长活跃的系膜细胞胞体呈梭形及不规则星形及三角形,中央有一清晰的卵圆形核,胞质向外伸出数个长短不一的突起.3.2普通光镜HE染色培养21d时,细胞经HE染色后普通光镜下可见细胞结构清晰,胞质呈粉红色,细胞核呈蓝紫色.胞体呈梭形及不规则星形及三角形;核居中央,多呈圆形或椭圆形;胞浆向外伸出数个长短不一的突起,见大量微丝样结构.见图1,图2.3.3透射电镜培养21d时的肾小球系膜细胞透射电镜下观察:细胞形态多样,边缘有较多指状突起.胞质中富含粗面内质网,游离核糖体,高尔基复合体,胞质中可见少量分泌颗粒.细胞内有大的圆形或椭圆形核,居中,含1个或2个核仁,核膜清晰;核染色质分布稀疏,核周围胞质及胞浆内含丰富的束状微丝结构.见图3,图4.3.4扫描电镜扫描电镜显示系膜细胞外层无肾小囊壁层上皮包围,足细胞直接暴露于外环境并伸出粗钝的初级突起及较纤细的指状突起,足细胞形态较完好.细胞体部较厚,细胞边缘有长短不一的丝状伪足,细胞表面可见数目不等的点状隆起,即微丝束隆起.见图5.4系膜细胞的免疫荧光鉴定培养第21d时,利用FITC标记的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG对鼠抗人Ⅷ因子(FactorⅧ)抗体,抗结蛋白(Desmin)抗体,波形蛋白(Vit—ronectin)抗体,肌动蛋白(actin)抗体,兔抗人抗角蛋白(ker—atin)抗体进行间接免疫荧光染色,显示肾小球系膜细胞中结蛋白,波形蛋白,肌动蛋白染色均为阳性,而角蛋白和Ⅷ因子染色均为阴性.证明所培养的细胞为系膜细胞.见图6～图8.讨论体外培养肾小球系膜细胞的成功为研究肾小球疾病发病机制提供了必要的条件.尽管不同来源的系膜细胞均有其应用价值,但水囊引产胚胎肾皮质提取的系膜细胞更具有人类细胞的特点,较其他细胞更接近临床医学,且细胞生长旺盛,细胞得率高.故本研究取水囊引产胚胎肾进行肾小球系膜细胞培养,探索系膜细胞培养的最佳条件,为今后深入研究奠定基础.经分离提取并去除包氏囊的肾小球固有细胞包括肾小球上皮细胞,内皮细胞,系膜细胞.要培养出肾小球系膜细胞必须排除上皮细胞和内皮细胞的污染.由于内皮细胞营养要求极高,一般条件下不能存活.故培养肾小球初期长出的细胞主要是上皮细胞及系膜细胞J.据国外文献报告上皮细胞生长高峰在培养肾小球后第1周,最适血清浓度为5%,而系膜细胞生长高峰在肾小球培养2周后,最适血清浓度为l5%～20%.此外,上皮细胞不能耐受胰蛋白酶消化的传代处理,极易在传代后死亡.因此,选择适宜的血清浓度及最佳的转种时机,可获较纯的系膜细胞.肾小球细胞的获得可通过直接培养分离的小球,但这种小球培养贴壁慢,细胞不易长出.一般用胶原酶对分离的小球进行消化.经消化的小球结构疏松,贴壁时间缩短, 细胞易长出l3J,但消化过度,小球块过碎漂浮不沉,反会影响小球的贴壁.肾小球消化中严格掌握胶原酶浓度,pH 值,温度及孵育时间至关重要.选择最佳消化状态应以肾小球结构松动且不被破坏为佳.我们通过反复摸索,确定0.1%Ⅱ型胶原酶(Sigma公司)3ml,放人37℃水浴箱消化15min,为最适消化时间.肾小球培养中,小球贴壁与否是系膜细胞培养成败的关键.一般种植肾小球后的3d内勿动培养瓶,以免影响肾小球贴壁.于种植后第5～6d,观察肾小球贴壁率达50% --80%时才首次更换培养液,以后每2～3d换1次液l2J.因首次培养时间长,换液迟,故开始时间营养液应多加一些,避免因营养缺乏而致系膜细胞生长欠佳.直至2～3周时,细胞融合达80%以上,应对系膜细胞进行传代.传代时可先用D—Hanks液洗细胞3遍,并用含EDTA的胰蛋白酶作为消化液以充分分散细胞.传代时的细胞密度以10/ml为宜,细胞生长较快,形态也较好.肾脏中每种细胞均有其特异的鉴定标志.内皮细胞Ⅷ因子表达阳性,系膜细胞同时表达结蛋白和肌动蛋白,成纤维细胞波形蛋白和成纤维细胞特异蛋白表达阳性,小球及小管上皮细胞角蛋白表达阳性.本研究在种植肾小球后除了定期行光镜检查外,还采用电镜及间接免疫细胞荧光法对原代培养21d时的细胞进行了鉴定.电镜观察表明培养的细胞富含微丝结构,符合系膜细胞特征.间接免疫细胞荧光法证实:抗Ⅷ因子(FactorⅧ)抗体染色阴性排除了内皮细胞的存在,抗细胞角蛋白(keratin)抗体阴性排除了上皮细胞存在的可能性.而抗(Oesmin)抗体,波形蛋白(Vit—ronectin)抗体及肌动蛋白(actin)抗体染色阳性则证实培养存活的细胞确为肾小球系膜细胞.(本文图见插页1—2)参考文献1.FishAl,MichaelAF,V ernierRL,eta1.Humanglomerular bInvest,1975,33(3):330—341.2.谌贻璞,高进,谌霞,等.肾小球系膜细胞培养.北京医科大学,1989,21(4):335—336.3.于力方,陈香美,黎磊石.正常人肾小球系膜细胞培养的研究.中华肾脏病杂志,1990,6(2):70.4.潘晓勤,王晓燕,姜新猷.肾小球系膜细胞培养及鉴定.南京医科大学,1995,15(1):222—223.5.KreisbergJI,KarnovskyMJ.Glomeruarcellinculture.Kid—neyInt,1983,23(3):439—447.6.HarperPA,RobinsonJM,HooverRL,eta1.Improvedmeth—odsforculturingratglomerularcells.KidneyInt,1984,26 (6):875—880.(收稿:2006—03—2O)英穴青致非二J'尿型急性肾衰竭1例墨2oo/麓嚣见正文408页目3I部H分E~%域,x管l0o急}坏Ⅱ人胚胎肾小珠系膜细胞培养与鉴定见正文409页豳g200)黯质分布稀疏(×15OOC)黥嚣箍等的状隆起微膣箍染色呈(×400)":插页1—2黯褫嚣需体染性f×400)。
改良法人胎肾小球系膜细胞原代培养
产胎儿 肾， 离皮质后 ， 分 筛网滤过分 离肾小球 ， Ⅳ型胶 原酶 消化 ， 接种 肾小球 时分别采用传统 方法（ １ ） 第 组 和预 先浸湿瓶底并 以胎 牛血清 中和胶原 酶替代 离心洗涤 （ ２组） 第 两种方 法 ， 察 系膜 细胞 生长状 态。并采用免疫 细胞化 学检测 第 ３代 肾小球 观 系膜 细胞的结蛋 白（ ｍｉ） 肌动蛋 白（ ｔ ） 波形蛋 白（ ｉ ｎｉ）细胞 角蛋 白（ ｙｏ ｅ ｉ） Ⅷ 因子（ ａｔｒ 等相关抗原 Ｉ ￣ｓ ｎ 、 Ａｃｉ 、 ｎ Ｖｍｅｔ 、 ｎ Ｃ ｔｋｍｔ 、 ｎ Ｆ ｃｏⅧ） 的表 达 ， 鉴定 系膜 细胞 ， 并绘 制其生长 曲线， 计算倍增 时间 。结果 ： 两组 肾小球 贴壁 率分别 ７ ％和 ９ ％ ， １ ０ 系膜 细胞 开始爬 出时 间为 １ 和 ７ｄ 次代倍增 时间为 ３ ９ ３ ５ ， １ｄ ， ．４ｄ和 ．２ｄ 细胞生长状 况有 统计 学差异 。第 ２组传代 的 系膜细胞 １ｄ内贴壁 ， 周后 １ 长满。细胞 呈三角 、 形、 梭 不规 则形半透 明 ， 树枝 状 突起 。免疫化 学鉴定 Ｄ ｓ ｎ Ｖｉ ｎｉ ｅｍｉ、 ｍｅｔ ｎ和 Ａ ｔ ｅｉ ｎ阳性 ，ａｔｒ Ｆ ｃｏⅧ和 Ｃ ｔｋｒ ｙｏｅ—
ｐａ ｅ ｙ ｔｅｒｍｎ ｎ ｓｏ ｌ ｇ ｎ ｓ ｔ ＣＳ． ｅｃｌ ｌｒ ｒ ｋ ｒ ｃｕ ｉｇＤｅｍｉ Ａｃｉ Ｖｉ ｎ ｉ Ｃｙｏ ｅａｉ ａ ｄＦ ｃｏ ｌ ｌｃｄ ｂ ｈ ｅ ａ ｔ ｆｃ ｌ ｅ ａ ｅｗｉｈＦ ｏ ａ Ｔｈ ｅｌ ａ ｕ ｍａ ｅｓｉ ｌｄｎ ｇ ｎ， ｔ ｎ ｎ， ｍｅ ｔ ｎ， ｔｋ ｒｔ ｎ ａ ｔｒＶ ｎ，
豚鼠肾小管上皮原代细胞的培养
豚鼠肾小管上皮原代细胞的培养孙玉竹;刘迪文;吴旧生【摘要】Objective To establish an efficient and good reproducible method for primary culture of guinea pig renal tubular epithelial cells (gpRTECs). Methods Screen separation and several enzymatic digestions were used to obtain renal tubular epithelial cells of high purity. Immunohistochemical and morphological examinations were used to identify the purity of gpRTECs. Results Directly adherent tubular segments and collagenase digestion were used to effectively promote the primary culture of gpRTECs. The result of trypsin digestion segment was slightly less effective than that of collagenase digestion. Subculture passages of the gpRTECs were unsatisfactory. The result of trypsin digestion of segments into cells was worst, showing poor survival and proliferation of these cells. Conclusion It is feasible to obtain primary culture renal tubular epithelial cells of guinea pigs.%目的建立一种简便易行的豚鼠原代肾小管上皮细胞培养方法.方法运用筛网分离法和多种酶消化法获取高纯度的肾小管上皮细胞.利用免疫组化法和形态学观察法鉴定培养的肾小管上皮细胞性质及纯度.结果通过肾小管节段贴壁,胶原酶消化组织节段和细胞等方法,有效地促进肾小管原代细胞增殖;胰酶节段消化法的细胞贴壁效果稍差,细胞传代状态不理想;胰酶消化法则细胞贴壁较少,细胞生长状态较差.结论培养豚鼠原代肾小管上皮细胞是可行的.【期刊名称】《中国实验动物学报》【年(卷),期】2013(021)001【总页数】4页(P84-86,封4)【关键词】肾小管上皮细胞;原代培养;豚鼠【作者】孙玉竹;刘迪文;吴旧生【作者单位】浙江大学动物科学学院,浙江大学实验动物中心,杭州,310058;浙江大学动物科学学院,浙江大学实验动物中心,杭州,310058;浙江大学动物科学学院,浙江大学实验动物中心,杭州,310058【正文语种】中文【中图分类】Q95-33;R285.5目前在分子生物学、免疫学和病理学等实验中，普遍采用各类细胞株作为试验载体，但由于细胞株部分基因已经变异或者缺失，因此变得和机体正常细胞的性状存在很大差异，而原代细胞比细胞株能更接近地反映机体正常细胞的生理状态。