第五章 细胞的原代与传代培养
第5章 细胞的原代与传代培养
第5章细胞的原代与传代培养关于细胞培养中常涉及的概念,及培养过程中涉及的问题给予了很好的讲解。
第五章细胞的原代与传代培养关于细胞培养中常涉及的概念,及培养过程中涉及的问题给予了很好的讲解。
一、原代培养概念：取自体内新鲜组织并�Z于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。
关于细胞培养中常涉及的概念,及培养过程中涉及的问题给予了很好的讲解。
原代培养技术的重要意义: 原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具有二倍体的遗传性，而且大多数细胞表现出原来组织的特性。
利用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。
原代培养也是建立各种细胞系(株)必须经过的阶段。
关于细胞培养中常涉及的概念,及培养过程中涉及的问题给予了很好的讲解。
原代培养消化法贴块法冷消化温消化一次性消化分次消化消化法：这种培养过程主要是采用无菌操作的方法，把组织(或器官)从动物体内取出，经酶消化处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。
关于细胞培养中常涉及的概念,及培养过程中涉及的问题给予了很好的讲解。
原代培养方法分类贴块法消化法关于细胞培养中常涉及的概念,及培养过程中涉及的问题给予了很好的讲解。
93分次消化消化法的分类关于细胞培养中常涉及的概念,及培养过程中涉及的问题给予了很好的讲解。
解离释放细胞的方法最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。
用酶学解离细胞法解离细胞是体外培养动物细胞时分散组织的基本方法，最常用的消化酶是胰蛋白酶和胶原酶两种。
关于细胞培养中常涉及的概念,及培养过程中涉及的问题给予了很好的讲解。
动物细胞原代培养过程图关于细胞培养中常涉及的概念,及培养过程中涉及的问题给予了很好的讲解。
器材和液体的准备细胞培养用的玻璃器材培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，160℃,2小时干烤灭菌后备用手术器材、瓶塞等15磅，121℃,20分钟蒸气灭菌 MEM培养液、消化液、PBS液等用滤器过滤后备用关于细胞培养中常涉及的概念,及培养过程中涉及的问题给予了很好的讲解。
原代培养和传代培养
原代培养:即第一次培养，是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。
有几方面含义：●培养物一经接种到培养器皿（瓶）中就不在分割，任其生长繁殖；●原代培养中的“代”并非细胞的“代”数，因为培养过程中细胞经多次分裂已经产生多代子细胞；●原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液，也不等于不更换培养器皿。
正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。
所谓转化即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。
目前世界上许多实验室所广泛传用的HeLa细胞系就是1951年从一位名叫Henrietta Lacks的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成。
此细胞系一直延用至今。
原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞的生长就会出现停滞，大部分细胞衰老死亡。
但是有极少数的细胞能够度过“危机”而继续传下去，这些存活的细胞一般能够传到40～50代，这种传代细胞叫做细胞株。
细胞株的遗传物质没有发生改变,在培养过程中其特征始终保持。
当细胞株传至50代以后又会出现“危机”，不能再传下去。
但是有部分细胞的遗传物质发生了改变，并且带有癌变的特点，有可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称为细胞系。
原代培养是建立各种细胞系（株）必经的阶段，其是否成功与组织污染与否、供体年龄、培养技术和方法、适宜培养基的选择等多种因素有关。
由于原代培养的细胞转化性极小，对病毒敏感性好，因此适应制备疫苗等生物制品；但也存在有潜在外源因子、不能事先检查标本、且受供体年龄健康状况的影响而导致批间差异大等缺陷。
目前常用的原代细胞培养有鸡胚成纤维细胞及猪肾、猴肾、地鼠肾等原代细胞。
原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种、加培养液、置培养条件下培养等步骤，在所有的操作过程中，都必须保持培养物及生长环境的无菌。
多数情况下，分散的细胞若属于贴壁依赖型细胞，就能黏附、铺展于培养器皿和载体表面生长而形成细胞单层，这种培养方式称为单层细胞培养（monolayer culture），又叫贴壁培养（adherent culture）。
细胞的原代培养和传代培养
实验五细胞的原代培养和传代培养1. 实验目的初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程。
2. 实验指导细胞培养(cell culture)是从机体中将细胞取出后，在模拟生物体内生理条件下使其在体外生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命活动过程的方法。
进行细胞生物学、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
近年来，广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成为一种重要的生物学技术。
细胞培养一般可分为原代培养和传代培养。
所谓原代培养，是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。
原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。
一般动物和人的所有组织都可以用于培养，但幼体组织和细胞(如胚胎组织、幼仔的脏器等)更容易进行原代培养。
传代培养则是为了使体外培养的原代细胞或细胞株在体外持续生长、繁殖。
细胞持续生长繁殖就必须传代，并由此获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞。
培养的贴壁细胞形成单层汇合后，由于密度过大、生存空间不足而引起营养枯竭。
将培养的细胞分散，从容器中取出，以1：2或1：3以上的比例转移到另外的容器中继续进行培养，即为传代培养。
要使细胞在离体情况下生长繁殖，培养条件必须尽可能接近体内，除营养物质外，温度、PH值、生长因子等也至关重要。
此外，还应避免细菌及其他微生物的污染，重金属离子及有毒化学物质及放射线的影响。
贴壁细胞通过质膜表面的粘着蛋白贴附于培养瓶表面。
加入消化液可使粘着蛋白部分水解，从而使培养的细胞游离。
但消化时间不可过长，否则可能导致细胞解体死亡。
常用的消化液为胰蛋白酶和EDTA。
二者可分别使用，也可共同使用。
钙离子是二者的抑制剂，故实验中消化结束时，加入含有钙离子的全培养液，即可终止消化。
细胞的一代是指细胞从接种到分离再培养的一段时间，与细胞世代或倍增不同，在一代中细胞倍增3～6次。
细胞传代后一般经过三个阶段：游离期、指数生长期和停止期。
传代培养法
传代培养法是一种细胞培养技术，用于将原代细胞转化为可反复传代的细胞系。
这种方法的步骤如下：
1. 原代细胞适应阶段：原代细胞从组织中分离出来后，需要经过适应阶段以适应该培养环境。
在此期间，细胞逐渐适应贴壁生长，并逐渐分裂增殖。
2. 传代阶段：当原代细胞生长到一定阶段后，需要进行传代。
传代是将原代细胞接种到新的培养液中，以继续增殖生长。
传代过程中需要注意细胞的生长状态和密度，以避免过度生长或污染。
3. 维持培养：传代后的细胞系需要继续培养，以维持其生长和增殖。
在此过程中，需要定期更换培养液，以避免代谢产物的积累和细菌污染。
4. 细胞冻存：为了保持细胞的活力和稳定性，需要进行细胞冻存。
细胞冻存是将细胞保存在低温下，以延长细胞的寿命并保持其遗传稳定性。
传代培养法是一种常用的细胞培养技术，可以用于原代细胞的扩大培养和细胞的遗传稳定性研究。
同时，传代培养法还可以用于制备疫苗、基因治疗和组织工程等领域。
细胞培养的过程及注意事项
3 6 细胞培养的过程及注意事项细胞的培养过程及注意事项；根据培养过程中是否需要分割培养物进行再培养而将细；一、原代培养；（一）过程；原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种；1、组织块培养法；（1）基本操作过程；1）、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪；2）、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养；3）、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一；4）、将种植了组织块细胞的培养过程及注意事项根据培养过程中是否需要分割培养物进行再培养而将细胞培养分为原代培养和传代培养。
一、原代培养（一）过程原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种及培养等步骤。
原代培养的方法很多，基本和最常用的是组织块培养法和分离细胞法。
1、组织块培养法（1）基本操作过程1）、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪将附在其上的脂肪和结缔组织去除干净。
再用平衡液（PBS）或Hanks 液漂洗；用锋利的眼科弯剪将组织块剪成小块；再用PBS或Hanks 液漂洗多次，直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。
2）、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养瓶皿中，并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上，量不要过多，要将组织块切面贴在培养瓶底壁上；3）、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一侧的对侧面加足培养液，勿使组织块与培养液接触，塞紧瓶塞；4）、将种植了组织块的一侧朝上，静置于37℃培养箱中；待组织块贴壁1h到3h 后翻瓶，使贴壁的组织块浸没与培养液中，静置；5）、每隔2到3天更换一次培养液，或者根据培养瓶种颜色的变化确定换液时间。
2、注意事项1）、组织块接种后的前3 天，从组织块向外迁徙的细胞数很少，组织块的黏附不牢固，在观察和移动的过程中，注意不要引起液体的振荡。
要避免经常翻动和振动，否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。
2）、加入的培养液不宜过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来。
3）、用组织块培养时，要及时观察，当细胞向外迁徙出来后要注意记录并去除漂浮的组织块和残留的细胞，因为已漂浮的组织块和那些细胞碎片已经死亡，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长，要及时清除。
细胞的原代培养
细胞原代培养【实验目的】1.理解细胞原代培养原理2.熟悉细胞原代培养方法与过程3.了解细胞原代培养的应用4.独立进行细胞原代培养操作【实验原理】1、原代培养实验原理细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。
原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养，即组织直接从机体获取后,通过组织块长出单层细胞,或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养,在首次传代前的培养可认为是原代培养。
由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。
这一方法可为研究生物体细胞的生长，代谢，繁殖提供有力的手段。
同时也为以后传代培养创造条件。
原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后，经机械法或各种酶类（常用胰蛋白酶）和鳌合剂（常用EDTA)处理，使之分散成单个细胞,加入适量培养基，置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖的过程。
原代培养的方法有：a.组织块法:在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。
用Hanks液洗涤2—3次，自然沉淀。
用吸管吸去上清液。
将组织块贴于培养瓶进行培养。
b.酶消化法:将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的0.125%的胰蛋白酶。
370C磁棒搅拌消化20－30分钟。
然后终止消化。
用几层无菌纱布过滤。
取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。
弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。
【实验仪器、材料、试剂及用品】1.仪器：荧光显微镜，CO2培养箱2.材料：孕鼠3.试剂：(1) 培养液：为DMEM，添加10％新生牛血清(NBS)、青霉素100 u／ ml 、链霉素100ug／ml。
(2)消化液：为0.125％胰蛋白酶—0.02％EDTA 混合消化液。
4.用品：镊子，剪刀，培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯、小指管。
【实验步骤】(一)小鼠胚胎的准备:1.取怀孕16～18d的母鼠，断颈处死，置于75%的酒精中。
动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法
动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法1. 引言嘿，大家好！今天咱们聊聊动物细胞的培养，听起来可能有点高大上，但其实就像种花一样，只是“花”是细胞，养护的方法也有讲究。
说白了，细胞也有自己的“家”，咱们得给它们创造个舒适的环境，让它们在里面嗨起来！接下来，我就带你走进这个充满神奇和乐趣的细胞世界。
2. 原代培养2.1 什么是原代培养？原代培养，简单来说，就是从活体动物身上直接提取细胞，然后把它们放在培养皿里，就像把新鲜的花插进水里一样。
你知道吗，这些细胞就像刚从大自然里来的小家伙，特别活泼，适应能力强。
不过，这可不是随便就能搞定的，得有点技术活。
2.2 原代培养的方法首先，咱得准备好一切工具，这可是基础中的基础，不能马虎。
咱们要用到无菌技术，确保培养环境干净得像新洗的碗，不然细胞们就会遭殃。
提取细胞时，通常会用胰酶把它们从组织中“松开”，就像剥开一个大榴莲，里边的果肉才好吃嘛。
然后，把这些细胞放到培养基里。
培养基就像细胞的“快餐”，里面有细胞需要的各种营养物质和生长因子。
要记得，细胞也要“吃好”，才能长得壮壮的，不然就不成气候了。
培养的环境也不能小看，温度、pH值、二氧化碳浓度都得保持稳定。
咱们得把细胞放在适合的温度下，就像给它们开个温暖的“家庭聚会”。
如果环境不合适，细胞就会抗议，甚至罢工！3. 传代培养3.1 什么是传代培养？说到传代培养，那就是把原代培养中的细胞继续繁殖，让它们“生儿育女”。
这就像一个大家庭，越来越壮大，热闹得不得了。
传代培养可以让我们获得更多细胞，方便后续的实验和研究。
3.2 传代培养的方法传代培养的关键在于及时分离细胞，咱不能让细胞们挤在一起，这样容易“打架”。
通常，当细胞长满培养皿后，就需要把它们分离开。
这个过程又得用到胰酶，跟原代培养一样，轻轻松松把它们从皿里“请”出来。
接下来，咱们需要把细胞分到新的培养皿里，再给它们加上新鲜的培养基，确保它们能继续健康成长。
注意，细胞们需要一点时间适应新环境，就像搬家后要习惯新居的味道一样。
原代和传代细胞的培养和维持
原代和传代细胞的培养和维持一、原代细胞的培养与维持1、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)凡经消化液处理实体组织来源的细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性，细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L，培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养，小牛血清浓度为10%～80%．在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。
贴壁细胞长成网状或基本单层时，由于营养缺乏，代谢产物增多，pH变酸，不适宜细胞生长，此时细胞还未长成单层，未达到饱和密度，仍需继续培养，因此，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。
其换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。
2、悬浮细胞的培养凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞．若要将淋巴细胞及白血病细胞进行长期培养，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长，待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变酸，说明细胞生长繁殖良好，一般每隔3天需半量换液一次（换液时尽量使细胞不丢失），待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH发生明显变化时，此时可考虑传代。
悬浮细胞在未达到饱和密度时，但培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求时，只能采用半量换液的方式．二、原代细胞培养的首次传代 (Subculture)这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。
每进行一次分离再培养称之为传一代，传至5～10代以内的细胞通常称为次代培养细胞，传至10~20代以上的细胞，通常确定为传代细胞（或称传代细胞系）。
传代细胞系的建立，关键是初代培养的首次传代。
应注意如下几点：(1)细胞生长密度不高时，或未能达到覆盖整个瓶底时不能急于传代。
(2)原代培养的贴壁细胞多为混杂细胞，形态各异，往往是上皮样细胞和成纤维样细胞并存，采用胰蛋白酶消化时要掌握好消化时间，因成纤维细胞易于脱壁，上皮细胞不易脱壁，因此，可根据需要选用适当的消化时间及时中止消化。
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（二）悬液细胞的传代培养
（1）取生长良好的细胞，在超净工作台用无菌吸管
把培养瓶中的细胞吹打均匀。 （2）转移到无菌的离心管中，盖紧胶盖，平衡后离 心（1 000r/min）5min。 （3）在超净工作台中吸去上清液，加入适量新培养 液，用吸管吹打细胞，制成悬液。 （4）以1：2或1：3进行分装，并在培养瓶上做好标 记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37 ℃ CO2培
细胞培养用的玻璃器材
培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒 和铁筒中，干热或湿热灭菌后备用
手术器材、瓶塞等
15磅，121℃，20分钟蒸气灭菌 DMEM培养液、消化液、PBS液等 用滤器过滤后备用
方法与步骤（举例:心肌细胞消化培养法）
（1）动物处死：将出生2～3d乳鼠，用拉颈椎方法 处死。腹部向上钉在蜡盘中，用碘酒和酒精棉球 擦拭腹部消毒。 （2）剪取心脏：在无菌条件下将心脏（心尖）取 出，置于无菌培养皿中，用Hanks液洗涤1-2次去 除血污；放入另一培养皿中，纵向剪开心脏，仔 细去除心腔内血污后剪成1mm3大小的组织块，再 并用Hanks液洗涤2～3次，直到液体澄清。
(2)与临床联系好手术时间后，立即做好如下准备 工作：准备好1-2个贮有培养液和抗生素的标本收 集瓶，将盖盖紧，保持无菌，瓶外贴上标签，写 上工作人员名字、地点和电话号码；将收集瓶送
往医院，并与医生和护士讲清截取手术标本的部
位及注意事项。
(3)标本放入收集瓶后，送出手术间，立即送往 组织培养实验室。工作人员最好是等在手术间外。 但有时手术时间难以掌握。则请护士将收集材料 的瓶子盖好后，放入4℃冰箱，尽快打电话通知 工作人员。 (4)取临床标本时，虽然尽可能做到无菌操作， 但仍有污染可能性的存在。可选用抗生素类控制 污染。如手术标本比较大（约200mg以上），可 将其浸于70%酒精中约30-60秒，这样会减少表面 污染而不损坏内部组织的结构和存活。不要用纱 布包裹标本，纱布纤维易粘附在组织上。
传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或1:3比
率转移，接种到另一培养瓶的培养。
贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消化，
把细胞分散成单细胞再传代。
悬浮型生长细胞则用直接传代法或离心法传代。
方法与步骤
（一）贴壁细胞传代培养
（1）选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精
灯旁，倒去瓶中的旧培养液，加入2～3ml的DHanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在 细胞表面的碎片(思考：还有什么作用？） （2）加入适量0.１％－ 0.25％胰蛋白酶消化液， 室温消化，倒置显微镜下观察，待细胞单层收 缩突起出现空隙时，倒去酶液。
第五章 细胞的原代与传代培养
一、原代培养 概念：取自体内新鲜组织并置于体外条 件下生长的细胞在传代之前称为
原代培养。
原代培养技术的重要意义:
原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性
状尚未发生很大变化，具有二倍体的遗传性，
而且大多数细胞表现出原来组织的特性。
利用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞
（4）计数与稀释：从过滤的细胞悬液中取出1ml滴于 血细胞计数板上，按白细胞法进行计数；计数后用 培养液稀释，稀释后的浓度一般以每毫升含30 ～ 50万个细胞为宜。
（5）分装与培养：将稀释好的细胞悬液分装于细胞 培养瓶中，盖好瓶盖，在培养瓶上做好标记，置于 37℃的CO2培养箱中培养。 （6）观察：逐日检查培养物是否污染，观察细胞生 长情况。待细胞已基本长成致密单层时，即可进行 传代培养。
养箱培养。
（5）观察：细胞培养24h后，即可进行观察。
传代细胞培养结果
一般情况，传代后的细胞在2小时左右
就能附着在培养瓶壁上，2～4天就可
在瓶内形成单层，需要再次进行传代
三、人体活检(或手术)材料
(1) 在准备以临床材料为实验材料时,要预先与
临床外科医生和护士商量,并做好一切必要的准备
工作。争取拿到新鲜、无菌、少坏死的标本。
（3）用Hanks液洗涤1次，加入适量培养液，反复吹
打细胞，使其成细胞悬液。
（4）以1：2或1：3进行分装，并在培养瓶上做好标
记，注明代号、日期，轻轻摇匀， 37 ℃CO2
培养箱培养。
（5）观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜
色及细胞的生长情况。
VSMCs传代培养第1天和第3天（×100）
需要注意的事项：
整个取材过程中，都要注意保持组织的湿润，随 时给组织块滴加一些培养液或平衡盐溶液。一般 情况下，最好是使用冰冷的液体。
在剪碎或切割组织块时，尽量使用锋利的刀剪， 防止以钝器对组织揉、捻、撕、拉等而造成细胞 损伤。 整个取材过程耗时越短越好。在万不得已的情况 下，取材后也可将组织贮存在冷的(4℃)含平衡盐 溶液(或其它缓冲盐溶液)的营养液中，最好不超 过24～48h(视不同组织类型而定)。
分化及病毒学方面的试验效果很好。 原代培养也是建立各种细胞系（株）必须经过 的阶段。
原代培养
消化法
贴块法
冷消化 温消化
一次性消化 分次消化
消化法：这种培养过程主要是采用无菌操作 的方法，把组织（或器官）从动物体内取出， 经酶消化处理，使分散成单个细胞，然后在人 工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。
原代细胞培养结果:
细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并
开始生长 如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可 形成单层
细胞原代贴块培养法
贴块培养步骤图解
VSMCs原代培养第4天和第9天（×100）
二、传代细胞培养
细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一 段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中， 细胞倍增3～6次 离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细 胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不 及时分离传代培养，细胞将逐渐衰老死亡。
原 代 培 养 方 法 分 类
贴块法
消化法
93
分次消化
消化法的分类
解离释放细胞的方法
最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞 法以及螯合剂解离细胞法。
用酶学解离细胞法解离细胞是体外培养动物 细胞时分散组织的基本方法，最常用的消化 酶是胰蛋白酶和胶原酶两种。
动物细胞原代培 养流程的示意图
器材和液体的准备
（3）消化及分散组织块：将上述清洗过的组织放入无 菌三角烧瓶内，加入5～6倍量的0.1％胰蛋白酶液 （pH7.4 ～ 7.6），置37℃恒温磁力搅拌器上分次 消化：每次消化8-10分钟。在超净台块基本消化完全。 各管配平后离心，收集细胞，无血清培养液洗 2-3次后，将细胞悬液用两层灭菌纱布过滤至另一 烧杯中。