乳鼠肾细胞原代培养传代培养

乳鼠肾细胞的原代培养、传代培养

目的要求

一、了解细胞原代培养、传代（继代）培养的基本方法和操作过程。

二、初步掌握培养过程中的无菌技术。

三、掌握在例置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。

用品

超净工作台

恒温培养箱

普通显微镜

例置相差显微镜

水浴箱、离心机

解剖剪、眼科剪

镊子（尖头、平头和有钩镊）

烧杯

培养瓶

离心管

吸管

血球记数板

酒精灯

单个仪器逐个弹出在屏幕上，小器械逐个弹出在超净台上

培养用品

RPM1 1640培养液（含小牛血清及青、链霉素）

试剂库弹出具体内容酒精冻存培养液胰蛋白霉---⎪⎪⎭

⎪⎪⎬⎫75%PBS 0.25% RPM1 1640、0.25%胰蛋白霉、PBS ，冻存培养液微热字显示

动物细胞及细胞系

新生乳鼠（小鼠）

中国仓鼠卵巢细胞（CHO ）

人宫颈癌细胞（HELA ）

以上三个也为热字显示

乳鼠肾细胞原代培养

方法1—单层细胞培养法

所有组织中都有一定量的细胞间质（纤维和基质等），对细胞生长有妨碍作用，

用胰酶消化能出去间质，使组织松散成单个细胞或小的细胞团，细胞易于生长。 步骤

1．培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。

2．点燃酒精灯，用品按布局放置，安装吸管等

3．取材

取新生乳鼠一只，采用颈椎脱臼法处死，然后把这个小鼠进入盛有75%酒

精的烧杯中2-3秒，随即携入超净工作台内。

在超净工作台内取出小鼠，置于消毒培养皿中

打开消毒器械包

用镊子掀起乳鼠腹部皮肤，用解剖剪剪开腹腔，充分暴露腹腔，

用另一镊子轻轻夹起肠管，翻置一侧，充分暴露位于腹腔背壁脊柱两侧的肾脏

取下双侧肾脏，放入消毒培养皿中

用吸管吸取PBS加入培养皿中，清洗肾脏3次，尽量去掉血污

再将肾组织用解剖剪剪成几块

再用PBS漂洗，去净血液为止

4．消化

将洗净的组织块移入消毒小瓶中（如毒霉素瓶）用眼科剪深入瓶内反复剪切组织直至0.5mm大小的组织块

加入5-8倍量（体积）的0.25%胰蛋白酶，盖好放入37︒C水浴中消化20-30分钟，注意应每隔5分钟振摇一次。

当组织块变得疏松，颜色略白时，取出置于超净工作台内

用吸管反复吹打组织块，使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞状态加入1-2ml培养液终止消化

净置片刻，让未消化完的组织块自然下沉，将上部的组织悬液移入消毒离心管中离心

5．离心及计数

离心管平衡后，以800-1000转/分离心8-10分钟，超净工作台内开盖，吸取上清液

加入3-5ml培养液，盖盖，注意应有空隙，标明细胞名称，代数，日期。

在倒置相差显微镜下观察细胞分散情况后置37︒C孵箱中培养

新生乳鼠（活）→新生乳鼠（死）→放在70％酒精烧杯中→被平放解剖→

组织块在平器中→放入PBS清洗→组织块入小瓶中→被剪刀剪切→小瓶放

入水浴箱中消化→小瓶中液体转移至离心管→离心机→人面容显微镜（计数

细胞）→操作人向培养瓶中放液体→培养瓶被放入CO2孵箱。

这为一系列照片组成的动画效果显示。

原代培养细胞的观察

每天要对按种培养的细胞做常规性检查，观察的主要内容是：

污染与否

细胞生长状态

PH（通过培养液颜色变化）

如发现培养液变为黄色且又混浊，表明已被污染，这时细胞不易贴壁生长，逐渐死亡。

如培养液为桔红色，一般说明细胞生长状态良好

在没有发生污染的情况下，一般按规24h，可见到许多细胞贴壁，由圆形悬浮状态的细胞延展成短梭状。

培养3—4天时，细胞生长繁殖，数量增加，可见细胞形成孤立小片（细胞岛），逐渐扩展。细胞透明，颗粒少，界线清楚，状态佳。

由于细胞生长旺盛，代谢产物堆积，CO2增多，培养液逐渐变酸呈黄色，但液体澄清，此时换液一次。

大约7—10天，原代培养细胞可基本辅满瓶壁，形成致密单层，这时可进行传代培养。

方法II——组织块培养法

组织切成0.5—1mm3的小块后，由于组织块体积很小，再不加任何粘着剂情

况下，它们也能直接贴付与瓶壁上，然后细胞从组织块边缘向外长出生长晕，最后连接成片而形成单层细胞。此方法程序简化，是常用的原代细胞培养方法。

步骤

1．取材镊同单层细胞培养法

2．洗净的组织块移入消毒平皿中，也可用小瓶代替。用眼科剪反复剪成

0.5-1mm3小块

用吸管滴加几滴培养液，轻轻吹打混匀

用吸管分次吸取小碎块悬液，注意吸在吸管前端部，以免吸德过高，组织小块粘附与管壁而丢失

将组织碎块在培养瓶低上散开摇匀

然后翻转培养瓶，加入2-3ml培养液(15mm2)盖好，标记好，置37 C孵箱中培养2-3hr

待组织小块略干燥，能牢固贴在瓶壁时，再慢慢翻转培养瓶，使培养液浸泡组织块，净置培养，动作一定要轻，减少振动，否则会使组织块脱落，影响贴壁培养。

观察

净置培养3天后开始观察，移动培养瓶时要尽量时培养液震荡撞击组织块。

注意检查有否污染处，应再显微镜下观察组织小块边缘有否细胞，一般最先出现的时形态不规则的游走细胞，接着是成纤维细胞或上皮细胞

当细胞分裂，细胞数量增多时，在组织块周围可见到生长晕

随后细胞生长分裂增快，呈放射状向外扩展逐渐连成一片

可根据培养液颜色，更换培养液

约10-15天后细胞可长成单层，即可传代培养