提高真菌植酸酶热稳定性的方法
甲醇酵母植酸酶的热稳定性
甲醇酵母植酸酶的热稳定性摘要:对甲醇酵母发酵生产的植酸酶性质和热稳定性进行了研究。
实验结果显示该酶活的最佳pH值为pH 5.5,酶液的活性稳定区间为pH 5.0-6.0,当酶液中添加10 mmolCaCl2时,能明显提高植酸酶的热稳定性,在80e保温15 min,其保留酶活可达到原酶液的77.8%。
植酸酶液经过多羟基化合物颗粒化处理后,其酶制剂的高温热稳定性比液体酶或普通固体化处理的植酸酶制剂提高50%。
关键词:植酸酶;热稳定性;饲料添加剂;颗粒化;多羟基化合物植酸酶(E.C. 3.1.3.8 phytase)是磷酸酶的一种特殊类型,能够催化植酸(phytate)水解,放出5-6个磷酸基团[1],终产物为肌醇(inositol)或肌醇磷酸盐。
由于植酸酶蛋白氨基酸顺序中含有Arg-His-Gly模体结构,因此属于组氨酸磷酯酶一类[2]。
植酸酶广泛存在于微生物、植物或动物组织中[3],但它的作用在不同的组织中各不相同。
在植物中,植酸酶主要为种子萌发提供磷以及为植物提供非常重要的生长因子-肌醇[4],此外,植酸盐被水解还能够释放出钾、钙、镁和锌等植物生长所必需的微量元素,肌醇磷酸酯在物质进入细胞的运输系统中也发挥着重要作用,如3-磷酸肌醇在植物运输系统中作为次级信号传递体起信号转导作用[5]。
在微生物细胞中,植酸酶能够对磷的缺乏作出反应,以便及时从周围环境植酸中获得磷供细胞使用。
植酸酶在动物细胞中的作用现在还比较模糊,但已知有一个类似于植酸酶的酶(MIPP),它能够调整植酸和1,3,4,5,6-五磷酸肌醇的分子活力[6]。
由于能够水解植酸,解除植酸对营养物质的螯合作用,有效提高食品和饲料的营养价值,同时能够替代饲料中无机磷添加,降低生产成本,减少环境的磷污染,植酸酶已成为一种重要的饲用酶制剂。
饲料在加工过程中,一般都要进行颗粒化,以杀灭饲料中的沙门氏菌,改善饲料成分的结构,便于饲料储运,增加禽畜的采食量和营养吸收效率。
一种提高植酸酶活性的方法[发明专利]
![一种提高植酸酶活性的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/6fe686fdff00bed5b8f31d21.png)
专利名称：一种提高植酸酶活性的方法
专利类型：发明专利
发明人：阮晖,陈美龄,马风兰,陈赟,廖文艳,徐娟,王睿之,周陈伟,何国庆
申请号：CN201010171789.9
申请日：20100514
公开号：CN102242086A
公开日：
20111116
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明的一种提高植酸酶活性的方法，包括以下步骤：将植酸酶基因(Genbank号：
AB508806)连接在酿酒酵母细胞壁成份α凝集素序列(Genbank号：M28164)的N端，然后插入酿酒酵母表达载体GAL1启动子(Genbank号：AY428072)下游MFα1信号肽序列(Genbank号：
M17301)的C端，构建成表达框，表达框从N端到C端：GAL1启动子+MFα1信号肽序列+植酸酶基因+α凝集素序列；将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞。
本发明的优点：将植酸酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面，实现酶与细胞外底物的完全接触，从而显著提高植酸酶活性。
申请人：浙江大学
地址：310012 浙江省杭州市西湖区浙大路38号
国籍：CN
代理机构：杭州中成专利事务所有限公司
代理人：金祺
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制剂学技术提高植酸酶热稳定性的研究进展
料中，在制粒温度为 75 ℃时，这 2 种植酸酶在颗粒 饲料中的活性回收率是相 似 的; 但 在 制 粒温度为 85 ℃时，来自黑曲霉的植酸酶活性比来自烟曲霉的 植酸酶活性要丧失得更多。 1.2 制粒过程
制粒过程中的高温、高湿和挤压是造成植酸酶 活性损失的关键因素：1) 高温引起酶蛋白分子中氢 键和疏水键断裂，从而改变酶分子的构象，使酶失 活。 生物酶制剂热稳定性差，易失活，在常温条件下 长期存放的干燥酶粉也易失活。 颗粒温度达到 84 或 87 ℃ 时 ， 则 酶 的 活 性 丧 失 17 % 或 54 % ；2)R P Igamnazarov 等（1999）指出，植酸酶去折叠温度与水 分活度相关。 完全干燥的植酸酶 去 折 叠 温 度 为 165 ℃；含 12 %的水分时去折叠温度迅速降为95 ℃； 含 16 %的水分时去折叠温度降为 88 ～ 90 ℃。 在制 粒时，湿与热同时起作用。 相比干热，湿热更具穿透 性，更能够穿透到植酸酶内部，破坏酶的三维结构； 3) 高压能改变酶蛋白的空间多维结构而导致酶变 性。
2 制剂学技术提高植酸酶热稳定的方法
提高植酸酶热稳定性常用的方法有以下几种: 1)自 然 选 择 法 ：即 筛 选 耐 高 温 菌 种 释 放 的 植 酸 酶 ；2) 固定化包埋：将酶固定在不溶性载体上，从而稳定 酶构象，消除逆性因子的变形作用，从而提高植酸 酶稳定性；3)蛋白质工程法：即通过基因工程重组得 到 耐 高 温 酶 的 基 因 ，再 表 达 获 得 热 稳 定 性 植 酸 酶 ；4) 化学修饰法: 通过化学试剂特异性修饰酶活性中心 的某个或某类氨基酸， 从而稳定蛋白质的构象，提 高其耐热性；5)制剂学方法：通过向植酸酶溶液添加 稳定剂、将植酸酶与载体结合制成普通颗粒、将植 酸酶颗粒进行液体后喷涂和包被等制剂学技术来 提高植酸酶的热稳定性。 2.1 添加稳定剂
耐高温植酸酶生产技术研究进展
耐高温植酸酶生产技术研究进展李富伟汤海鸥汪勇李富伟，中国农业科学院饲料研究所，１０００８１，北京市海淀区中关村南大街１２号。
汤海鸥、汪勇，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：２００８－０７－０７植酸酶应用大多以干粉粒的形式在饲料加工调质和制粒之前添加，而酶活性在制粒的过程中损失较大。
通常酶在干燥的情况下，结构比较稳定，具有一定的耐热性，但在制粒过程中，在高温蒸汽的作用下，酶就易变性失活。
近年来，在颗粒饲料制造过程中，植酸酶添加采取外喷的方法进行，但外喷方法存在添加不均匀的不足，故提高植酸酶的耐热性，采取内添加还是具有重要的应用价值。
在提高植酸酶耐热性方面的研究目前已经得到长足的发展，从用固相载体稳定化处理发展到应用稳定剂结合包衣加工工艺，从基础的菌种筛选到应用分子生物学诱变，这些技术很大程度上消除了逆性因子对饲用酶的破坏作用，使植酸酶能在畜禽体内保持较高活力并发挥生物水解作用。
在此，本文就提高植酸酶耐高温性能的几种技术做一综述，以便为植酸酶能在高温制粒的情况下得到更好的应用提供参考。
１产耐热植酸酶菌种选育酶作为生物催化剂具有许多特性。
但是，天然酶作为自然选择的产物，也具有局限性，因为最佳的酶不仅仅是指通过催化使反应速度达到最快，还应该包括酶的稳定性、专一性等。
虽然目前饲用植酸酶的种类很多，但很多仍无法满足人们对酶耐高温的需要。
人们想尽办法寻找能耐高温的植酸酶，这其中最传统的方法便是从环境中分离纯化新酶。
香港大学的ＴｙｅＡＪ等（２００２）从Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８和Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ中发现两种新型热稳定性的植酸酶，即使在Ｃａ２＋浓度很低、ｐＨ值中性的条件下，９５℃保温１０ｍｉｎ后仍能保持８０％的初始酶活。
ＣａｓｅｙＡ等从Ａ．ｎｉｇｅｒＡＴＣＣ９１４２分离得到的植酸酶在８０℃比两种商品化植酸酶有更高的热稳定性，这种植酸酶酶活能被Ｃａ２＋所抑制。
以上这些植酸酶尽管在ｐＨ值或者其它方面还不适合于商品化生产，但是已经具备了很高的热稳定性。
提高植酸酶热稳定性的技术途径及产品评测方法
提高植酸酶热稳定性的技术途径及产品评测方法制粒是常用的饲料加工工艺，通过制粒改善饲料适口性，提高饲料利用率，保证动物均衡采食营养素和提高生长速度，同时在压制过程中实现高温杀菌。
在制粒过程中，通常会通入一定压力的蒸汽，从而使粉料在进入环模制粒前达到较高的温度，即调质过程。
粉料温度的测定点一般紧靠在调质器的出口处，这里测定的温度也就是通常所说的制粒温度，理想的制粒温度范围在80-90℃。
而实际使用的蒸汽温度则远高于此，湿蒸汽、饱和蒸汽和过热蒸汽的温度分别可以达到100、140和160℃，同时粉料通过制粒机环模后温度也会因摩擦力而增加。
此外，蒸汽调质时的高湿环境增强了热能的传递。
这些都对饲料中的热敏性因子，如植酸酶产生极大的破坏。
制粒对植酸酶的破坏源于高温对其空间结构的破坏，目前饲料上应用的植酸酶大部分属于酸性磷酸酶家族，其空间上包含两个结构域，因植酸酶的菌种来源不同，其包含的α、β结构数量不一，如无花果曲霉植酸酶的结构是由一个较大的α、β结构域和一个小的α结构域组成，α、β结构域是由5个α螺旋和8个β折叠构成，α结构域是由4个α螺旋组成。
而大肠杆菌植酸酶的两个结构域一个是由5个α螺旋和2个β折叠组成，另一个是由6个α螺旋和9个β折叠组成。
植酸酶活性部位的氨基酸序列具有高度保守性，其间的氨基酸被修饰或突变后都会导致酶活性的丧失，但高温的影响则在于去折叠效应。
植酸酶目前已通过基因工程微生物发酵实现了大规模廉价生产，而今，生物工程技术也为解决植酸酶的热稳定性提供了很好的途径。
同时研究发现，一些分子能通过化学修饰有效提高植酸酶的热稳定性。
此外，新型包被技术和包被材料的应用进一步提高了植酸酶热稳定性。
1、生物工程技术设计制造耐热植酸酶菌株自然界产生植酸酶的微生物多种多样，每种植酸酶的性质各不相同，自然界中存在的烟曲霉、淀粉液化芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等中分离到的植酸酶都能耐受高温，但都在37℃时酶活性极低，缺乏饲用价值（见表1）。
饲用植酸酶热稳定性的研究
饲用植酸酶热稳定性的研究
赵海霞;王红宁;陈惠
【期刊名称】《微生物学通报》
【年(卷),期】2004(31)1
【摘要】植酸酶是一种能将植物性饲料中植酸(盐)降解为肌醇和无机磷酸盐的酶类.其作为单胃动物的饲料添加剂,对提高畜禽业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义.针对目前饲用植酸酶存在的热稳定性不高的问题,介绍了国内外近年来的研究进展,并提出了解决的方法.
【总页数】5页(P105-109)
【作者】赵海霞;王红宁;陈惠
【作者单位】四川农业大学动物科技学院,雅安,625014;四川农业大学动物科技学院,雅安,625014;四川农业大学生命理学院,雅安,625014
【正文语种】中文
【中图分类】Q946.5
【相关文献】
1.大肠杆菌K12植酸酶热稳定性突变体在毕赤酵母中的高效表达和性质研究 [J], 周玉玲;邹由;付玲;江维;战飞翔;康立新;马向东;马立新
2.植酸酶包埋后酶活和热稳定性的变化规律研究 [J], 尹清强;张书锋;冯华;左瑞雨;郑秋红;程伟
3.海藻糖对植酸酶热稳定性的影响研究 [J], 李融;苏琰
4.从后处理工艺提高植酸酶热稳定性的研究进展 [J], 刘梅英;彭健;刘敏跃;高雁
5.制剂学技术提高植酸酶热稳定性的研究进展 [J], 张萍;王成润;邹积宏;金一因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
南昌大学科技成果——植酸酶热稳定性研究及其高温剂型开发
南昌大学科技成果——植酸酶热稳定性研究及其高
温剂型开发
技术原理
颗粒高温植酸酶制剂是一种新型的饲料添加剂，具有催化植酸及植酸盐水解成肌醇或磷酸盐，提高饲料中有机磷的利用率，减少环境的磷污染和解除植酸的抗营养作用等功能，是一种高效环保型生物饲料添加剂。
技术原理主要通过强化酶和载体的多点结合，使酶蛋白的构象更加稳定。
应用天然的多羟基化合物颗粒化材料还原末端含有许多的游离羟基，结合酶蛋白分子侧链氨基酸残基中的自由氨基提高酶结构的刚性和热稳定性。
产品技术性能指标达到颗粒酶90℃下30min，酶失活率为8%-13%；产品90%为球型颗粒，酶活2000-2500IU/g；常温保存一年酶的失活率≤10%。
技术特点
该成果应用生物酶活性结构的保护和微环境控制技术，有效提高植酸酶制剂的高温稳定性、添加流散性和保存稳定性；高温稳定性优于国外同类产品公开标准。
颗粒高温植酸酶制剂主要用于猪禽饲料和水产饵料。
植酸酶其最大的经济价值在于可减少饲料中磷酸氢钙等，无机磷的使用量在80%以上，向环境排泄的磷相应减少50%以上，可使氮污染排泄量降低10%。
市场预测
根据目前国际上植酸酶产品的一般价格折算，按年产600吨新型
高温植酸酶饲料添加剂的生产规模，其经济指标初步估算为：产品市场价：200元/kg（2000-2500IU）产值：200元/kg×1000kg×600=12000万元；总成本：80元/kg×1000kg×600=4800万元；利税：12000万元-4800万元=7200万元。
合作方式技术转让。
改善植酸酶热稳定性的策略.
来源最适温度(℃热稳定性参考文献无花果曲霉58最高可以耐受65℃的高温Ullah 等(1998烟曲霉70100℃下加热20min 后,酶活仅损失10%Pasamontes 等(1997米曲霉5665℃时酶活损失80%张玉帧等(1997淀粉液化芽孢杆菌6090℃处理10min 后酶活可保留50%Kim 等(1998地衣芽孢杆菌6595℃处理15min 后酶活可保留61%Tye 等(2002枯草芽孢杆菌5560℃处理1h ,活性减少90%Kerovuo 等(1998番茄4560℃以下,活性很快损失李明刚等(1998植酸酶作为一种生物型饲料添加剂,对提高饲料中磷的利用率、动物的生产性能以及减轻因动物高磷粪便所导致的环境水污染具有重要意义。
目前,通过基因工程微生物发酵来大规模廉价生产饲用植酸酶制剂已经基本得到实现,但是植酸酶制剂应用上的另一个关键性问题,即酶的热稳定性始终没有得到很好解决。
饲料加工需经过制粒工艺,在制粒过程中有一个短暂的高温过程,温度一般为75~93℃,一般的植酸酶活性在此高温下大幅度地不可逆丧失,所以能在饲料中真正得到推广利用的植酸酶必须具有良好的热稳定性。
但另一方面,饲料用酶又必须在常温下具有较高的酶活性,因为其最终的作用场所是在动物正常体温(37℃左右的胃肠道中,这与工业上所用的一些高温酶不同。
这一矛盾是目前包括植酸酶在内的所有饲用酶制剂均需要迫切解决的问题。
1自然选择法从嗜温微生物嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila (Mitchell 等,1997、土曲霉(As-pergillus terreus (Mitchell 等,1997、淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens (Oh 等,2001、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis (Tye 等,2002中分离到的高温植酸酶其最适温度在70~80℃,虽然具有很好的耐热性,但它在37℃下的酶活性极低,在饲料中没有应用价值;相反,来源于黑曲霉(A.niger 等的植酸酶在37℃下具有较高酶活性,但它不能经受制粒时的高温(Ul-lah ,1998。
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的 方 法
宋会仪： 浙江大学动物科学学院。
通 过 构 建 基 因 工 程 菌 不 仅 可 以 提 高 真 菌 植
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科技 视 伽 ７ｈｌ ｔ Ｓ ｉ 野 ｃ。 ｕ ｃ ｄ ｎ。 Ｏ
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植 酸 ． 称 肌 醇 六 磷 酸 ， 植 物 籽 实 中磷 的 又 是 主要 贮存 形 式 ， 是 一种 抗 营养 凶子 ， 胃动 物 也 单
ｓ ． ： 括 黑 曲霉 （ 花 果 曲霉 ） ｎ ｅ （ Ｍ ｍ） ｐ） 包 无 Ａ．ｉ ｒ肛 “ 、 ｇ 炯 曲霉 （ ｆ ｍ ｇｔｓ 、 曲霉 （ ． ｒ ｕ ） 米 曲霉 Ａ． ｉａｕ ） 土 ｕ Ａｔ ｒ ｓ 、 ｅｅ （ ｏｙａ ） ； Ａ． ｚｅ 等 根霉 属 （ ｈｚｐ ｓｓ．包括 Ｒ ｉ ｐ ｓ ｒ Ｒ ｉ ｕ ） ｏ ｐ ｈｚ ｕ ｏ
了耐 热 性 真 菌 Ｔ ｅｍ ｍ ｃｓｌ ｕ ｉｏｕ ｈｒ ｏ ｙ ｅ ａ ｇ ｓ ｓ的植 酸 ｎ ｎ 酶基 并 表达 ， 化 子产 生 的酶 活 高 ＿ 对 照菌 株 转 ｒ ｌ（ 倍 ． ５） 热稳 定性 也有 一定 提高 。 ２２ 真 菌植 酸 酶 的蛋 白质工程 ． 通 过 重 组 摹 冈 工 程 菌 构 建 得 到 的耐 热 植 酸 酶在 ３ 的酶 活往 往较 低 ， 不能 很 大 程度地 提 ７ 也
酶是 胞外酶 ，容 易分离 提 纯 ，而且 ｐ 作用 范 同 Ｈ 广、 活性 高 ． 饲用 植 酸酶 的 最佳 来 源 ， 是 已经 实现
７ｏ处理 残 余 酶 活仍 能 达 到 ８ ％） ０（ ＝ ０ ，多 数真 菌 植
酸酶 热稳 定性 不高 。
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大 学饲 料 科 学研 究所 教 育 部 动 物 分 子
危科广函 ２０￣ ６ Ｉ １ ０６ 期
艘 酶 出发菌 株 产 酶量 ， 能使 热 稳 定性 有 一定 的 还
同 序概念 指对 一组 同源 蛋 白质 的氨 基酸序 列
增 强 。如从 自然界 中分 离耐高 温产 真菌 植酸酶 的 菌 株 ， 隆 该嗜热 酶基 因 ， 常 温菌 中表达 ， 达 克 在 表 …的真菌植酸 酶仍 能保 留耐 热性 。Ｒ ｎ ｙ 克隆 ａｄ 等
进行 比较 ．以一定 的标准程 序计 算 出各 氨基酸 序
低 。植 酸酶 是催 化 植 酸及 植 酸盐水 解 成磷 酸 （ 或 磷酸 盐 ） 肌醇 的一类 酶 的 总称 。近 年 来 国 内外 与
大量 的饲 养 试 验 、 谢 试验 都 已 订 明 ， 饲 料 中 代 Ｅ 在 添加 植 酸酶 能 够提 高 饲料 中磷 的利 用率 ， 少 粪 减
ｌ ｓ ；木霉 属 （ｒ ｏ ｅｍａ 等 。表 ｌ列 举 了部 分 ａ ） ｎ Ｔｉ ｄ ｒ ） ｈ
磷 对 环境 的污染 有着重 要 意 义。真菌来 源 的植酸
从 表 ｌ 以看 出 ， 数真 菌 植 酸 酶 的最 适 温 可 多 度在 ４～０ ０ ７ ℃之 间 。 除 少 数 几种 以外 （ Ｔ ｅ． 如 ｈｒ Ｉ ａｃ ｓａ ｒｎｉ ｕ ｌ ｓｕ ｕａ ｔ ｃ ｓ植 酸 酶 ，其 最 适 温 度 ５ ℃ ， ｌ ｏ ａ ５
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例科广萄２０年第６ ０６ 期
３ ３
科技视野
Ｓｉ ｄｅｎｏ ｔ ｃ ｅ 。ｙｕ Ｔｈｌ Ｏ ｇ
提 高真菌植酸酶热稳 定性 的方法
胡舂 霞 宋会 仪
摘 要 ： 酸 酶 ｆｈ ｔ ｅ 能 提 高 饲料 巾磷 及 其 他 养 分 植 Ｐ ｙａ ） ｓ 的利 Ｊ 率 ．减 少 粪 便 巾磷 的排 泄 量 ，同 时 还 能 降 低 槽 酸 ｛ ｊ （ ） 盐 的抗 营 养 作 州 ， 饲 料 【添 加 植 酸酶 对 提 高 备 禽生 产 在 ｆ ｌ 性 能及 减 轻 环境 污染 有着 重 要 意 义 。 真菌 植 酸 酶 具 有 Ｉ ， Ｈ 作用范嗣广 、 活性 高 和 易 提 纯 等 优 点 。 生 产 植 酸 酶 的 最 是 佳 来源 。但 是 真 菌植 酸 酶热 稳 定 性 普 遍 较 低 ， 能 完 全 满 不 足 饲料 加 工 的要 求 。 文 综 述 了在 提 高 真菌 植酸 酶 热 稳 定 本 性研 究 方 面 的最 新 进 展 ． 论 ｒ其 进一 步 的研 究 方 向 ． 讨 ． 关 键 词 ： 菌 ； 酸 酶 ； 稳 定性 真 植 热
了工业 化 生产 ． 是 在其 推广 应用 中还 存 在一 些 但
问题 ， 出表 现在 酶的 热稳定 性 上。冈此 ， 突 为使 真
菌 植 酸酶 在饲 料 中得 到 广 泛 的应用 ， 用各 种 方 采
法 包 括 基 因 工 程 技 术 提 高 真 菌 植 酸 酶 的 热 稳 定
性， 已成 为 当前植 酸酶 研究 的热 点 。 １ 植酸 酶 的真菌 来源 及热 稳定 性状 况 产 生 植 酸 酶 的徽 乍 物 有 细 菌 、酵 母 和 真 菌 等 。 生植酸 酶 的真菌 主要 有 曲霉 属 （ ｓ ｅ ｆ 产 Ａ ｐ ｆ
ｏ ｇｓ ｏｕ ；青霉 属 （ｅ ｉ ｌｕ ． ｌ ｏｐ ｒｓ ｉ Ｐ ｎｃ ｌ ｍ ｓ ）包 括 青 霉 ｉｉ ｐ （ ｅ ｉ ｌｕ ７ 等 ； 孢 壳 属 （ ｍ ｒ ｅｌ ｎｄ — Ｐ ｎｃ ｌ ｍ ｐ ） ｉｉ 裸 Ｅ ｅｉ ｌ ｉｕ ｃ ａ
消化 道 中 由 于缺 乏 植 酸 分 解 酶 ，使 利 用 率非 常
真 菌来 源 的植酸 酶 的热稳定 性 。
表 １ 真 菌 来 源 的 植 酸 酶 的 热 稳定 性
来 源 最适 温 度／ 热稳 定性 参考 义 献
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
便 中 磷 的排 泄量 ， 同时还 能 降低 植 酸 （ ） 盐 的抗 营 养作用 ． 对提 高 畜禽 生 产效 益及 降 低 畜禽 粪便 中